Một số phản ứng sinh hóa định danh vi sinh vật

Một số phản ứng sinh hóa định danh vi sinh vật

MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH VI SINH VẬT

1 Thử nghiệm khả năng chuyển hóa citrate

Nguyên tắc: Xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat là nguồn

hydratcarbon duy nhất Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và thay đổi màu của chỉ thị màu

– Cấy vi khuẩn vào môi trường Citrat Simmons, ủ 35 – 37oC/24 h– Phản ứng dương tính: màu xanh nước biển

– Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu

• E coli

• Enterobacter aerogenes

• Dương tính: môi trường đổi màu xanh lá cây sang xanh nước biển

• Âm tính: không đổi màu

2 Thử nghiệm Catalase

Nguyên tắc: Phát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo

phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý

- Lấy một ít vi khuẩn vào que cấy và nhúng vào giọt H2O2

Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện Phản ứng âm tính (-): không có bọt khí xuất hiện

- Không nên sử dụng vi khuẩn cấy trên thạch máu vì dễ dương tính giả

3 Thử nghiệm Oxydase

Nguyên tắc: Phát hiện khả năng sinh enzym cytochrome c oxidase của

vi khuẩn

- Pseudomonas aeruginosa , Neisseria gonorrhoeae và

Campylobacter jejuni là những vi khuẩn gây bệnh có Oxydase (+)

- Lấy một ít chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần bôi lên một tờ giấy lọc Nhỏthuốc thử(N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine

dihydrochloride)

- Phản ứng dương tính: có màu tím Đọc kết quả trong vòng 10 giây đầu

• Phản ứng Oxydase sử dụng thuốc thử

(N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride)

• Phản ứng dương tính: có màu tím

• Phản ứng xuất hiện trong vòng 10 giây đầu

4 Thử nghiệm phân giải Ure

Nguyên tắc: phát hiện enzym urease phân giải urea thành ammonia vàcarbondioxide Ammonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường

– Là phản ứng đặc trưng cho các loài Proteus

– Cấy vi khuẩn vào canh thang Ure Ủ 37oC/24 – 48 h

– Phản ứng dương tính: môi trường có màu tím đỏ Phản ứng âm tính: không chuyển màu

• Dương tính: môi trường chuyển thành màu tím

• Âm tính: không màu

5 Thử nghiệm Coagulase (đông huyết tương)

Nguyên tắc: Phát hiện sự có mặt của men Coagulase bằng phản ứng

đông huyết tương thỏ

– Là phản ứng phân biệt tụ cầu gây bệnh và không gây bệnh

– Cho vào ống nghiệm 0,5 ml huyết tương thỏ và 0,5 ml dịch cấy vikhuẩn Ủ ấm 37oC/4-24h

– Phản ứng dương tính: xuất hiện khối đông tụ Nếu sau 24h không thấy xuất hiện khối đông tụ: phản ứng âm tính

Dương tính: hình thành khối đông huyết tương

6 Thử nghiệm sinh Idol

Nguyên tắc: phát hiện các vi sinh vật có enzym tryptophanase chuyển

hóa trypton tạo thành indol

- Cấy vi khuẩn vào nước trypton, ủ 37oC/24 h

- Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs, phản ứng dương tính: có vòng màu

đỏ cánh sen nổi lên trên (do Indol kết hợp với p-dimethylaminobenzal

dehyde trong thuốc thử Kovacs), nếu không có màu hoặc màu vàng: phản ứng âm tính

- Với các chủng sinh Indol chậm: thử sau 48 h

– Dương tính: màu đỏ cánh sen

- VK có phản ứng MR âm tính: pH môi trường tăng dần (các sản phẩm có tính acid tạo thành lại chuyển hóa tạo thành các sản phẩm trung tính)

- Cấy vi khuẩn vào canh thang MR-VP Ủ 37oC từ 2-5 ngày

- Nhỏ vài giọt đỏ methyl 0,02%, đọc kết quả ngay Phản ứng (+) có

màu đỏ, âm tính màu vàng

8 Thử nghiệm VP

Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzym chuyển hóa 2,3

butanediol thành acetoin khi có ô xy và chuyển hóa tiếp acetoin thành

diacetyl

– Diacetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo phức diacetyl – guanidin có màu đỏ

– Cấy vi khuẩn vào môi trường MR – VP Ủ 37oC/24 – 48 h

– Nhỏ 6 giọt thuốc thử A (5% α naphtol) và 2 giọt thuốc thử

B( KOH 40%) Lắc nhẹ– Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4 h

– Phản ứng (+): có màu đỏ trên mặt môi trường

9 Thử nghiệm lên men đường

Nguyên tắc:Vi khuẩn có khả năng lên men đường sẽ làm giảm pH dẫn

đến thay đổi màu của môi trường

- Định lượng các vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose sinh hơi

- Cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng chọn lọc có ống Durham Ủ 37oC/

• Phản ứng dương tính: màu vàng, sinh hoặc không sinh hơi

• Phản ứng âm tính: không đổi màu

• Sinh hơi à hình thành bóng hơi trong ống durham

* LÊN MEN ĐƯỜNG, SINH H 2 S (TSI)

• Gồm ba đường: Lactose, succrose, glucose

• Cấy hai bước

- Đầu tiên cấy trên mặt nghiêng

- Thứ hai: cấy đâm sâu vào chân thạch Ủ 37oC/24h

• Nếu chỉ lên men Glucose

- Một lượng nhỏ glucose trong môi trường lên men trong giờ đầu nuôi cấy

- Sau đó, vi khuẩn lấy năng lượng trong quá trình oxy hóa peptone

à phần thạch nghiêng có màu đỏ (hiện tượng kiềm hóa môi trường)

- Peptone ở phần chân thạch không được sử dụng vì không có O2 à phần chân vẫn giữ nguyên màu vàng

* LÊN MEN ĐƯỜNG TRÊN TSI

• Nếu lên men cả glucose, sucrose và/hoặc lactose

- Từ 18 – 24h, toàn bộ phần chân và mặt nghiêng thạch có màu vàng

- Sau 24 h: kiềm hóa môi trường do vi khuẩn sử dụng pepton, môi trường chuyển màu đỏ (chỉ ở phần mặt nghiêng vì pepton chuyển hóa trong điều kiện hiếu khí

- Nếu lên men sinh hơi sẽ thấy các bọt khí hoặc nứt thạch

- Phân giải sodium thiosulfate thành hydrogen sulfide: phần chân thạch có màu đen (H2S +)

10 Thử nghiệm khử nitrat

Nguyên tắc: Phát hiện enzym nitratase xúc tác khử nitrat thành nitrit

và ni tơ phân tử

- Một số vi khuẩn có khả năng khử NO3 thành NO2 và các hợp chất chứa Nitơ khác như amonia (NH3) và khí Nitơ (N2)

NO 3 > NO 2 > NH 3 or N 2

- Nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang nitrat,ủ ở 370 C/24h Sau đó nhỏ

thuốc thử có chứa alpha-napthylamine và sulfanilic acid Hai hợp chất này kết hợp với nitrit để tạo thành HC có màu đỏ (phản ứng dương tính)

* Tuy nhiên, nếu sản phẩm phân giải là amoniac và khí nitơ, ống thử nghiệm sẽ không chuyển màu nhưng vẫn được báo cáo là phản ứng nitrat dương tính Trường hợp này cần tiến hành tiếp bước sau:

- Cho thêm một ít bột kẽm vào ống thử, kẽm sẽ chuyển hóa nitrat thành nitrit và ống thử sẽ có màu đỏ Như vậy, kết luận phản ứng âm tính

- Nếu ống thử không chuyển màu, phản ứng dương tính (vi khuẩn đã chuyển hóa hết nitrat có trong môi trường)

11 Thử nghiệm phân giải hồng cầu (tan máu)

- Một số vi khuẩn có khả năng phân giải hồng cầu có thể quan sát thấytrên thạch máu.Vùng tan máu được hình thành xung quanh khuẩn lạc Có badạng tan máu:

Tan máu (ß): vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc

Tan máu (α): vùng xám xanh xung quanh khuẩn lạc

Tan máu (γ): không có vùng tan máu

– Phản ứng dương tính: Vi khuẩn có thể di động xung quanh

đường cấy, xoắn ốc hoặc làm đục toàn bộ ống thạch

13 Thử nghiệm hóa lỏng gelatin

Nguyên tắc: phát hiện vi khuẩn có men gelatinase phân giải và hóa lỏng

gelatin, quan sát thấy ngay cả khi nhiệt độ thấp hơn 28oC

• Có hai phương pháp xác định sự có mặt của men gelatinase

- Cấy vi khuẩn vào thạch dinh dưỡng gelatin, ủ nhiệt độ phòng trong 14 ngày

• Phương pháp gelatin Strip

- Sử dụng dải màu có phủ gelatin Nếu phản ứng dương tính, có sự thay đổi màu

Một số chủng có khả năng hóa lỏng gelatin chậm nên giữ lại thử nghiệm trong hai tuần

PHẠM VI ÁP DỤNG : Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

THIẾT BỊ - DỤNG CỤ

• Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm

• Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn

• Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1oC

• Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 30 ±1oC

• Tủ sấy khô

• Nồi hấp áp lực

• Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml

• Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn

• pH met hoặc giấy đo pH

HÓA CHẤT – MÔI TRƯỜNG

• Thạch dùng cho Vi sinh vật

• Pepton dùng cho Vi sinh vật

• Muối tinh khiết (NaCl)

