Một số phản ứng sinh lý, hóa sinh trong giai đoạn cây non liên quan tới tính chịu hạn của ba giống vừng (sesamum indicum l )

Cácnghiên cứu tập trung chọn tạo giống vừng mới cho năng suất cao, chất lượngtốt, hay nghiên cứu về chỉ tiêu hóa sinh thực phẩm, thành phần dinh dưỡngtrong hạt và tính kháng bệnh, chống

em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ bộ môn Sinh lý thực vật - Ứng dụng, khoa Sinh học trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tạo điều kiện tốt về phương tiện, giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khóa luận tốt nghiệp

Em xin trân trọng cảm ơn các cán bộ Trung tâm tài nguyên thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã cung cấp giống vừng và các tài liệuliên quan trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, em xin gửi đến gia đinh, người thân, bạn bè, các thầy cô giáo lòng biết ơn sâu sắc bởi sự động viên, khích lệ và giúp đỡ về mọi mặt để

em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 2 tháng 5 năm 2015

Tác giả

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Những chữ viết tắt

Danh mục các bảng trong khóa luận

Danh mục các hình trong khóa luận

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

ATP Adenozin triphotphat

CAM Crassulacean acid metabolism

CHK Cây không héo

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Cây vừng có tên khoa học là Sesamum indicum L., thuộc họ Tubiflorae,

họ Pedaliaceae, gồm 16 chi và khoảng 60 loài Có khoảng 37 loài thuộc chi

Sesamum nhưng chỉ có Sesamum indicum là loài duy nhất được con người sử

dụng trong trồng trọt

Vừng là một trong những loài cây lấy dầu ngắn ngày có giá trị kinh tế

và dinh dưỡng cao Trong hạt vừng có hàm lượng lipid cao, ngoài ra còn có

sự góp mặt của các axit béo không no (oleic, linoleic, linolenic), các axit aminkhông thay thế, và một số chất chống oxy hóa

Ở nước ta vừng được sản xuất chủ yếu trong mùa hè-thu ở miền Trung

và Đông Nam Bộ Điều kiện khô hạn là yếu tố hạn chế chủ yếu đến sản xuấtvừng ở những khu vực này

Hiện nay các công trình, hướng nghiên cứu về vừng còn rất ít Cácnghiên cứu tập trung chọn tạo giống vừng mới cho năng suất cao, chất lượngtốt, hay nghiên cứu về chỉ tiêu hóa sinh thực phẩm, thành phần dinh dưỡngtrong hạt và tính kháng bệnh, chống đổ lốp….song một trong những ưu điểmvượt trội của vừng là tính chịu hạn, những biến đổi sinh lý, hóa sinh trongđiều kiện hạn lại chưa được đi sâu nghiên cứu một cách có hệ thống

Tính chịu hạn của cây phụ thuộc vào kiểu gen, các chỉ tiêu sinh lý, hóasinh, một số đặc điểm nông sinh học, hình thái Vì vậy vấn đề cần đặt ra làcần nghiên cứu mối quan hệ giữa các đặc điểm sinh lí hóa sinh và một số đặcđiểm liên quan tới tính chịu hạn của vừng Hơn nữa, Việt Nam là nước nằmtrong khu vực nhiệt đới gió mùa, hạn là yếu tố thường xuyên xảy ra gây ảnhhưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, ảnh hưởng xấu đếnnăng suất và phẩm chất nông phẩm Chính vì thế việc chọn ra các giống vừng

có tính chịu hạn cao là giải pháp hữu hiệu, cần thiết Trên cơ sở đó chọn ra

những giống vừng có khả năng chịu hạn tốt Xuất phát từ những lý do nêutrên chúng tôi tiến hành đề tài :

“Một số phản ứng sinh lý, hóa sinh trong giai đoạn cây non liên

quan tới tính chịu hạn của ba giống vừng (Sesamum indicum L.)

Mục tiêu nghiên cứu

• Phân tích, so sánh khả năng chịu hạn của 3 giống vừng nghiên cứu

• Phát hiện được sự khác biệt đặc trưng trong một số chỉ tiêu sinh lý, hóasinh liên quan đến tính chịu hạn của ba giống vừng nghiên cứu

• Đề xuất được các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh đặc trưng liên quan đến tínhchịu hạn của cây vừng, làm cơ sở khoa học phục vụ cho công tác sơtuyển chọn các giống vừng có khả năng chịu hạn tốt

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học

• Các số liệu thu được của đề tài sẽ là các dẫn liệu khoa học về cácphản ứng sinh lý, hóa sinh liên quan đến khả năng chịu hạn củagiống vừng nghiên cứu

Ý nghĩa thực tiễn

• Có thể sử dụng sự khác biệt đặc trưng trong các chỉ tiêu sinh lý, hóasinh của ba giống vừng nghiên cứu trong sơ tuyển chọn tạo nhữnggiống vừng có khả năng chịu hạn cao

• Giống vừng chịu hạn tốt được chọn trong ba giống vừng nghiên cứucủa đề tài luận văn có thể đưa ra thử nghiệm ngoài đồng ruộng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây vừng

1.1.1. Đặc điểm sinh học

Cây vừng (Sesamum indicum L.) thuộc chi Sesamum, họ Pedaliaceae,

bộ Tubiflorae, lớp Mộc Lan Magnoliopsida, ngành Mộc Lan Magnoliosphyta

Vừng là cây trồng có từ lâu đời, tự thụ phấn hàng năm, thân thẳng và

có giá trị dinh dưỡng cao Vừng được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thếgiới nhưng tập trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Phi Ở Việt Nam vừng đượctrồng phổ biến ở khắp các vùng sinh thái nhưng chủ yếu là ở các tỉnh miềnNam và Bắc Trung Bộ

Vừng là cây một năm, có khả năng phân cành, có hệ thống rễ phát triển,nhiều hoa, quả nang, chứa nhiều hạt mang dầu Thời gian sinh trưởng củavừng là từ 70 đến 120 ngày [20] Cây vừng đòi hỏi nhiệt độ tương đối caotrong suốt thời gian sinh trưởng và phát triển Nhiệt độ trung bình thích hợp là

từ 25-300C

Rễ vừng là rễ cọc, rễ chính ăn sâu có hệ thống rễ bên tương đối pháttriển Vừng là cây thân thảo, dáng thẳng đứng có thể phân cành hoặc không.Thân cây có thể nhẵn, có thể có lông thưa hoặc rất nhiều lông Trên bề mặt lá

có nhiều lông, thường có màu xanh nhạt và hầu hết các phiến lá đều có lông,chất nhầy Nhiều nghiên cứu cũng đã cho thấy mối tương quan rất chặt chẽgiữa mức độ bao phủ lông trên thân, mật độ lông trên mặt lá cũng là nhữngđặc điểm liên quan đến thoát hơi nước của vừng hay khả năng chịu hạn củavừng [21]

Hoa vừng mọc từ nách lá ở phần trên của thân và cành, thường có màutrắng phớt tím hoặc hồng Hoa vừng là loại hoa lưỡng tính, thường 90% số

hoa là tự thụ phấn Qủa vừng thuộc loại quả nang dài có nhiều ngăn, có lôngbao phủ Khi chin quả có thể tự tách ra theo các vách ngăn và hạt sẽ rơi rangoài Hạt vừng có hình trứng dẹt, cấu tạo của hạt vừng có thể gồm hai lớp vỏhoặc một lớp vỏ bọc ngoài, thành phần chính trong hạt là dầu và hạt aloron.Hạt vừng chứa khoảng 45 – 54% lipit, 16 -18% protein, ngoài ra còn có chấtkhoáng, vitamin…[20], [27].

1.1.2. Đặc điểm sinh thái, sinh trưởng và phát triển của cây vừng

Vừng thường được trồng ở các vùng nhiệt đới trong điều kiện bán khôhạn và các vùng cận nhiệt đới, ôn đới trong mùa hè Cây vừng thích hợp ở độcao từ 500 – 1250 m so với mặt nước biển nhưng không chịu được sương vàgió to

• Nhiệt độ: Trong suốt thời gian sinh trưởng để cho năng suất cao câyvừng cần nhiệt độ tương đối cao Ở điều kiện nhiệt độ 25-300C rấtthuận lợi cho sự nảy mầm của hạt, sinh trưởng của thời kì cây con

và sự hình thành hoa Còn nhiệt độ cho sự nở hoa, phát triển quả là28-320C [20]

• Ánh sáng: Vừng thuộc loại cây ngày ngắn, nếu thời gian chiếu sáng

là 12 giờ/ngày thì sau khi mọc 42-45 ngày vừng có thể ra hoa.Trong điều kiện thời gian chiếu sáng dưới 10 giờ/ngày sẽ rút ngắnthời gian sinh trưởng dinh dưỡng của vừng Vừng sẽ ra hoa sớmhơn 15 - 20 ngày trong điều kiện tự nhiên (12giờ/ngày) Cường độánh sáng cũng ảnh hưởng có ý nghĩa đối với sinh trưởng, năng suất

và phẩm chất hạt Do đó cần phải xác định thời điểm gieo trồngthich hợp đối với mỗi giống ở mỗi vùng nhất định để vừng cho năngsuất cao [20], [21]

• Lượng mưa: Vừng là cây chịu hạn khá, nhưng điều đó không cónghĩa là vừng cho năng suất trong điều kiện thiếu nước.Lượng mưa

yêu cầu trong suốt thời kỳ sinh trưởng của vừng khoảng 500-600

mm Vào thời kỳ ra hoa, nếu gặp hạn thì năng suất vừng sẽ bị giảm,còn nếu đảm bảo được nước tưới thì năng suất sẽ tăng Vùng rấtmẫm cảm với điều kiện ngập nước, nếu mưa lớn liên tục ở bất kìthời điểm sinh trưởng nào cũng sẽ làm cho vừng bị chết úng hànhloạt và tăng đáng kể mức độ nhiễm bệnh do nấm [21]

• Gió : Vừng rất dễ bị thiệt hại do gió, nhất là khi thân chính phát

triển, gió cũng làm cho mất hạt khi trái bị nứt Do đó, khi chọn thời

vụ trồng vừng nên tránh vào thời gian mưa to gió lớn Do đó khicanh tác mè thường chọn những giống có lóng ngắn, chiều dài củathân tương đối ngắn có thể cho nhiều trái, chú ý cần phải vun gốccho cây

• Đất và chất dinh dưỡng: Vừng được gieo trồng trên nhiều loại đấtkhác nhau, thích hợp nhất là các loại đất có thành phần cơ giới nhẹ,giữ được ẩm, có khả năng thoát nước tốt, có độ pH từ 5,5 – 8,0 [20]

• Thời vụ gieo trồng: Thời vụ gieo trồng vừng có thể thực hiện 4 vụtrong năm Tuy nhiên tùy thuộc vào điều kiện sinh thái cụ thể củatừng địa phương mà thời vụ gieo trồng có thể thay đổi

1.1.3. Giá trị dinh dưỡng của cây vừng

Cây vừng được mệnh danh là “hoàng hậu của các cây lấy dầu” [31] vớisản phẩm chính là hạt Thành phần dinh dưỡng của trong hạt vừng chủ yếu làlipit (45% - 50%), protein (18% - 25%), gluxit (18% - 22%) Ngoài ra tronghạt vừng còn chứa một số chất khoáng và vitamin quan trọng Dầu vừng làloại có khả năng chống oxy hóa, có giá trị dinh dưỡng cao, chất lượng tốt và

là nguồn thực phẩm có giá trị đặc biệt được sử dụng rộng rãi trên thế giới

Vừng được sử dụng nhiều trong các món ăn của con người trong thức

ăn cho vật nuôi dưới dạng hạt, dầu và thức ăn chế biến Gần đây, rất nhiềucách sử dụng hạt vừng một cách bổ dưỡng và có lợi cho sức khỏe đã đượcphát hiện Bên cạnh các chất chống oxy hóa hòa tan được lipit như sesamin,sesamol và sesamolin, người ta còn phát hiện ra rằng: các hợp chất lignans vàlignin glucozit cũng có khả năng chống phản ứng peroxyt hóa chất béo, tăngnguồn cung cấp vitamin E ở động vật Chính vì vậy, dầu vừng được coi làmột trong những chất béo khá lí tưởng để làm thực phẩm cho cả người lớn,trẻ em, cho người béo phì hay thừa cholesterol trong máu

Trong đông y, vừng đen có tên gọi là “hắc ma chi”, được dùng làmthuốc bổ, nhuận tràng, lợi sữa và chế các loại cao dán nhọt ăn vừng đen cótác dụng làm sáng mắt, tăng tuổi thọ, chống rụng tóc và giữ được tóc đen lâu.Ngoài ra, lá vừng vị ngọt, tính lạnh có tác dụng ích khí, bổ não tủy, mạnh gâncốt, khỏi tê thấp.Dùng lá vừng để gội đầu thường xuyên sẽ giúp tóc có màuđen mượt Giã lá vừng tươi vắt lấy nước cốt uống sẽ chữa được bệnh ronghuyết…[4]

Hạt vừng có chứa đủ 8 axit amin không thay thế , hàm lượng lipit cao

và chứa nhiều axit béo Chính vì vậy bột vừng thường được dùng để chế biếnthành thức ăn bổ sung, phòng chống suy dinh dưỡng cho trẻ em

Ngoài ra trong hạt vừng còn chứa nhiều vitamin A, B1, B2, PP và một sốnguyên tố khoáng như canxi, photpho, sắt, kẽm, đồng…

1.2 Tình hình sản xuất vừng trên thế giới và Việt Nam

Vừng được trồng chủ yếu ở một số nước đang phát triển thuộc khu vựcChâu Á, Châu Phi và Châu Mỹ Trong đó ở Châu Á vừng được trồng với quy

mô lớn nhất, chiếm 55% diện tích và 62% sản lượng Các nước ở Châu Phichiếm 33,58% diện tích và 21,76% sản lượng Phần còn lại không nhiều đượcphân bố ở khu vực Châu Mỹ và một số nước khác [29]

Do điều kiện canh tác đơn giản, trình độ thâm canh và khả năng đầu tưtiến bộ kỹ thuật vào sản xuất có sự khác biệt lớn giữa các nước nên năng suấtvừng hầu như đạt tốc độ tăng trưởng rất thấp Điều đó cho thấy, điều kiện sảnsuất và canh tác vừng hiện nay hoàn toàn chưa tương xứng với nhu cầu về sảnlượng đang tăng cao trên thế giới.

Ở Việt Nam, đất đai khí hậu rất thích hợp cho cây vừng sinh trưởng vàphát triển Mặt khác, vừng là loại cây dễ trồng, đầu tư sản xuất cũng khôngnhiều nhưng chưa được coi là cây trồng chính, diện tích gieo trồng ít, năngsuất chưa cao,cho dù dầu vừng có giá trị cao, có nhu cầu lớn ngay cả thịtrường trong nước

Diện tích vừng hàng năm biến động từ 30.000 đến hơn 40.000 ha trong suốtthập niên qua, con số này rất khiêm tốn so với một số giống cây họ đậu [21]

Năm 2004, cả nước gieo trồng được 40.800 ha, tăng 4000 ha so vớinăm 2000 Diện tích tăng chủ yếu ở Đồng bằng sông Cửu Long và Duyên hảiNam Trung Bộ, nhưng diện tích giảm mạnh ở khu vực Tây Nguyên, các vùngkhác không có sự thay đổi nhiều về diện tích Diện tích vừng phân bố chủ yếu

ở các tỉnh miền Nam, khoảng 25.600 ha (chiếm trên 60% diện tích gieo trồngvừng trong cả nước), các tỉnh miềm Bắc đạt 15.200 ha (chiếm hơn 30% diệntích gieo trồng vừng trong cả nước) Tổng sản lượng vừng năm 2004 trong cảnước đạt gần 21.000 tấn, tăng 4.400 tấn so với năm 2000 Trong đó các tỉnhmiền Bắc chiếm 33,97% và các tỉnh miền Nam đạt 66,03% Nhìn chung, năngsuất trung bình của cả nước ở mức thấp, đạt 0,51 tấn/ha (năm 2004), tăngkhông đáng kể so vơi năm 2000 (0,46 tấn/ha)

Các yếu tố khách quan như đất đai, khí hậu, yếu tố đầu tư thâm canhthấp, thiếu bộ giống chống chịu với điều kiện hạn hán và sâu bệnh là nguyênnhân lớn nhất làm giảm năng suất, chất lượng của nừng ở cả trong nước vàtrên thế giới

Để khắc phục thực trạng trên, những năm gần đây, trên thế giới đã cónhiều nước đi sâu nghiên cứu về giống vừng và đầu tư nhiều hơn trong canhtác vừng Các nước như Ấn Độ, Trung Quốc và Hàn Quốc đã có nhữngchương trình thu thập nguồn gen cây vừng ở địa phương, bảo quản và khaithác nguồn gen làm vật liệu khởi đầu phục vụ công tác chọn tạo giống.

1.3 Tính chịu hạn của thực vật và tính chịu hạn của vừng

1.3.1 Khái niệm về tính chịu hạn

Trong chu trình sống để tồn tại, sinh trưởng và phát triển cũng như táitạo thế hệ mới thực vật luôn phải chịu tác động của nhân tố ngoại cảnh haycác yếu tố sinh thái như: ánh sáng, nhiệt độ, nước, dinh dưỡng…Thực vật chỉ

có thế sống được trong giới hạn xác định của các điều kiện sinh thái nhưnóng, lạnh, khô hạn, ngập úng, sâu bệnh… Khi ở ngoài giới hạn này, các yếu

tố đó trở nên bất lợi gây hại cho sự sinh trưởng, phát triển của thực vật, giảmnăng suất sinh học và có thể làm cây chết Khả năng mà thực vật có thể giảm

thiểu được mức độ tổn thương khi bị tác động bát lợi gọi là tinh chống chịu

(Stress tolerance) [1] Tính chống chịu của thực vật được hình thành trong cácchu trình sống, tiến hóa và được di truyền lại [9]

Hạn là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây nêntrong suốt quá trình hay trong từng giai đoạn làm ảnh hưởng đến sinh trưởng

và phát triển của cây

Khả năng mà thực vật có thể giảm thiểu tổn thương do hạn gây nên và

vẫn sinh trưởng, cho sản phẩm trong điều kiện thiếu nước gọi là tính chịu hạn

[9] Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương

đối ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn.

Tế bào của thực vật không có khả năng chịu hạn thường bị chết khi tếbào bị mất nước nhiều do không bào bị ép sát vào thành tế bào làm cho chất

nguyên sinh bị xé nhỏ Còn đối với thực vật chịu hạn thì tế bào sẽ không bịtổn hại nghiêm trọng khi tế bào thực vật trải qua quá trình mất nước nhiều.

Mức độ tổn thương do hạn gây ra cho thực vật là rất lớn Trước hếtnhiệt độ cao phá huỷ các cấu trúc của các bào quan của tế bào và của các cơquan của cây Ty thể, lục lạp đều bị tổn thương nặng, ảnh hưởng đến chứcnăng hô hấp và quang hợp Lá bị cháy sém giảm khả năng quang hợp và thoáthơi nước Khi gặp nhiệt độ cao cả quang hợp lẫn hô hấp đều bị ảnh hưởng.Khi nhiệt độ tăng mạnh cường độ quang hợp giảm nhanh hơn tốc độ hô hấp.Trên ngưỡng nhiệt sinh lý quang hợp không thể bù đủ lượng cơ chất cho hôhấp, do vậy dự trữ gluxit sẽ giảm Do vậy sự mất cân bằng giữa hô hấp vàquang hợp là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây hại cho cây Sự tăngcao hô hấp so với quang hợp ở nhiệt độ cao xảy ra rõ rệt ở cây C3 so với câyC4 hay CAM Do ở cây C3 hô hấp tối và quang hô hấp đều tăng cùng sự tăngnhiệt độ Nhiệt độ cao làm giảm tính bền vững của màng và protein

Khi nhiệt độ cao, tính lỏng quá cao làm thay đổi cấu trúc của màng làmcho màng mất các chức năng sinh lý, để ngoại thấm các ion ra ngoại bào.Nhiệt độ cao kích thích quá trình phân huỷ các chất, đặc biệt là protein Khiprotein bị phân huỷ mạnh sản phẩm tích tụ nhiều trong tế bào là NH3 gây độccho tế bào

Nhiệt độ cao cũng làm giảm lượng axit hữu cơ và nhiều hợp chất hữu

cơ quan trọng khác do bị phân huỷ Đặc biệt là nhiệt độ cao làm cho hô hấpmạnh nhưng sự tích luỹ năng lượng vào ATP qua quá trình photphoryl hoá bịhạn chế nên phần lớn nhiệt thải ra trong hô hấp ở dạng nhiệt làm tăng nhiệtnội bào làm cho tế bào bị tổn thương và có thể bị chết

Hạn hán là một hiện tượng phức tạp, và được coi là nhân tố quan trọngnhất giới hạn sản lượng cây trồng Việc chọn lựa dựa trên những đặc điểmcủa thực vật có liên quan với khả năng chịu hạn là rất phổ biến Đây cũng

chính là một thách thức đối với các nhà khoa học nông nghiệp nói chung vànhững nhà chọn giống thực vật nói riêng để tìm ra những giống cây trồng vừa

có khả năng chịu hạn tốt vừa cho năng suất cao, ổn định

Các kiểu hạn

• Hạn đất: Xảy ra khi không có mưa trong thời gian dài làm chođất bị khô hạn, lượng nước rễ cây hấp thụ được trong đất đã bịcạn kiệt và cây không thể hút đủ nước bù đắp lại lượng nước đã

bị mất qua con đường thoát hơi nước Hạn đã làm tăng áp suấtthẩm thấu của đất cao đến mức làm cho cây không thể lấy đượcnước từ đất vào tế bào qua rễ, dẫn đến sự mất cân bằng nướctrong cây và xuất hiện dấu hiệu héo Mức độ khô hạn của đất tùythuộc vào sự bốc hơi nước trên bề mặt và khả năng giữ nước củađất

• Hạn không khí: Xảy ra khi độ ẩm tương đối của không khí giảmxuống quá thấp, gia tăng gradient hơi nước giữa không gian bêndưới khoang khí khổng và không gian bên ngoài lá, thoát hơinước tăng nhanh, gây nên sự mất cân bằng nước nhiều và bị héo

• Hạn sinh lý: Xảy ra do trạng thái sinh lý của cây không cho phépcây hút được nước mặc dù trong môi trường không thiếu nước

Rễ cây không lấy được nước trong khi các quá trình thoát hơinước vẫn diễn ra nên cây mất cân bằng nước

1.3.2 Tác động của hạn đến thực vật.

Hạn là một trong những nguyên nhân chính gây mất mùa và làm giảmnăng suất cây trồng Trên thế giới có khoảng 40 – 60% diện tích đất trồng bịkhô hạn Trong đó nước ta có địa hình phức tạp nên khí hậu rất phức tạp,lượng mưa phân bố không đều giữa các vùng trong năm, nhiều vùng có thểxảy ra khô hạn Cùng với sự bùng nổ dân số, ô nhiễm môi trường là các tácnhân chính gây ra hạn

Nước có vai trò quan trọng đối với đời sống của cây, khi thực vật thiếunước, các cấu trúc tế bào, hoạt động của thực vật sẽ chịu ảnh hưởng rõ rệt [9].

Khi tế bào bị mất nước, không những diễn ra những biến đổi về hìnhthái (mô mất sức căng và héo dần) mà còn có những biến đổi sâu sắc về trạngthái chất nguyên sinh của tế bào: tăng độ nhớt chất nguyên sinh làm chậm cáchoạt động sống, giảm mức độ phân tán, khả năng thuỷ hoá và tính đàn hồi củakeo nguyên sinh chất, chuyển trạng thái sol sang gel

Hạn làm giảm lượng nước tự do, giảm hoạt tính của các enzyme tổnghợp và hoạt hóa các enzyme thủy phân, gia tăng sự phân giải các hợp chấtphân tử cao như protein, hydratcacbon kết quả là giải phóng và tích luỹ NH3

gây độc cho cây và có thể làm chết cây Thiếu nước ban đầu làm tăng cường

độ hô hấp nhưng sau đó hô hấp bị giảm mạnh nếu tiếp tục thiếu nước dẫn đếnlàm giảm sự hình thành ATP Hạn ảnh hưởng rất xấu đến cấu trúc bộ máyquang hợp do khí khổng đóng nên thiếu CO2, lục lạp có thể bị phân huỷ, ứcchế tổng hợp diệp lục; lá bị héo và khô chết là giảm diện tích quang hợp; sựvận chuyển các sản phẩm quang hợp ra khỏi lá và về cơ quan dự trữ bị tắcnghẽn gây hiện tượng ‘chảy ngược dòng’ làm giảm năng suất kinh tế

Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu đến quá trìnhsinh trưởng và phát triển của cây : tế bào phân sinh trong đỉnh sinh trưởngkhông phân chia, quá trình dãn của tế bào bị ức chế, tế bào ngừng sinh trưởng

và cây còi cọc

Như vậy, hạn đã làm ảnh hưởng đến cơ thể thực vật ở các mức độ khácnhau từ tế bào, mô, cơ quan đến cơ thể, ở các giai đoạn phát triển khác nhaucủa cây Từ đó ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý, sinh trưởng và phát triểncủa thực vật Hạn là một trong những stress nghiêm trọng nhất mà năng suấtcây trồng trên khắp thế giới phải đối mặt Hạn là nguyên nhân chính của sự

mất mùa và giảm năng suất Hạn có thể giảm 50% năng suất cây trồng hoặchơn thế nữa.

1.3.3 Đặc điểm thích nghi của thực vật với điều kiện hạn.

Theo Musell và Stapes, Paleg và Aspinal, Tumer, có 2 cơ chế bảo vệthực vật tồn tại trên môi trường thiếu nước, đó là cơ chế tránh mất nước và cơchế chịu mất nước

Cơ chế tránh mất nước phụ thuộc vào khả năng thích nghi đặc biết vềcấu trúc và hình thái của rễ, lá, khí khổng… nhằm giảm thiểu tối đa sự mấtnước Khả năng tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thông qua việc tăngtích lũy các chất hòa tan, axit abxisic, đường, axit amin prolin, mannitol, ion

K+, các enzyme phân hủy gốc tự do… có tác dụng tăng lượng nước liên kếttrong tế bào chất, duy trì lượng nước tối thiểu trong tế bào

Cơ chế chịu mất nước liên quan đến những thay đỏi trong tế bào đểsinh tổng hợp ra các chất đảm bảo cho sự khử độc các sản phẩm độc hại như

NH3 , xúc tiến phục hồi các cấu trúc sinh học bị hư hại, bảo vệ hoặc nhanhchóng bù lại sự thiếu hụt nước cũng như tổng hợp các protein sốc nhiệt bảo vệAND khi mô và tế bào bị mất nước nghiêm trọng

Khả năng chịu hạn là sự thích nghi có bản chất di truyền, biểu hiện về

sự đa dạng về đặc điểm hình thái, các đặc điểm hóa sinh, đặc điểm sinh lý

 Sự thích nghi về đặc điểm sinh thái

Khi sống trong điều kiện khô hạn nhiều loài thực vật đã hìnhthành nên những đặc điểm thích nghi đặc trưng Ở đa số các loài thựcvật chịu hạn, hệ rễ phát triển rất mạnh, phân nhánh và ăn sâu xuốngmạch nước ngầm để có thể lấy được lượng nước ít ỏi trong đất Thựcvật chịu hạn lá có thể vận động theo hướng song song với tia sáng tới;

có thể cuộn lá lại hay cụp lá xuống để giảm sự hấp thu bức xạ ánh sángmặt trời; giảm diện tích lá (ví dụ: cây xương rồng…) hay lá sinh trưởng

chậm khi thiếu nước, có thể rụng đi hay khô chết để giảm bề mặt thoáthơi nước Một số loài lá có lông góp phần bảo vệ lá khỏi bị đốt nónghay khí khổng lẫn vào bên trong ống lá giúp giảm thiểu thoát hơi nướcqua khí khổng.

 Sự thích nghi về đặc điểm sinh lý

Cơ chế đóng mở khí khổng

Cơ chế sinh lý hiệu quả nhất hạn chế sự mất nước là điều chỉnh

độ đóng mở khí khổng Khí khổng của những thực vật chịu hạn nàythường rất nhạy cảm với thiếu nước Các thực vật loại này thường sống

ở sa mạc và thường là thực vật CAM nên có xu hướng mở khí khổngvào ban đêm để nhận CO2

Khả năng điều chỉnh áp suất ẩm thấu là một đặc tính quan trọng của

tế bào, liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nước của tế bào rễvới đất Hạn làm áp suất thẩm thấu tăng- cơ chế thích nghi của thực vậtchịu hạn

Vai trò của hệ sắc tố, khả năng giữ nước, hàm lượng nước trong lá

Khi thiếu nước, cường độ quang hợp phụ thuộc vào lượng nướcliên kết trong tế bào và độ ngậm nước của keo nguyên sinh chất Lúcnày có sự phân phối lại các sản phẩm đã tạo thành trong quá trìnhquang hợp Chính vì vậy, trong thời gian khô hạn, người ta thường thấytrong cây xuất hiện nhiều sản phẩm như đường, axit amin, giảm mạnhcác hợp chất cao phân tử nhất là tinh bột và protein Chỉ số sinh lýthường được sử dụng để đánh giá khả năng chống chịu của cơ thể thựcvật với môi trường bất lợi là hệ số sắc tố

Sự thích nghi về đặc điểm hóa sinh

Vai trò của prolin, đường trong việc điều hóa áp suất thẩm thấu

Prolin là một trong những chất liên quan đến sự thẩm thấu ở tế bàothực vật Sự tích lũy prolin trong điều kiện hạn đã được nghiên cứu ởnhiều loài thực vật như: đậu xanh, khoai tây, lúa mạch, hướng dương, càchua… Kết quả cho thấy, hàm lượng prolin tăng lên khi thực vật bị hạn

1.3.4 Tình hình nghiên cứu vừng và tính chịu hạn của vừng

Vừng là cây trồng có nhiều lợi thế vì có thể trồng nhiều ở điều kiệnnhiệt độ tương đối cao, lượng nước thấp Trong điều kiện khô hạn, với lượngmưa < 600 mm/năm, nhiều cây trồng khó có khả năng sinh trưởng, ra hoa vàkết quả, nhưng vừng vẫn có thể cho thu hoạch Điều đó cho thấy vừng là mộtcây trồng chịu hạn cần được khai thác và phát triển để làm tăng thu nhập chonông dân các vừng nhiệt đới bán khô hạn [20], [21]

Hàm lượng lipit, protein, axit amin, các axit béo no, chưa no, các hợpchất chống oxy hóa cao (sesamol, sesamin, α- tocophrol) có trong hạt vừng vàvai trò của các hợp chất đó cũng đã được đề cập trong rất nhiều nghiên cứutrên thế giới

Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về sự ảnh hưởng củahạn đến sự nảy mầm, hàm lượng protein, lipit, các enzyme oxy hóa trong hạtvừng; hàm lượng nước liên kết và hàm lượng diệp lục trong lá vừng; quá trìnhsinh trưởng, phát triển và năng suất của cây vừng [34]

Fazeli và cs (2007) đã làm thí nghiệm với 2 giống vừng Darab 14 vàYskta (Iran), kết quả cho thấy: khối lượng tươi, khối lượng của lá, rễ; hàmlượng protein tổng số trong lá và rễ vừng giảm đi dưới tác động của hạn Bêncạnh đó có sự xuất hiện của protein mới; hoạt tính của các enzyme oxy hóalipit, catalase, peroxidase, polyphenol oxidase trong rễ và lá tăng lên [34]

Hasanzadeh và cs (2009) nghiên cứu 27 giống vừng, kết quả củanghiên cứu đã đánh giá được sự thay đổi về hàm lượng diệp lục a, diệp lục b,diệp lục tỏng số và hàm lượng nước liên kết trong điều kiện khô cằn và bánkhô cằn ở vùng moghan, Iran [38]

Mặc dù các kết quả nghiên cứu về khả năng chịu hạn của vừng còn hạnchế, song các kết quả thu được đã phần nào chỉ ra được mối liên quan giữatính chịu hạn của cay trồng nói chung và cây vừng nói riêng với các chỉ tiêu

sinh lý, hóa sinh, từ đó làm tiền đề cho những nghiên cứu tiếp sau, đi sâunghiên cứu về cơ chế chịu hạn của cây trồng, cây vừng.

Ở Việt Nam, cho đến nay, hướng nghiên cứu về vừng còn rất hạn chế, chưa

có công trình nghiên cứu nào đi sâu về cơ chế, bản chất chịu hạn của cây vừng

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu là 3 giống vừng do Bộ mônNgân hàng gen hạt giống, Trung tâm tài nguyên thực vật, Viện KHNN ViệtNam cung cấp (bảng 2.1) Hình thái hạt của các giống vừng được thể hiện ởbảng 2.1 và hình 2.1

Bảng 2.1: Danh sách các giống vừng sử dụng trong nghiên cứu

đăng kí

Kí hiệu

2.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

Sử dụng thiết bị và hóa chất của Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý thực vật Ứng dụng, Bộ môn Hóa sinh – Tế bào, Khoa Sinh học trường ĐHSP Hà Nội

-Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 15/8/2014 đến 10/02/2015

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Hạt giống đem ngâm trong vong 1- 1,5 giờ, sau đó mỗi giống để vàomột đĩa petri đước lót bằng giấy thấm, tiếp tục để vào tủ ấm nhiệt độ 30-

320C, để 24h rồi đem ra trồng

Cây được trồng trong chậu, mỗi chậu có kích thước 25 × 20cm, chứa

1,2kg đất Phù Sa Sông Hồng, các chậu đặt trên giá, bố trí thí nghiệm theophương pháp của của Klein, nhiệt độ trong phòng từ 26 – 320C, thời gianchiếu sang là 12 giờ/ngày

Mỗi giống chia làm 4 lô, 2 lô đối chứng và 2 lô gây hạn nhân tạo Khicây bắt đầu 4 lá thật tiến hành gây hạn nhân tạo: 2 lô đối chứng vẫn tưới nướcbình thường( ĐK thường) Còn 2 lô thí nghiệm ( Ngừng tưới nước cho đếnkhi thấy xuất hiện lá héo đầu tiên) ( Đk hạn) để héo ổn định qua đêm Tiếnhành lấy lá thứ 3 tính từ ngọn để xác định các chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh liên quan đến tính chịu hạn.

2.2.2.1 Chỉ tiêu đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ( Theo phương pháp của Lê Trần Bình và đồng tác giả.1998) [1].

Cây trồng trong chậu để phòng chiếu sáng nhân tạo Sau khi cây được 4

lá thật tiến hành gây hạn nhân tạo bằng cách ngừng tưới nước cho ở các lô thínghiệm cho đến khi héo hoàn toàn Xác định các tỷ lệ:

 Xác định tỷ lệ cây không héo: sau 1,3,5 ngày lô thí nghiệm bắt đầu cócây héo

 Xác định tỷ lệ phục hồi: sau 5 ngày lô thí nghiệm cây bị héo, tiến hành tướinước phục hồi Xác định tỷ lệ cây phục hồi sau khi tưới nước 1,3,5 ngày.

 Khả năng chịu hạn của cây được biểu thị bằng đồ thị hình rada: gồmcác trục a,b,c,d,e,g và mang các trị số tương ứng an, bn, cn, dn, en, gn vàchỉ số chịu hạn tương đối được tính theo công thức:

Sn = (anbn + bncn + cndn + dnen + engn + gnan )

Trong đó:

Góc được tạo bởi hai trục mang trị số gần nhau và =3600/6 = 600

Sn : Chỉ số chịu hạn tương đối

n: Kí hiệu các giống nghiên cứu

Các chỉ tiêu theo dõi gồm có:

a: % cây không héo sau 1 ngày hạn

b: % cây hồi phục sau 1 ngày hạn

c: % cây không héo sau 3 ngày hạn

d: % cây hồi phục sau 3 ngày hạn

e: % cây không héo sau 5 ngày hạn

g: % cây hồi phục sau 5 ngày hạn

Chỉ số chịu hạn tỷ lệ thuận với khả năng chịu hạn

2.2.2.2 Hàm lượng trong mô khi cây héo

Khi cây héo ổn định, cắt lá (lá thứ 3 từ trên xuống) trên cùng tầng củamỗi giống, mỗi công thức cắt 10 lá, lặp lại 3 lần

Hàm lượng nước trong mô khi cây héo được xác định bằng phươngpháp khối lượng và được tính theo công thức:

A% =×100%

Trong đó:

A%: Hàm lượng nước tổng số trong cây

B: Khối lượng thân và lá ban đầu (gam)

B: Khối lượng thân và lá sau khi sấy (gam)

2.2.2.3 Hàm lượng nước liên kết trong mô lá

Các lá mẫu lấy cùng vị trí (lá thứ 3 từ trên xuống) vào mỗi buổi sáng, mỗicông thức lấy 10 lá, lặp lại 3 lần Sau khi lá cắt rời khỏi cây đưa ngay vào túinilon để hạn chế sự mất nước Xác định hàm lượng nước liên kết trong mô lábằng phương pháp của Dhopte (2002)

Hàm lượng nước tính theo công thức sau:

W= (F – D)/(T- D) 100

Trong đó: W: là hàm lượng liên kết

F : Khối lượng tươi của mẫu

D : Khối lượng khô của mẫu

T : Khối lượng mẫu khi bão hòa

2.2.2.4 Khả năng giữ nước của mô lá

 Nguyên tắc thí nghiệm

Trong điều kiện bình thường, lá tiến hành quá trình thoát hơi nước qua khíkhổng hay cutin Lượng nước thoát ra ngoài được bù lại bằng quá trình hútnước và đảm bảo sự cân bằng nước trong cây Khi gặp điều kiện bất lợi tácđộng, ở lá xuất ra hiện tượng mất nước, lúc này cơ chế giữ nước trong tế bàohoạt động

 Thí nghiệm

Lá thí nghiệm lấy cùng vị trí, lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 lá Sau khi lá đượccắt rời cho vào túi nilon tránh mất nước Đem về phòng thí nghiệm và đemcân bằng cân phân tích

Sau đó để lá héo tự nhiên trên bàn không có ánh nắng chiếu trực tiếp, ởnhiệt độ phòng, thời gian 3-4 giờ

Sau đó sấy khô lá ở 105oC đến khối lượng không đổi để tính khối lượng khô.Khả năng giữ nước của lá xác định theo phương pháp của Kozushco [12]

Và được tính theo công thức:

A% = %

Trong đó

B : Khối lượng lá tươi ban đầu (gam)

b : Khối lượng lá sau khi héo (gam)

V : khối lượng khô của lá sau khi sấy (gam)

A% : Khả năng giữ nước của mô lá (Tính bằng % lượng nướcmất/lượng nước tổng số)

2.2.2.5 Hàm lượng diệp lục tổng số ( bằng phương pháp quang phổ theo phương trình của Wettstein, 1957).

 Nguyên lí: Dùng dung môi phân cực (Axeton 100%) để rút toàn bộ diệp

lục vào trong dung dịch Đo trên máy quang phổ sẽ tính được hàmlượng diệp lục a, b và a + b trong dung dịch Các sắc tố đều có 2 cựcđại hấp thu trong dung môi sử dụng, trong dung môi Axeton 100% có 2cực đại là E662 và E664

 Lấy mẫu: Mẫu lá lấy ở cùng vị trí, cùng số lá Mỗi công thức lấy 4 mẫu

( số mẫu bằng số lần lặp lại của thí nghiệm)

 Phương pháp tiến hành:

 Cân 40mg lá tươi cho vào cối sứ nghiền nhỏ, thêm 1ml Axeton 100%

và tiếp tục nghiền Sau đó thêm 5ml Axeton 100%, nghiền mẫu thànhkhối đồng thể

 Sau đó chuyển dịch nghiền sang phễu lọc thủy tinh xốp gắn với bìnhBunsen Nối bình với máy hút chân không và hút Đổ 2 ml Axeton đểtráng phễu và tiếp tục hút cho đến khi giọt Axeton trên phễu nhỏ xuốngkhông có màu xanh Chuyển dung dịch diệp lục vào bình định mức códung tích 10ml và dùng Axeton lên thể tích đến vạch

 So màu trên máy quang phổ ở bước song E662 và E664nm Nồng độ diệplục được tính theo công thức của Wettsein như sau:

Ca (mg/l) = 9,784 E662 – 0,990 E644

Cb (mg/l) = 21,426 E – 4,650 E

Ca + b (mg/l) = 5,134 E662 + 20, 436 E644

Hàm lượng diệp lục trong 1g lá tươi được tính theo công thức:

A = (mg/g chất tươi)

Trong đó:

C: Nồng độ diệp lục có trong dịch chiết V: Thể tích dịch chiết sắc tố

E662 và E644 : Kết quả so màu diệp lục dưới

bước sóng E662 và E644

P: Trọng lượng mẫu (g)

Ca, Cb, Ca + b : Hàm lượng diệp lục a, b, tổng

số trong 1ml dung dịch diệp lục

A: Hàm lượng diệp lục trongmẫu tươi (mg/g chất tươi)

2.2.2.6 Xác định hàm lượng diệp lục liên kết ( Bằng phương pháp quang phổ theo phương trình của Wettstein, 1957).

 Cân 50mg lá, cắt nhỏ, cho vào cối sứ nghiền cùng benzene cho tới khimẫu dính vào đấy cối loại bỏ dung dịch Benzen đi, tiếp tục cho Benzenvào nghiền, lặp đi lặp lại cho tới khi dịch Benzen không nhuộm màuxanh Đổ dung dịch Benzen đi cho dung dịch Axeton 100% vào hòa tanmẫu dính ở cối sứ Đưa toàn bộ dịch lọc sang bên phễu lọc rồi trángbằng Axeton Chuyển dịch lọc sang bình định mức và dẫn tới 10ml

 Đó trên máy quang phổ tại các bước song E662 , E644 Tính hàm lượngdiệp lục liên kết giống với tính hàm lượng diệp lục tổng ở trên

2.2.2.7 Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS

 Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu của aldehyde với thuốcthử DNS Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độđường khử trong một phạm vi nhất định

 Thí nghiệm

• Chuẩn bị mẫu:

Cân 1 g lá ở mỗi giống trên cùng tầng (tầng thứ 3 từ trên xuống), chovào cối sứ nghiền trong 5ml H2O sau đó cho vào ống fancol định mức lên10ml Ly tâm dung dịch đó trong 5 phút

Pha dung dịch đường chuẩn vào các ống eppendorf với nồng độ 0/ 0.2/0.4/ 0.6/ 0.8/ 1 mg/ml

Đun sôi cách thủy 5 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng

Đo quang phổ (OD): lấy 250 μl nạp vào bản nhựa 96 giếng (mỗi mẫu nạp 3 lầntheo hàng ngang), đem đo mật độ trên máy quang phổ ở bước sóng 575nm

Chú ý: mẫu phân tích và đường chuẩn sau khi cho thuốc thử DNS nên đun sôi cách thủy cùng một lúc.

• Xây dựng đồ thị chuẩn: Dựa vào kết quả đo OD của đường chuẩn hãydựng đồ thị chuẩn, với trục tung là OD, trục hoành là nồng độ đường.Y= 1.0899X + 0.0578

• Tính kết quả

Dựa vào đồ thị chuẩn, xác định hàm lượng đường trong mẫu

Hàm lượng đường khử trong nguyên liệu:

mg/g đường khử =

Trong đó:

A: Hàm lượng đường khử của 250μl dung dịch mẫu đem đo trênmáy quang phổ tính theo đồ thị chuẩn (mg/ml)

V: Thể tích pha loãng (10ml)f: Hệ số pha loãng (2)

g: khối lượng mẫu đem phân tích (1g)

2.2.2.8 Hàm lượng axit amin prolin (theo phương pháp của Bates (1973) theo mô tả của Đinh Thị Phòng (2001))

 Nguyên tắc:

Dựa trên phản ứng giữa prolin và dung dịch ninhydrin trong axit tạohợp chất màu vàng, hấp thụ bước sóng đặc trưng 520nm Công thức tinh hàmlượng prolin xác định trên cơ sở tham khảo Reigosa Roger M.J

 Thí nghiệm

Lấy mẫu lá cùng các vị trí Lấy 0,05g nghiền kĩ với 1ml dung dịch axitsulfosalicylic 3% Li tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, thulấy dịch trong

Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình ( hoặc lọ thủy tinh penicillin, ốngnghiệm) Thêm 0.5 ml axit axetic và 0.5 ml dung dịch ninhydrin – axit (dung dịch này gồm 30ml axit axetic và 1,25g ninhydrin), đậy kín ủtrong nước nóng 1000C trong 1giờ, sau đó ủ trong khay đá 5 phút, bổsung vào bình 2ml toluene, lắc đều Lấy phần dịch màu hồng ở trênđem đo OD với bước sóng 520nm trên máy quang phổ

Lập đường chuẩn prolin: Y =

Trong đó: Y: hàm lượng prolin (

X : giá trị mật độ quang học đo được ở bước song 520nm

Quy đổi ra hàm lượng mẫu:

Từ trên tính prolin/g mẫu tươi theo công thức:

A =

Trong đó: