Các biện pháp tách và làm sạch enzym

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, cácchế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hếttrong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác

Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cungcấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ranhiều hơn Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng

hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất Các chế phẩm thu đượcsau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinhkhiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiếnphương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinhkhiết cao rất cần thiết Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nóichung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau Có thểchia làm năm nhóm phương pháp sau:

- Phương pháp biến tính chọn lọc

- Phương pháp kết tủa phân đọan

- Phương pháp hấp thụ chọn lọc

- Phương pháp sắc ký

- Phương pháp tách hệ hai pha nước

Cho đến nay không có phương pháp tách và làm sạch chung cho các enzyme Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzyme nào dó cần biết lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và làm sạch khác nhau

PHẦN I: TỔNG QUAN

I/Khái niệm enzyme

- Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoáhọc với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp

- Enzyme có trong tất cả các tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học

- Enzyme có đầy đủ các tính chất của chất xúc tác, nhưng enzyme cóhiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác.Enzymekhông những có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, màsau khi tách khỏi hệ thống sống, ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữđược hoạt tính xúc tác

Như vậy,có thể nói một cách khái quát, enzyme là những phân tử lớntồn tại trong tự nhiên, hay được tổng hợp có khả năng xúc tác cho một haynhiều phản ứng với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ và áp suất bìnhthường

II/Những tiêu chuẩn tinh sạch của enzyme

Để xác định xem protein được chiết tách ra có phải là enzyme tinhkhiết không hay còn chứa những tạp chất protein không họat động, người

ta sử dụng một số phương pháp chủ yếu dựa trên việc nghiên cứu nhữngtính chất vật lý của protein

- Làm lắng (kết tủa) dung dịch protein trong phần quay phân tích củamáy siêu ly tâm: phát hiện một đỉnh của protein thì đó là proteinthuần nhất Tuy nhiên một số protein tuy khác nhau nhưng có cùngtrọng lượng phân tử và có hình dạng tiểu phân ( hoặc có khi có sự bùphụ của các ảnh hưởng của khối lượng và hình dạng) thì có hằng sốlắng trùng nhau Vì thế khi siêu ly tâm, chúng có thể lắng với tốc độnhư nhau và cho một đỉnh chung.

- Điện li ( phương pháp ranh giới di động): phương pháp này rất hiệuquả Tuy nhiên khó mà phân biệt được những protein giống nhau vềtrị số di động điện li Dung dịch enzyme khi được điện li khu vựctrong jela tinh bột hoặc thạch chỉ ra một đỉnh cân đối thì đó là dấuhiệu của enzyme thuần nhất Thế nhưng khi hàm lượng nhữngprotein tạp nhỏ(<=1%) thì khó phát hiện ra đúng

- Xác định họat độ riêng, mật độ quang học riêng trong những đỉnhquang phổ đặc trưng cùng hàm lượng các nhóm ngọai đặc hiệu

- Biện pháp khá nhạy cảm để xác định mức độ thuần nhất của enzyme( cũng như protein khác) là kết hợp sự phân tích điện li và nhữngphản ứng miễn dịch hóa học đặc hiệu, đặc biệt điện di trên thạchtheo grabar

- Biện pháp nghiên cứu có triển vọng nhưng tương đối ít nhạy về độthuần nhất của protein là sự xác định độ hòa tan của nó theonorchrop.

Thường để xét độ thuần nhất của enzyme, người ta dựa trên sự sosánh những kết quả thu được từ một vài phương pháp khác nhau

Đặc biệt, những chế phẩm enzyme càng tinh khiết thì càng dễ hỏng

và khi bảo quản trong các dung dịch ở 40C đều nhanh chóng mất hoạttính Vì thế, khi tái kết tinh enzyme lặp lại ta thường thấy có sự giảmhoạt độ riêng vì các tinh thể đã bị ô nhiễm bởi phần enzyme bị ức chế

PHẦN II

TÁCH CHIẾT& TINH SẠCH ENZYME

I Các điều cần lưu ý khi tách chiết và tinh sạch enzyme

Có 3 khó khăn trong khi tách enzyme khỏi tế bào cần phải hết sức lưu ý.

- Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thànhphần khác

- Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi bị tácđộng của các yếu tố bên ngoài

- Enzyme là prôtêin Prôtêin enzyme luôn luôn đi cùng những loạiprôtêin không phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hoá rất giống prôtêinenzyme Do đó, rất dễ mất hoạt tính sinh học khi bị tách ra khỏi tế bào và cơthề.Việc mất hoạt tính có thể do nhiệt độ cao, sự thuỷ phân bởi các enzymeproteolytic, tác dụng của pH thấp, các chất oxy hoá hay chất khử, các chất gâybiến tính,các chất ức chế bất thuận nghịch…Tuy nhiên, các enzyme khácnhau có thể nhạy cảm với những tác nhân nêu trên ở các mức độ rất khácnhau

Trong sản xuất chế phẩm enzyme thì việc giữ được hoạt tính của enzyme

là một trong những yêu cầu hàng đầu.Thông thường qua mỗi bước tinh sạch

thì một phần enzyme cũng như hoạt động của chế phẩmbị mất đi, giá thànhcao lên do chiphí về thiết bị, nguyên liệu, công sức và do mất hoạt độ Vớienzyme dùng trong mục đích công nghiệp, không phải lúc nào cũng cần phếphẩm có độ tinh sạch cao,trong một số trường hợp có thể dùng phế phẩmenzyme ở dạng thô.

Để hạn chế tối đa sự giảm hoạt độ enzyme trong quá trình tinh sạch thìthường cần chọn dung dịch chiết rút enzyme thích hợp, vừa cho hiệu suấtchiết suất enzyme cao, vừa không làm biến tính enzyme Các bước tinh sạchthường được tiến hành ở nhiệt độ thấp ( khoảng 40C hoặc thấp hơn, tuỳ yếu

tố gây kết tủa) để vừa hạn chế sự biện tính enzyme cũng như tác dụng phângiải của các enzyme proteolytic có mặt trong dịch chiết.Đối với nhiềuenzyme,có thể bổ sung các chất ức chế của enzyme proteolytic vào dịch chiết

để hạn chế sự thuỷ phân đối với các enzyme quan tâm Các enzymeproteolytic được phân thành 4 lớp là:

+ protease serine

+ protease cystein

+ protease axit

+ protease chứa kim loại

Trên cơ sở của 4 lớp protease này, nhười ta cũng cha các chất ức chế củacác enzyme này theo 4 lớp tưong ứng Tuy vậy, do sự phổ biến của 2 loại

protease serine và protease cystein, nên việc bổ sung vào dịch chiết proteinenzyme các chất ức chế của hai loại protease này là phổ biến Trong một sốtrường hợp, đối với các enzyme nhạy cảm với các phân cắt proteolytic, thì cả

4 loại chất ức chế đều được sử dụng

Bổ sung các yếu tố làm bền ( như CaCl2, hay MgCl2 ở nồng độ 2-5mM,glycerol 10-20% ) chất chống oxy hoá, xây dựng quy trình tinh sạch đơngiản ít bước nhất cũng là những cách để hạn chế sự giảm hoạt động củaenzyme Đối với một số enzyme bền nhiệt thì có thể dùng bước xử lý nhiệt( 70-800C, trong vòng 15-30 phút) ở ngay giai doạn đầu để vừa hạn chế tácdụng phân cắt proteolytic, vừa loại bỏ một số protein không monh muốnkhác Tương tự có thể dùng bước xử lý axit 9 đưa pH xuống 3-4) ở giai đoạnđầu đối với các enzyme bền ở pH thấp

III Thu nhận chế phẩm enzyme thô

Ngoài trừ một số trường hợp enzyme quan tâm là enzyme ngoại bào từ

vi sinh vật ( enzyme được tiết vào môi trường trong quá trình nuôi cấy tế bào)

và các enzyme ngoại bào từ các dịch của động vật và thực vật, các trường hợpcòn lại, bước đầu tiên trong nghiên cứu enzyme là phải thu nhận dịch chiếtenzyme từ nguyên liệu.Để thu dịch chiết mô hoặc tế bào chứa enzyme, trướchết phải phá vỡ tế bào

Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiềuphương pháp.Các phương pháp phá vỡ tế bào thường được sử dụng để phá vỡ

tế bào như:

+ Phương pháp cơ học Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bộtthuỷ tinh, cát thạch anh, đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá…

+ Phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm …

+ Phương pháp hoá học như dùng các loại dung môi, butylic, aceton,glycerol, ethylacetate

Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm,dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theonhững phương pháp trên Dịch chiết thu được,người ta gọi là chế phẩmenzyme thô Sở dĩ gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này,ngoàienzyme ra còn có nước, protein không phải enzyme các thành phần của tếbào

Chế phẩm thu được ở các bước ban đầu này thường chứa rất nhiềuprotein và các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzyme quan tâm thấp Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độenzyme, hoặc được bổ sung tác nhân gây kết tủa protein enzyme để loại bỏmột số chất không mong muốn, sau đó hoà tan enzyme trong một thể tích nhỏdung dịch đệm thích hợp

Để kết tủa protein cho mục đích tinh sạch, người ta thường dùng dungmôi hữu cơ như ethanol hay aceton hoặc muối trung tính Các dung môi hữu

cơ khi thêm vào dung dịch nước sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch,

do đó làm thay đổi tính tan của protein và dẫn đến làm kết tủa protein Nồng

độ của các dung môi gây kết tủa protein thường từ 80% (V/V) trở lên Sự kếttủa có thể có tính chọn lọcmột phần, nghĩa là các protein khác nhau có thểđược kết tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi Dung môi hữu cơsau đó có thể được loại bằng cách cho bay hoi trong chân không, hay thậm chítrong hkông khí

Để kết tủa enzyme từ dịch chiết thô, người ta cũng có thể dùng một sốmuối trung tính, thường dùng nhất là ammonium sulfatese, do muối này cómức độ hoà tan rất cao trong nước, ít làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí còn

có tác dụng làm bền enzyme Một số ưư điểm nữa của muối ammoniumsulfate là khả năng kết tủa chọn lọc protein, do đó sẽ loại bỏ được nhiềuprotein không mong muốn trong dịch chiết Lưu ý khi sử dụng muốiammonium sulfate là phải bổ sung vào dung dịch enzyme một cách từ từ, kếthợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quá nhanh cục bộ của nồng độ muối,làm mất di tính kết tủa chọn lọc của nó, thậm chí có thể làm biến tính một sốenzyme kém bền Hạn chế của phương pháp sử dụng ammonium sulfate chính

là mất nhiều thời gian, do nồng độ ammonium sulfate cao nên tỷ trọng của

dung môi lớn, để kết tủa được các protein cần phải ly tâm ở tốc độ cao vànhiệt độ thấp, sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinhsạch tiếp theo.

IV/Các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme

*Khái niệm

Việc làm sạch enzyme chính là việc loại protêin không phải là enzyme,nước,các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme Công vịêc này hoàn toànkhông dễ dàng Do đó, việc làm sạch enzyme đòi hỏi người làm nghiên cứu

về enzyme, ngoài sự hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thaotác kỹ thuật khác nhau để tránh gây mất tính hoạt động của enzyme

Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chấtkhác, để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau

Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp thường dùng cácbiện pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặcbằng cách lọc qua gel sephadex

Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác,thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biện tính chọnlọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủaphân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các hpương phápsắc ký( sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion),điện di, phương pháp lọc gel

1/Phương pháp biến tính chọn lọc

Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính các loạiprotein tạp Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu axít và bềnnhiệt.Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-700C và pH <=5.Ởđiều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu được pH thấp sẽ

bị biến tính.Sau đó, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại

bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn

2/Phương pháp kết tủa phân đọan

Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2 SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau

về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theophần % nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầuprotein tạp của các dịch enzyme Các loại muối có thể được dùng là (NH4)2