• Glucoza tinh khiết

• Natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4)

• Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4)

• Axit lactic dung dịch 20% hoặc 40%

• Axit xitric dung dịch 20%

• Dung dịch NaOH 0,1N

CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ

• Chuẩn bị môi trường

- Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chếtheo công thức Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm

và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút)

• Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử

- Chuẩn bị mẫu

Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất

• Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

- Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩmlỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml nước pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

• Pha loãng mẫu

- Chọn môi trường pha loãng: Sử dụng nước pepton hoặc nước đệm pepton nếu chỉ cần tính tổng số bào tử nấm men

- Sử dụng nước thạch hoặc nước pepton có thạch, nếu cần tính tổng số cả nấm men và nấm mốc hoặc chỉ có nấm mốc

- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2 Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo Pha loãng mẫu cho đến khi có đậm độ pha loãng cần thiết đếm được số khóm nấm trên đĩa theo

- Rót vào từng đĩa 12-15 ml môi trường thạch, trộn đều dung dịch mẫu với môi ttrường bằng cách lắc nhẹ sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần

- Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang

- Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút

• Ủ ấm:

- Khi thạch đã đông, để các đĩa nuôi cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 28±1oC hoặc

khi nhiệt độ phòng tương ứng trong 5 -7 ngày Không lật ngược đĩa

- Sau 3 ngày, đếm kết quả sơ bộ, đếm tổng số các khóm nấm men và nấm mốc mọc trên các đĩa (chú ý nhẹ tay, không di chuyển mạnh hay lật ngược đĩa)

- Sau 5-7 ngày đếm toàn bộ số nấm đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức

• Đọc kết quả

- Chọn tất cả các đĩa có số khóm nấm men từ 15 - 150, số khóm nấm mốc từ5-50 của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả

- Sự phân bố các khóm nấm trên các đĩa petri phải hợp lý Độ pha loãng càng cao thì số khóm nấm càng ít Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy

TÍNH KẾT QUẢ

a Nếu chênh lệch giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, tính số (N)

bào tử cho 1g(ml) sản phẩm bằng cách tính tổng số có khóm nấm đếm dượctrên các đĩa theo công thức sau:

ΣC

N =

(n1+ 0,1.n2) d

- C: Số khóm nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên các đĩa đã chọn

- n1,n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đẫ chọn thứ 1 thứ 2

- d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1

(Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa)

b Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị

pha loãng thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng

c Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha lãng ban đầu

(10-1) có ít hơn 15 khóm nấm men hoặc ít hơn 5 khóm nấm mốc, tính kết quả theo trung bình cộng

d Nếu tất cả các đĩa không có khóm nấm nào mọc, đánh giá kết quả như

sau:

- Ít hơn 1 bào tử nấm men, nấm mốc trong 1ml sản phẩm loãng

- Ít hơn 1x1/d bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g sản phẩm khác.d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu 10-1

BÁO CÁO KẾT QUẢ

- Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết quả tính được tổng số BT nấm men–nấm mốc có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm kiểm tra

- Sai lệch của phương pháp :Trong 95% trường hợp, sai lệch của

phương pháp từ 12 đến 37%

TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP

-Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37 ±1oC trong thời gian từ 24- 48 giờ Số lượng vi khuẩn hiếu khi trong 1g hoặc 1ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạc đếm đựơc từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng

PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

THIẾT BỊ DỤNG CỤ

Các thiết bị thông thường của phòng VSV thực phẩm:

• Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm

• Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn

• Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1oC

• Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 37 ±1oC

• Tủ sấy khô

• Nồi hấp áp lực

• Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml

• Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn

• pH met hoặc giấy đo pH

HÓA CHẤT MÔI TRƯỜNG

• Thạch dùng cho vi sinh vật

• Pepton dùng cho vi sinh vật

• Muối tinh khiết (NaCl)

• Natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4)

• Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4)

• Natri hydroxit tinh khiết (NaOH)

• Chuẩn bị môi trường

- Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chếtheo công thức Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm

và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút)

• Chuẩn bị mẫu

- Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện

vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất

• Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

- Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩmlỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

• Pha loãng mẫu

- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, trộn đều để thu được dung dịch mẫu thử 10-2 Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo

• Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy 2 đĩa petri và dùng một pipet đã tiệt khuẩn riêng

• Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri, mỗi đậm độ nuôi cấy vào 2 đĩa petri

• Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ±1oC trong điều kiện vô khuẩn Rót vào từng đĩa 12-15ml môi trường thạch, trộn đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc nhẹ sang phải và sang trái mỗichiều 3 lần

• Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang

• Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút

• Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên

bề mặt

• Để thạch đông, lật ngược đĩa và ủ ấm ở 37 ± 1oC từ 24- 48 giờ

ĐỌC KẾT QUẢ

trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ

số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức

• Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy

• C:Số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn

• n1,n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ hai

• d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất

• Sau đó làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n ( n là số

mũ thích hợp của 10)

VD:

- Ở đậm độ pha loãng 10-2 có 150 và215 khuẩn lạc

- Ở đậm độ pha loãng 10-3 có 16 và 25 khuẩn lạc

150+215+16+25

N = - = 18480 = 1,8 x 104 CFU/g/ml

(2+0,1 x 2) x 10-2

* Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị

pha loãng thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng, VD

- Ở đậm độ pha loãng 10-2có 180 và 250 khuẩn lạc

- Ở đậm độ pha loãng 10-3 có 60 và 75 khuẩn lạc

d n n

C

) 1 , 0 ( 1 2



180 + 250

N = - = 21500

2 x 10-2

Kết quả: 2,0 x102 CFU/1g hoặc 1ml sản phẩm

* Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu

(10-1) có ít hơn 15 khuẩn lạc, tính kết quả theo trung bình cộng các khuẩn lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính cho 1g hay 1ml sản phẩm VD

- Ở đậm độ pha loãng 10-1của sản phẩm đặc có 12 và 8 khuẩn lạc

- Ở đậm độ pha loãng 10-2 có 6 và 7 khuẩn lạc

Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn 10-2 để tính kết quả

12 + 8

N = - = 100

2 x 10-1

Kết quả :1,0 x 102 CFU/1g hoặc 1ml sản phẩm

* Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như

sau:

- Ít hơn 1 vi sinh vật hiếu khí trong 1ml sản phẩm loãng

- Ít hơn 1x1/d vi sinh vật hiếu khí trong 1g sản phẩm khác

d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu (thường là10-1)

BÁO CÁO KẾT QUẢ

• Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết quả tính được số vi khuẩn hiếu khí có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm kiểm tra

• Sai lệch của phương pháp :Trong 95% trường hợp, sai lệch của

phương pháp từ 12 đến 37%

ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS

KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN)Định nghĩa Coliform cổ điển

Coliforms: Lên men lactose sinh acid và gas

- Escherichia coli

- Klebsiella

- Enterobacter

- Citrobacter

Sinh acid và gas do lên men lactose ở 37°C: 95% là coliform

Sinh acid và gas ở 44°C : 90 % là E.coli

Định nghĩa Coliform mới

- Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, lên men lactose sinh acid và gas (24-48h/36±2°C)

- Fecal coliform : có khả năng phát triển và lên men lactose ở 44,5±2°C; bao gồm E.coli, Klebsiella, Enterobacter và Citrobacter (E.coli thủy phân tryptophan tạo thành Indol)

Coliforms được coi là VSV chỉ điểm vệ sinh

Enzyme based methods

• Klebsiel la

Coliforms – Nơi cư trú và phát triển

Khái niệm chung

- Trực khuẩn Gram âm

- Không sinh bào tử

- Kỵ khí không bắt buộc

- Lên men Lactose

Vai trò

- Chỉ điểm sự nhiễm phân

- Đánh giá tình trạng vệ sinh nước và vệ sinh môi trường

Nguyên lý phương pháp

- Định lượng vi sinh vật lên men lactose có sinh khí khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh chọn lọc ở 30°C và phù hợp trong phép thử khẳng định

Phạm vi áp dụng: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

và trong đường ruột động vật

Fecal coliform chỉ phát triển ở đường ruột động vật máu nóng

•E coli chỉ phát triển ở đường

ruột động vật.

- Pipet có vạch đã vô trùng loại xả hết 1 và 10 ml

- Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1°C

- Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml

- Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm

- pH met, chính xác tới 0,1 đơn vị pH ở 25°C

- Ống Durham

Môi trường

- Dung dịch pepton – muối

- Canh thang Tryptose Lauryl sulfat ( Môi trường tăng sinh chọn lọc)

- Canh thang mật lactose lục sáng (Lactose Bile Brilliant Green Broth – môi trường thử khẳng định)

Các bước tiến hành

- Sản phẩm dạng đặc: Cân 10g mẫu thử đã đồng nhất cho vào 90 ml dung

dịch pepton – muối để được đậm độ pha loãng ban đầu (10-1) Từ đó pha loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử nhưng phải ước lượng rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính

- Sản phẩm dạng lỏng: Hút 10ml sản phẩm ban đầu cho vào bình đã có sẵn

90ml nước pepton – muối để được đậm độ pha loãng ban đầu Từ đó pha loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử nhưng phải ước lượng rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính

- Canh thang tăng sinh nồng độ kép:

Dùng pipet vô trùng hút 10 ml mẫu ban đầu (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 10ml đậm độ 10-1 (sản phẩm dạng khác) cho vào một ống canh thang tăng sinh chọn lọc Mỗi mẫu cấy 3 ống

Trộn đều mẫu với môi trường, mỗi ống dùng một pipet riêng Ủ ấm ở 30°C/ 24h ± 2h

- Canh thang tăng sinh nồng độ đơn:

Dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu ban đầu (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 1ml đậm độ pha loãng 10-1 (sản phẩm dạng khác) cho vào một ống canh thang tăng sinh chọn lọc Mỗi đậm độ cấy 3 ống

Tiến hành tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo(nếu có) Trộn đều mẫu với môi trường, mỗi ống dùng một pipet riêng Ủ ấm ở 30°C / 24h ±

2h Nếu sau 24h mà thấy môi trường không đục hoặc không sinh khí thì để tiếp 24h ± 2h nữa và quan sát lại.

Từ mỗi ống canh thang tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn hoặc nồng độ kép

đã nuôi cấy có hiện tượng đục và sinh khí cấy chuyển sang một ống môi trường thử khẳng định, mỗi ống cấy một ăng( một vòng que cấy) Ủ ấm ở 30°C / 24h ± 2h Quan sát lần 1 mà không đục hoặc không sinh khí thì để thêm 24h ± 2h nữa và quan sát lại

Biểu thị kết quả

- Lựa chọn các độ pha loãng

Trường hợp 1: có ít nhất một độ pha loãng cho ba ống dương tính

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

HÌNH THÁI

• Vi khuẩn hình cầu, đường kính 0.8-1.0 μ

• Đứng riêng rẽ, thành đôi, hoặc tụ thành đám như chùm nho

• Tụ cầu thường không có vỏ, không có lông, không di động

• Không sinh nha bào

• Bắt màu Gram dương

• Trên môi trường thạch thường, sau 24 giờ vi khuẩn đã phát triển

mạnh, khuẩn lạc dạng S, trơn, lồi, sáng bóng, bờ đều, có sắc tố vàng nhạt hoặc vàng thẫm Sắc tố có thể thay đổi khác nhau, nhiều chủng màu da cam, những chủng kháng kháng sinh sắc tố thường màu vàng, mọc nhiều trên thạch, đục, trơn, ẩm ướt và trắng, vàng hoặc da cam

• Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc đục, dạng S, thường gây tan máu và có sắc tố vàng

TÍNH CHẤT SVHH

• Lên men sinh acid các đường glucoza, lactoza, maltoza và manitol

• Không lên men sinh axit các đường arabinoza, inositol, raffinoza, rhamnoxa hoặc xyloza

• Không thủy phân Esculin và tinh bột, khử nitrat, thuỷ phân arginin, gluamat và khử nhóm cacboxyl của lysin (có men lysin

• Thường gặp tan máu β bởi các chủng phân lập từ động vật

• Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển là 30-37oC, pH là 7.0-7.5

• Coagulase: làm đông huyết tương người và thỏ Nó là một protein vững bền với nhiệt độ, tính chất kháng nguyên yếu, có thể gây thành huyết cục trong tĩnh mạch, yếu tố để tạo nên nhiễm khuẩn huyết

• Fibrinolysin: đặc trưng cho các chủng gây bệnh ở người Men này làmtan các cục máu, tạo nên sự rời chỗ và hình thành những vật tắc mạch nhỏ tạo ra nhiễm khuẩn di căn

• Desoxyribonuclease: là men có thể thuỷ phân AND, có thể gây ra tổn thương các tổ chức

• Hyaluronidase: gây tan vỡ chất cơ bản của mô liên kết bởi sự thuỷ phân của acid hyaluronic

• Penicillinase: tụ cầu gây bệnh có thể tiết ra men này làm mất tác dụng của Penicillin

ĐỘC TỐ

Độc tố tan máu (hemolysin) có ba loại chính:

- Độc tố tan máu α, gây tan hồng cầu thỏ ở nhiệt độ 37oC độc tố này gây hoại tử da và gây chết, là ngoại độc tố, có tính kháng nguyên cao

• Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính: bệnh thường xảy ra nhanh, trầm trọng với các dấu hiệu nôn mửa dữ dội

NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

• Do độc tố

• Triệu chứng: là nôn mửa, đau quặn bụng, mệt lả và đi ỉa lỏng Những triệu chứng này thường có trong một vài giờ và ít trường hợp kéo nhiều ngày Thường bệnh nhân hồi phục không có biến chứng

• Liều gây bệnh: < 1,0 µg (>100 000CFU/g) Độc tố của tụ cầu rất bền vững với nhiệt độ, không bị phá huỷ khi đun sôi ở 100oC trong 30 phútnên vẫn có thể gây ngộ độc khi các tế bào sinh dưỡng đã bị tiêu diệt trong quá trình chế biến

• Độc tố của tụ cầu rất bền vững với nhiệt độ, không bị phá huỷ khi đun sôi ở 100oC trong 30 phút nên vẫn có thể gây ngộ độc khi các tế bào sinh dưỡng đã bị tiêu diệt trong quá trình chế biến

• Thời gian ủ bệnh: từ 1 -7h, thông thường 3 – 6h

• Thức ăn thích hợp cho tụ cầu phát triển và sinh độc tố: loại có độ ẩm cao

• Những thực phẩm có nguy cơ cao ô nhiễm do tụ cầu là thịt và sản phẩm thịt, gia cầm và trứng, các món xalat, rau trộn, sữa và sản phẩm sữa…

NƠI CƯ TRÚ VÀ NGUỒN LÂY NHIỄM

• Trong đất, nước, các dụng cụ sản xuất, chế biến, cư trú ở người và động vật (nguồn lây nhiễm quan trọng nhất)

• 50% người bình thường mang vi khuẩn này ở trong mũi họng Vì thế đầu móng tay thường nhiễm những vi khuẩn này

• Trong quá trình chế biến, thực phẩm có thể bị ô nhiễm tụ cầu có thể qua tiếp xúc trực tiếp, đặc biệt là khi tay người chế biến có những vết trầy xước hoặc có mụn mủ Nếu những thực phẩm này để hàng giờ ở 6.6oC, tụ cầu sẽ phát triển và sinh độc tố

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS1.Nguyên lý phương pháp

Dựa trên khả năng sinh Lecithinase phân giải Lecithin của

Staphylococcus aureus trên môi trường chọn lọc có bổ sung lòng đỏ trứng và Kali tellurit, nuôi cấy ở 35- 37oC/24 – 48h Số lượng

Staphylococcus aureus trong một ml hoặc một g mẫu kiểm nghiệm được tính bằng số khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc và có phản ứng đông huyết tương dương tính

2 Phạm vi áp dụng: Định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm

và thức ăn chăn nuôi

- Đĩa petri đường kính 90 – 100mm

- Pipet có vạch đã vô trùng loại 1,5,10 ml

- Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1oC

- Máy đếm khuẩn lạc

- Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml

- Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm

- pH met hoặc giấy đo pH

2.Dung dịch pha loãng, môi trường, hoá chất

• Nước đệm pepton

• Môi trường Bair parker

• Dung dịch Kali Tellurit 1%

• Dung dịch sulphamezatin (sulphadimidin, INH) 0,2%

• Dung dịch Natri pyruvat 20%

• Dung dịch lòng đỏ trứng

• Canh thang tim óc ( Brain Heart Infusion)

• Huyết tương thỏ

3.Các bước tiến hành

3.1 Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu:

Sản phẩm dạng lỏng: Hút 10ml mẫu thử cho vào bình 90ml nước đệm pepton(đậm độ 10-1) Từ đậm độ này pha loãng các đậm độ tiếp theo tùy từng mẫu thử

• Sản phẩm dạng khác: caan 10g mẫu thử cho vào 90 ml nước đệm pepton (đậm độ10-1) Từ đó pha loãng các đậm độ tiếp theo tùy từng mẫu thử

• Dùng que cấy gạt thuỷ tinh dàn đều mẫu trên mặt thạch, lưu ý làm càng nhanh càng tốt để mẫu không bị khô

• Để 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó lật ngược đĩa thạch và để vào tủ

Phản ứng ng đông huyết tương

Số lượng S.aureus có phản ứng dương tính với coagulase

đã nhận dạng trên mỗi đĩa

a = - Cc + - Cnc

Ac Anc

• Ac là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua phép thử coagulase

• Anc là số lượng khuẩn lạc không điển hình đã qua phép thử coagulase

• bc số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase

• bnc số lượng khuẩn lạc không điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase

• Cc là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa

• Cnc là tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy trên đĩa

Số lượng S.aureus có phản ứng dương tính với coagulase đã

nhận dạng trên có mặt trong mẫu thử

• V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml

• n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất

• n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai

• d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn(huyền phù ban đầu là một độ pha loãng)

4 Biểu thị kết quả

• Độ pha loãng 10-2

Đĩa 1: 65 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=65

Đĩa 2: 85 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=85

• Độ pha loãng 10-3

Đĩa 1:3 KLĐH, 3KL có coagulase(+), a=3

Đĩa 2: 7 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=7

Làm ấm để hòa tan, bảo quản 0-5oC/vài tháng

• Dung dịch Natri Pyruvat

• Hút lòng đỏ trứng, pha với nước cất VT theo tỷ lệ ¼

• Dùng ngay hoặc để cách thủy ở 45oC/2h rồi để ở 0-5oC/18-24h, lấy phần dung dịch nổi phía trên Bảo quản ở 0-5oC/72h

MÔI TRƯỜNG BAIR-PARKER LÒNG ĐỎ TRỨNG

• Dung dịch Kali Tellurit 1ml

• Dung dịch Natri pyruvat 5ml

• Sinh nội bào tử

• Lên men Glucose sinh hơi

• VP(+)

• Nitrat (+)

ĐỘC LỰC

• Sinh độc tố ruột bền và không bền nhiệt

• Độc tố tan máu (haemolysin

GÂY BỆNH

• Nôn mửa

• Tiêu chảy

• Viêm dạ dày ruột

• Hoại tử sau chấn thương, đặc biệt ở mắt

• Các nhiễm trùng cơ hội khác

• Ngộ độc thực phẩm: thể nôn (do độc tố chịu nhiệt) và thể tiêu chảy (do thức ăn bị nhiễm khuẩn)

• Thời gian ủ bệnh trên 6 giờ, thường từ 10 – 12 giờ

DỊCH TỄ

• Phân bố rộng rãi trong tự nhiên

• Có nhiều trong đất và thực phẩm bị ô nhiễm

• Thực phẩm nguy cơ cao: gạo, các loại ngũ cốc, thịt, rau…

ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS Nguyên lý phương pháp

- Định lượng VSV có khả năng phân giải Lecithin lòng đỏ trứng gà trên MT thạch MYP chọn lọc khi ủ ở 30oC /24h và có phản ứng

VSHH phù hợp trong phép thử khẳng định

Phạm vi áp dụng: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

THIẾT BỊ DỤNG CỤ

• Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm

• Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn

• Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1oC

• Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 37 ±1oC

• Tủ sấy khô

• Nồi hấp áp lực

• Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml

• Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn

• pH met hoặc giấy đo pH

HÓA CHẤT MÔI TRƯỜNG

• Nước đệm pepton

• Thạch Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoặc thạch Cereus Selective Agar (MOSSEL)

• Nhũ tương lòng đỏ trứng, 50%

• Canh thang Phenol Red Glucose

• Môi trường Voges-Proskauer

• Canh thang Nitrate –(Nitrat Broth)

• Thạch dinh dưỡng

• Thạch máu cừu hoặc thỏ

• Môi trường kiểm tra sự di động

• Thuốc thử nitrate (dung dịch A, dung dịch B)

• Thuốc nhuộm Gram

CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ

• Chuẩn bị môi trường

- Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống

nghiệm và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút) Môi trường chọn lọc được bổ sung nhũ tương lòng đỏ trứng theo công thức

• Chuẩn bị mẫu

- Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất

• Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

- Cân chính xác 25g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 225 ml đệm pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

• Pha loãng mẫu

- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, trộn đều để thu được dung dịch mẫu thử 10-2 Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo

• Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy 2 đĩa petri và dùng một pipet đã tiệt khuẩn riêng

• Lấy 0,1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào đĩa thạch chọn lọc

• Dùng que cấy thủy tinh vô trùng trải đều mẫu thử

• Lật ngược đĩa và ủ ở 30 ± 1oC /24 giờ

ĐỌC KẾT QUẢ

• Do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng

polymycin nên trên môi trường MYP khuẩn lạc B.cereus có màu hồng

eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa (có mặt lecithinase)

• Trường hợp sử dụng môi trường MOSSEL, khuẩn lạc B.cereus to,

màu hồng, xung quanh có vòng sáng

• Chọn từ mỗi đĩa 5 khuẩn lạc điển hình cấy sang thạch dinh dưỡng ở

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS (C.WELCHII)

Clostridium perfringens (C.welchii)

- Hoại thư sinh hơi

- Đôi khi dẫn tới tử vong

- Sinh độc tố ruột α- toxin xâm nhập màng tế bào, hình thành các lỗ hổng trên bề mặt và phá hủy chức năng của màng tế bào

- Sinh độc tố β-toxin gây loét hoại tử

* Khả năng gây ngộ độc thực phẩm

- Do typ C sinh α-toxin

- Thời gian ủ bệnh: 8 – 12 giờ

- Triệu chứng: đau quặn bụng, nôn mửa, tiêu chảy, đôi khi có sốt

- Liều gây bệnh: khoảng 10 triệu TB/gam

- Thực phẩm nguy cơ cao: thịt và sản phẩm thịt, thực phẩm chế biến có thời gian bảo quản dài, thực phẩm đông lạnh

* Đặc điểm nuôi cấy

- Trên thạch máu:khuẩn lạc phẳng, lan, dạng R, mờ, mép không đều, tan máu β

- Trên thạch trứng: có vùng phân giải trứng mờ xung quanh khuẩn lạc

- Trên thạch chọn lọc TSC: khuẩn lạc có màu đen, tròn

Clostridium perfringens (C.welchii)- Phương pháp định lượng

* Nguyên lý: C.perfringens là vi khuẩn có màu đen khi nuôi cấy trên

môi trường chọn lọc Tryptose – sunfit – cycloserin trong điều kiện kỵ khí

ở 35 – 37oC/ 20h và có những tính chất sinh hoá đặc trưng trong phép thửkhẳng định, được tính theo số lượng có trong một ml hay một g sản phẩmkiểm nghiệm

- Tủ ấm 25 ±1oC- Đĩa petri đường kính 90 – 100mm

- Pipet có vạch đã vô trùng loại 1,5,10 ml

- Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1oC

- Máy đếm khuẩn lạc

- Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml

- Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm

- pH met hoặc giấy đo pH

* Môi trường nuôi cấy và thuốc thử

- Thạch Tryptose- sulfit-cycloserin (TSC)

- Canh thang Thioglycolat

- Môi trường nitrat di động

- Môi trường gelatin-lactose

- Thuốc thử phát hiện nitrit

* Các bước tiến hành

Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu

-Sản phẩm dạng lỏng: Thường dùng mẫu nguyên cho đậm độ nuôi cấy ban

đầu Hút 25ml mẫu thử cho vào BÌNH 225ml dung dịch đệm pepton để có đậm độ pha loãng 10-1, tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo tuỳ từng mẫu thử

- Sản phẩm dạng khác: Cân 25g mẫu thử đã đồng nhất cho vào bình có

225ml nước đệm pepton Từ đậm độ pha loãng ban đầu này (10-1) pha loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử

Cấy mẫu

- Sản phẩm dạng lỏng: cho vào 2 đĩa petri, mỗi đĩa 1ml mẫu nguyên Tiến

hành tương tự nếu cần có các đậm độ pha loãng tiếp theo, mỗi đậm độ cấy hai đĩa

- Sản phẩm dạng khác: cho vào 2 đĩa petri, mỗi đĩa 1ml đậm độ pha loãng

ban đầu (10-1), tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo, mỗi đậm độ cấy hai đĩa

Rót vào mỗi đĩa 10-15 ml thạch TSC( Đã đun chảy và để nguội tới 450), trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa theo hai chiều trái, phải Để đông tự nhiên, sau đó phủ lên trên bề mặt thạch của mỗi đĩa 10ml thạch màng TSC Để đông Ủ ám trong điều kiện kỵ khí ở 35 – 37oC / 20h ± 2h

độ liền kề lớn hơn 2 thì lấy giá trị trung bình thấp hơn

- Nếu đĩa cấy bị đen hoặc không thể đếm được các khuẩn lạc riêng rẽ thì đếm các đĩa của độ pha loãng cao hơn kế tiếp

Đếm số khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa và chọn ra 5 khuẩn lạc để thử khẳng định sinh hoá

Thử khẳng định sinh hoá

a) Khả năng di động: trên môi trường nitrat di động, nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí, 35-37oC/ 24h Sau đó thử phản ứng chuyển nitrat thành nitrit:

- Nhỏ 0,2-0,5 ml thuốc thử phát hiện nitrit lên môi trường nitrat di động / 15phút Nếu sau 15 phút mà không thấy xuất hiện màu đỏ thì thêm một lượng nhỏ bụi kẽm và để yên 10 phút.Nếu vẫn không thấy xuất hiện màu thì kết luận phản ứng dương tính

Lưu ý: phản ứng này phải làm trong hốt.

b) Khả năng lên men lactose và hoá lỏng gelatin: cấy vi sinh vật vào môi trường lactose – gelatin Nuôi cấy kỵ khí ở 35 – 37oC / 24h Nếu môi trườngchuyển sang màu vàng là vi khuẩn đã lên men đường lactose Làm lạnh 1h các ống nuôi cấy ở 5oC và kiếm tra sơ bộ sự hoá lỏng gelatin Nếu môi trường vẫn ở dạng đặc thì để thêm 24 h nữa

- Chỉ để lại hai chữ số có nghĩa trong kết quả cuối cùng:

- Nếu số đó nhỏ hơn 100 thì làm tròn bằng bội số của 5 gần nhất

- Nếu số đó lớn hơn 100 và tận cùng bằng 5 thì làm tròn bằng bội số của 20 gần nhất

- Nếu số đó lớn hơn 100 nhưng không tận cùng bằng 5 thì làm tròn bằng bội số của 10 gần nhất

- Để đánh giá những số thấp, lấy giá trị trung bình của phép đếm khuẩn lạc điển hình đã xác định và làm tròn tới số nguyên lớn nhất liền đó vàđem nhân với giá trị nghịch đảo của độ pha loãng

- Nêu rõ phương pháp đã áp dụng, nhiệt độ nuôi cấy và kết quả ghi nhận được cũng như tất cả các chi tiết có thể có ảnh hưởng đến kết quả