SO4, Na2 SO4, MgSO4 người ta đã nhận thấy muối (NH4)2 SO4 là tốt nhất vì

nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme Loạimuối này lại rẻ và phổ biến Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở250C)

Phương pháp này chỉ dùng vói những enzyme ít bị biến tính bởi các dung môiđược chọn dùng Để giữ cho enzyme khỏi bị mất khả năng hoạt động, quátrình kết tủa phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (-50C)

3/Phương pháp hấp phụ chọn lọc

Người ta có thể cho chất hấp phụ trực tiếp vào dung dịch enzyme, hoặccho dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp phụ Chấthấp thụ được sử dụng rộng rãi là hyđrocyapatite Người ta có thể thực hiệnmột trong hai cách sau: hoặc là hấp phụ enzyme hoặc là hấp phụ protein tạp

Để tránh làm biến tính enzyme, người ta thường thực hiện quá trình hấp phụ ởnhiệt độ 00C.Sau khi hấp phụ, người ta lại tiến hành chiết enzyme (quá trìnhphản hấp phụ) bằng các dung môi thích hợp

4/Phương pháp sắc ký

* Phương pháp sắc ký trao đổi ion

Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước

hoặc dung dịch đệm loãng và tác nhân trao đổi ion, người ta áp dụng phươngpháp sắc ký trao đổi ion để làm sạch enzym Người ta thường sử dụng các tácnhân trao đổi ion sau:

- Nhựa trao đổi ion

- Dẫn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose,diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl-cellulose

Người ta thường sử dụng dietylaminoetylxelluloza (DEAE-cellulose)hơn cả Ưu điểm của DEAE-cellulose là với dịch chiết thích hợp ngoài tạp

chất protein còn có khả năng loại bỏ các tạp chất axit nucleic.Điều đó chophép không cần dùng đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó vàphức tạp như kết tủa protamin hoặc streptomixin sunfat thường được dùngtrước đây.

Sephadex là dẫn xuất của polysaccharide dextran.Trong chất này, cácphân tử của chúng thường liên kết vói nhau bởi các liên kết ngang nhờ tácdụng của epiclohydrin, tao thành “sàng phân tử” Số lượng liên kết ngang tạothành càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ.Khi tiến hành lọc,các chất phân tử có khích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào bên trong các hạtsephadex đã được ngâm trong dung dịch đệm, còn các phân tử có kích thướclớn hơn không có khả năng đi vào các hạt sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột.Vậy cơ sở của phương pháp lọc gel sephadex dựa vào sự khác nhau về kíchthước, hình dáng và phân tử lượng của các chất có trong hỗn hợp.Phươngpháp này được áp dụng rộng rãi trong kỹ thuật enzyme

* Phương pháp sắc ký cột

Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết Do đó dịch chiết enzyme được tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột

Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration) Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản

ứng với protein enzyme Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất

ưa nước (hydrophyl)

5/Phương pháp tách hệ hai pha nước

Cơ sở kỹ thuật này dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch hai pha không hòa tan vào nhau Các hệ hai pha đặc trưng bằng cách trộn các hệ dung môi vào nhau để tạo thành hai pha riêng biệt Hệ dung môi được sử dụng trong phương pháp này có thể là polymer/polymer như: polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc polymer/muối như PEG và

potassium phosphate, sodium sulphate, sodium phosphate, Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy phương pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch

protein Hệ hai pha nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách và tinh sạch các hỗn hợp, vì phân tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách các chất rắn ra khỏi các chất lỏng So với các phương pháp tinhsạch khác thì hệ hai pha nước có một số ưu điểm hơn như: có độ hòa tan trongnước của hai pha lớn (70-80%), đạt độ tinh sạch cao, hiệu suất cao, dễ dàng

sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử dụng

Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân tử và điện tích của đối tượng nghiên cứu, nồng độ và khối lượng phân tửcủa các polymer, nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các loại muối đa hóa trị như phosphaste hoặc sulphate

6/ Ngoài ra còn có các phương pháp :

- Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học

- Phương pháp sắc ký ái lực (affinity chromatography)

Hiện nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự có hiệu quả trong việc làm sạch enzyme.Do đó, việc làm sạch chỉ thật sự có hiệu quả khi ta biết lựa chọn các phương pháp riêng,kết hợp với nhau, tạo ra hệ thống phương pháp nối tiếp với nhau một cách hài hòa nhất

V/Quy trình sản xuất

1/Từ nguồn thực vật

a.Enzyme bromel

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm

sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ bromeliaceae,đặc biệt là ở cây dứa (thân và trái)

Enzyme bromelin có thể thu được từ trong thân, trong phần thịt quả vàtrong chồi quả Tùy theo nguồn thu nhận mà người ta phân biệt bromelin thânhay bromelin quả và bromelin thân là nhóm có giá trị kinh tế Ở mỗi bộ phậnkhác nhau trên cây dứa, bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo khácnhau

Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa Nó có khả năng thủy phânkhá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6-8 Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phângiải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họSung Enzyme bromelin có trọng lượng phân tử khoảng 33.000 DA, lớn gấp1,5 lần so với papain

Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelin khoảng từ 3 tháng trướckhi chín, trong đó hoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20 ngày tước khichín Khi trái chín, hoạt tính bromelin giảm xuống nhưng không mất hẳn

Bromelin còn có thể thu được từ trong thân dứa(trung bình có thể thuđược 3,6 kg bromelin từ 378l nước rút ra từ thân cây dứa.

Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện theo sơ đồ sau:

Sấy khô

Tinh sạch Dịch ly tâm

Kết tủa

Thu dịch enzyme thô

Quả dứa hoặc thân được xoay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, lytâm dịch lọc với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để lọai bỏ chát xơ sẽthu được dịch chiết có chứa bromelin

Các phương pháp tách bromelin

* Phương pháp kết tủa enzyme

Đối với enzyme protein cũng như các protein enzyme khác, để có thể thuđược enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân

tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặccác hoá chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước rakhỏi phân tử protein đó, giúp cho protein kết tủa xuống

Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa bromelin là acetone vàethanol, còn các hóa chất khác như các muối trung tính ở nồng độ cao cũng cóthể kết tủa được enzyme

Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết tủa bromelin từ thân và trái.Bromelin trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó

để sự kết tủa đạt hiệu quả cao thường tiến hành quá trình kết tủa trong điềukiện lạnh Như vậy, nước ép từ thân và trái dứa phải được làm lạnh ở 0-40C

và aceton tinh khiết ở 200C.Ethanol cũng được sử dụng để kết tủa protein vàhỗn hợp bromelin-ethanol cũng phải giữ ở điều kiện nhiệt độ lạnh Sau khi

thu được kết tủa, tủa bromelin phải đươc rửa bằng aceton và làm khô thậtnhanh để bromelin không bị biến tính.

Để có thể thu nhận enzyme, việc đầu tiên là phải phá vỡ tổ chức mô cóchứa enzyme bằng các nghiền mô để thu dịch chiết có chứa bromelin rồi sau

đó dùng các tác nhân khác nhau để kết tủa bromelin Những yếu tố chính ảnhhưởng đến hiệu suất và chất lượng của chế phẩm enzyme đó là:

- Nồng độ của ammonium sulfate

- pH của dịch chiết

- Nhiệt độ kết tủa

- Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết

* Phương pháp hấp phụ

Có thể sử dụng kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin

Cách làm: cho kaolin khô ( hoặc đã ngâm trương nở ) vào dung dịch

nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25 mg kaolin/ml dung dịch nước dứa Khuấyđều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa Tủa được gọi là bromelin-kaolin

* Phương pháp siêu lọc

Sử dụng màng FS 50PP có giá trị lọai trừ 30.000, diện tích màng 336

cm2

Dịch dứa sau ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá tr2inh này thêmnước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc Thu nhận tủa bằngcách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc.

Thu nhận bromelin bằng phương pháp sử dụng cacboxyl methylcellulose (CMC) Phương pháp tách bromelin bằng CMC cho phép thu đượcbromelin ở dạng bột trắng có họat tính cao, thời gain nhanh và đơn giản hơn

so với các phương pháp khác

Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin

Enzyme bromelin được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọcqua sephadex, phương pháp sắc ký

* Tinh sạch bằng phươg pháp thẩm tích.

Cân 1g enzyme thô, pha trong 10ml dung dịch đệm sodiumphosphate 0,03M có pH7,2 Sau khi tất cả enzyme đã hoà tan thì cho hỗn hợpvào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa 1L dung dịch đệm sodiumphosphate 0,03M, pH 7,2 Túi cellophane được chuẩn bị bằng cách trước khidùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự như trên Tiến hành thẩmtích trong 6 giờ và cứ sau 2giờ thay dung dịch đệm bên ngoài 1 lần Dungdịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng 1 máy khuấy từ Trong quátrình thẩm tích, để làm giảm sự biến tính của enzyme do nhiệt, người tathường tiến hành tinh sạch enzyme ở nhiệt độ thấp

* Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex.

- Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50

- Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-10

* Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký.

Bromelin thân được cho chảy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05cho 2 phân đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE,casein và glucagon

Bromelin thân và bromelin quả thô được cho chạy sắc ký gel trênsephadex G-75, tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên sulfoethyl sephadex chỉ cho một phân đoạn protein đơn có hoạt tính phân giảiprotein

b/ Enzyme papain :

Được tách từ nhựa trái đu đủ xanh, papain thuộc nhóm enzyme thuỷphân có nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiều nhất về tính chất và cơchế hoạt động papain là một sulfhydryl protease, đầu tiên đựoc tách ra bởiBals và cộng sự của ông, sau đó bởi Kimmel và Smith từ nhựa khô

Thu nhận nhựa đu đủ.

Điều kiện lấy nhựa.

Cây: đang sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh, thân cây mập mạp chonhựa nhiều

Quả: lấy ở những quả đang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng từ 1kg là tốt nhất

Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thcs vào giữa buổi sáng Khi độ ẩmkhông khí thấp, dòng nhựa chảy chậm và đặc, khó thu nhận

-Mùa khô: nhựa ít, đặc, nồng độ protein cao

-Mùa mưa: nhựa nhiêu, loãng, nồng độ protein thấp

Tiến hành :

- Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn ở trên cây

- Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vài đường theo quả ở chỗ đường kínhquả to nhất

- Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thuỷ tinh màu miệng rộng trong 4-6phút, sau khi lấy nhựa xong đậy nắp kín giữ trong tối

- Bảo quản lạnh:

- Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc công trùng lẫnvào

- Không nên trôn nhựa khô với nhựa tươi vì nó làm giảm chất lượng

- Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếpxúc vào da vì nó sẽ gây bỏng Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếpxúc với các dụng cụ làm từ kimloại nặng như sắt, đồng… vì nó làmbiến màu và giảm hoạt tính enzyme

- Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% độ ẩm.

Phương pháp thu nhận papain tinh khiết.

- Hoà tan nhựa đu đủ, mục đích là loại bỏ các chất nhựa, cặn, tạp lớn…

- Loại bỏ các chất không tan ở pH 9

- Quá trình phân đoạn bằng ammodium sulfute

- Quá trình phân đoạn bằng NaCl

- Kết tinh

- Tái kết tinh

- Sấy chân không

Phương pháp tinh sạch enzym tinh khiết.

* Phương pháp hấp phụ có chọn lọc.

Để thực hiện phương pháp này người ta cho dịch enzyme chảy từ từqua cột chất hấp phụ Khi đó, tùy theo khả năng tương tác của chất hấpphụ với từng loại enzyme, các enzyme khác nhau sẽ được hấp phụ trênchất hấp phụ với khả năng khác nhau Sau đó dùnf các dung dịch đệmthích hợp để chiết rúr enzyme ra khỏi cột Phương pháp hấp phụ thườngdùng để làm đặc dung dịch enzyme Có thể hấp phụ chọn lọc các enzymetheo 2 cách: