công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp các phương pháp và ứng dụng của Công nghệ sinh học thực vật

CHƯƠNG IV: CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ ỨNG DỤNG CNSH THỰC VẬT 8 TIẾT 4.1 Giới thiệu khái niệm và các lĩnh vực của CNSH TV 4.2 Giới thiệu các cơ sở và kỹ thuật sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thự

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

(SH3014)

Giảng viên hướng dẫn: ……

CHƯƠNG IV: CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ ỨNG DỤNG

CNSH THỰC VẬT (8 TIẾT)

4.1 Giới thiệu khái niệm và các lĩnh

vực của CNSH TV

4.2 Giới thiệu các cơ sở và kỹ thuật

sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các ứng dụng cụ thể

4.3 Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật và các hướng ứng dụng

KHÁI NIỆM CHUNG

Khái niệm CNSH Thực vật:

– Tất cả kỹ thuật để nâng cao và cải lương sản lượng, phẩm chất

– Sử dụng các cơ quan, mô, tế bào với thao tác mức độ phân tử,

ỨNG DỤNG CỦA CNSH THỰC VẬT

Nuôi cấy hạt phấn, tiểu

bào tử

- Sản xuất cây đơn bội

- Sản xuất các dòng lưỡng bội đồng hợp tử , nhờ đó mà giảm thơì gian lai tạo

- Tạo đột biến ở mức đơn bội

Thụ phấn In vitro - Tạo con lai mà khó tạo ra được bằng kỹ thuật cứu phôi

Nuôi cấy cơ quan - Bất kỳ cơ quan bộ phận nào của cầy đều có thể sử dùng làm vật liệu khởi

đầu cho nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy đỉnh sinh

trưởng (meristem)

- Sản xuất cây sạch bệnh virus

- Sản xuất công nghiệp các kiểu gen mong muốn

- Bảo quản in vitro nguồn gen

Phân hoá phôi vô tính

Phân hoá cơ quan

(Organogenesis)

- Là đường hướng tái sinh chủ yếu

- Nhân nhanh

- Bảo quản nguồn gen

Nuôi cấy tế bào - Tạo đột biến ở mức độ tế bào.

- Tạo tế bào trần để lai vô tính.

- Biến nạp gen.

- Nuôi cấy tế bào đơn

Nuôi cấy Callus - Một số trường hợp, quá trình tái sinh qua phôi vô tính hoặc cơ quan bắt

buộc phải trải qua giai đoạn tạo mô sẹo.

- Tạo các biến dị soma có ích (biến dị kiểu gen hoặc kiểu hình)

- Cung cấp protoplast và nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù

- Sản xuất các phức hợp hữu ích như dược phẩm, hương liệu, sắc tố, mùi

vị mà không cần phá huỷ cây mẹ

- Sản xuất các hợp chất đồng hoá mới không có trong cây

- Ứng dụng trong chuyển gen và nghiên cứu các cơ chế đồng hoá trong cây

ỨNG DỤNG CỦA CNSH THỰC VẬT

Nuôi cấy tế bào và

- Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp

- Phân lập các biến dị có ích với khả năng kháng bện, chống chịu stress tốt hơn

- Tạo các biến dị di truyền không qua lai hữu tính ở những dòng ưu tú

Đột biến in vitro - Cảm ứng tạo đa bội để tăng sinh khối hoặc năng suet

- Tạo biến dị di truyền , chọn lọc và nhân nhanh các đột biến có lợi

- Là công cụ để nghiên cứu di truyền phát triển và các quá trình sinh hoá

Tách, nuôi cấy và dung

hợp tế bào trần

- Sản xuất con lai xa, các dạng lai nhân và lai lai tế bào chất

- Tái tổ hợp các cơ quan tử

- Chuyển CMS

ỨNG DỤNG CỦA CNSH THỰC VẬT

Biến nạp di truyền Chuyển AND lạ để tạo các tổ hợp di truyền mới

- Chuyển các gen mong muốn vào cây trồng

- Nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen

- Cảm ứng lông rễ hoặc dạng chồi để sản xuất các hợp chất thứ cấp

- Tạo các sản phẩm dồng hoá mới không có trong cây mẹ ban đầu

Cảm ứng ra hoa in vitro - Rút ngắn chu kỳ sinh trưởng dài ở các cây lâu năm như cây tre

- Cung cấp hoa, quả, hạt trái mùa

Vi ghép - Khắc phục tính không tương thích khi ghép thông thường

- Nhân nhanh các dòng ưu tú

- Nhân nhanh và cứu ccs loài khó ra rễ

- Tạo cây sạch virus

ỨNG DỤNG CỦA CNSH THỰC VẬT

CƠ SỞ CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY

MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Giới thiệu về tÕ bµo thùc vËt

Học thuyết tế bào: Schleiden và Schwann (1839)

đã độc lập đưa ra kết luận:

Cơ thể thực vật và động vật đều do các tế bào hợp thành và

tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của tất cả mọi

cơ thể sống.

TẾ BÀO THỰC VẬT

1.TÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo

• Haberlandt (1992), lần đầu tiên đã quan niệm rằng: mỗi tế bào bất

kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để

• Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã

đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế

• Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở

2 Sự phân hoá và phản phân hoá

• Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy thực vật in vitrothực chất là kết quả phân hoá và phản phân hoá tế bào

• Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhấtbao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó cónhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tếbào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh

• Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh

thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau

Ví dụ:

– Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp,

– Mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ,

– Nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ,

• Sự phản phân hoá tế bào:

Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng chúngkhông hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình.Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp,chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phânchia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hoá tếbào, ngược lại với sự phân hoá tế bào

2 Sự phân hoá và phản phân hoá

Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá

Phản phân hoá tế bào

Tế bào dãn Phân hoá tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá

3 Môi tr-ờng nuôi cấy

Môi tr-ờng nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan trong nuôi cấy Có nhiều loại môi tr-ờng nuôi cấy cho các loại thực vật khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau Môi tr-ờng th-ờng bao gồm các thành phần chính sau

• Các chất điều tiết sinh trưởng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định kết quả nuôi cấy

• Auxin và xytokinin được sử dụng nhiều hơn cả trong nuôi cấy in vitro

• Auxin kích thích hình thành mô sẹo và tạo rễ bất định, kích thích sự dãn

của tế bào Các auxin thường sử dụng là 2,4 – Dicloro phenoxy axetic axit (2,4D),  -naphtylaxetic axit (  - NAA), Indolaxetic axit (IAA) Nồng độ sử

• Tỷ lệ Auxin/Xytokinin quyết định sự phân hóa của mẫu cấy theo hướng tạo

rễ, chồi hay mô sẹo.

MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA AUXIN VÀ CYTOKININ

TỔ CHỨC PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ

TẾ BÀO THỰC VẬT

60 m 2 )

mẫu

Kho (Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm)

Phòng phân tích

Các thiết bị phân tích tế bào, sinh

lý, sinh học, di truyền (30-40 m 2)

môi trường nuôi cấy;

- Chuẩn bị sơ bộ mẫu vật

trước khi cấy

Phòng cấy vô trùng

Buồng nuôi cây

Là buồng đặt các mẫu nuôi cấy

Buồng này cần đảm bảo các

(Chế độ nhiệt và ánh sánh hoàn toàn có

thể điều khiển được theo ý muốn.)

Hệ thống nhà màn, vườn ra cây

Các ứng dụng của công nghệ nuôi cấy mô

tế bào thực vật

Nhân giống vô tính in vitro ( Vi nhân giống cây trồng )

Nhân giống vô tính in vitro:

Là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh, từ các bộ phận, cơ quan như đoạn thân, lá, rễ của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Nhân nhanh in vitro đƣợc ứng dụng vào:

• Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống.

• Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác.

1 KHÁI NIỆM CHUNG

 Phương pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các cáthể tương đối đồng nhất về mặt di truyền

 Có thể nhân giống cây trồng ở qui mô công nghiệp (kể

cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương phápthông thường)

 Chủ động kế hoạch sản xuất

 Dễ dàng tạo được cây sạch virus

 Các cây sau nhân in vitro có xu hướng được trẻ hoá nâng cao hiệu quả nhân bằng các phương pháp thôngthường sau đó

ƢU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT NHÂN NHANH

IN VITRO

HẠN CHẾ

giống in vitro

CÁC BƯỚC CHÍNH TRONG NHÂN GiỐNG

ChuyÓn ra m«i tr-êng tù nhiªn

H×nh 27 C¸c b-íc trong nh©n c©y trång b»ng nu«i cÊy m«

Nguån: Robert N Trigiano Dennis J Gray, 2000

B-íc 3

• Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các

• Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh.

• Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.

BƯỚC 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

BƯỚC 1: Nuôi cấy khởi động

• Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt

• Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên hoá ( đỉnh chồi, mắt

BƯỚC 2: Nhân nhanh

 Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái

và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạthóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính

 Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiệnngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất Theonguyên tắc chung môi trường có nhiều xytokinin sẽ kíchthích tạo chồi Chế độ nuôi cấy thường là: 25-270C, 16giờ chiếu sáng/ ngày, cường độ ánh sáng 2000- 4000lux

BƯỚC 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Tạo rễ cho chồi:

trường tạo rễ có bổ sung một lượng nhỏ auxin

trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng

Đối với các phôi vô tính:

chất điều tiết sinh trưởng để mọc thành cây

BƯỚC 4: Thích ứng cây ngoài điều kiện tự nhiên

• Yêu cầu:

Đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt

• Điều kiện:

- Cây trong ống nghiệm đó đạt những tiêu chuẩn hình

thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây)

- Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước

- Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng

của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù

hợp

Cỏc phương thức nhõn giống vụ tớnh in vitro

Nuôi cấy chồi đỉnh

Nuôi cấy đoạn thân

Tạo chồi trực tiếp Tạo phôi trực tiếp

Cây từ phôi

Tạo chồi gián tiếp

Tạo phôi gián tiếp

Cây con

Phát sinh hình thái trực tiếp

Phát sinh hình thái gián tiếp

Hoạt hoá chồi nách

• Sự phát triển của chồi nách được kích thích bằng cách loại bỏ ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh

chồi và đoạn thân mang mắt ngủ Theo phương thức này sự phát triển chồi diễn ra theo hai cách:

nách Trường hợp này thường xảy ra khi nuôi cấy cây hai lá mầm như thuốc lá, khoai tây, hoa cúc

Trường hợp này hay gặp với cây 1 lá mầm như mía, lúa,

Tạo chồi bất định

• Trong trường hợp này cần phải thực hiện quá

bắt các tế bào soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo.

• ở các đối tượng một lá mầm như lan, dứa, chuối, hoa loa kèn thường gặp sự phát triển

một lúc mẫu cấy tạo thành hàng loạt protocorm,

thể này hoặc tiếp tục sản sinh protocorm

Protocorm của cây hoa loa kèn

Tạo phôi vô tính

• Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô

tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo.Nhưng phôi vô tính có cấu trúc lưỡng cực

• Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo.

Tạo phôi vô tính

• Sự hình thành phôi có 2 bước:

• Sự phân hoá các tế bào có khả năng phát sinh

phôi: cần môi trường giàu auxin Các tế bào có

khả năng phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein và ARN thông tin

• Sự phát triển của những tế bào phôi mới hình

thành: cần môi trường nghèo hoặc không có

auxin Nồng độ cao của auxin kích thích sự hình thành phôi vô tính nhưng ức chế quá trình phân hoá và phát triển tiếp theo của các phôi này

B A

Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính

• Có thể sử dụng các

một thể tích nhất định

để tạo hạt nhân tạo

• Alginate là polime tự

H¹t n¶y mÇm in vitro H¹t t¹o tõ ph«i v« tÝnh H¹t t¹o tõ protocorm H¹t n¶y mÇm in vitro

Callus ph«i ho¸

công nghệ sản xuất giống khoai tây sạch bệnh

 Hoàn toàn chủ động điều khiển sinh tr-ởng, phát triển, năng suất, chất l-ợng cây cấy

Điều khiển sinh tr-ởng, số củ và kích th-ớc củ

Che phủ nilon và t-ới nhỏ giọt

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MỚI TRONG SẢN

XUẤT CỦ NHỎ

Nhân nhanh cây giống và củ khoai tây

đạt hệ số nhân vƣợt trội

1T 2T 4T

Vi nh©n gièng

Sugar can

Nhân giống lan Hồ Điệp

Cây trầm Nuôi cấy chồi ngủ Tái sinh tạo chồi Nhân nhanh

CÂY TRẦM HƯƠNG

Tái sinh callus từ mô lá Tạo thể protocorm Tạo hạt nhân tạo Tạo cây hoàn chỉnh

Các ứng dụng của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

• Làm sạch bệnh virus bằng nuôi cấy mô

phân sinh đỉnh (meristem)

Phương pháp tạo cây sạch virus

• Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ hữu hiệu Có hai cách chính để tạo cây sạch virus nhờ cụng nghệ này:

• a) Dùng các phương pháp chẩn đoán bệnh

virus để thanh lọc các mẫu nhiễm bệnh trước

khi đưa vào nuôi cấy, sử dụng biện pháp nhân nhanh in vitro để nhân nhanh mẫu sạch

• (b) Làm sạch virus ở mẫu đó bị nhiễm, sau khi

đó tạo mẫu sạch thì tiếp tục sử dụng biện pháp

CÁC KỸ THUẬT LÀM SẠCH VIRUS IN VITRO

• Nuôi cấy meristem

• Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý

nhiệt

• Nuôi cấy meristem kết hợp với bổ sung

hóa chất

• Vi ghép

Nuôi cấy meristem-Nguyên lý

• Virus tồn tại ở mọi tế bào sống Tuy nhiên, những

nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet

(1950), Morel và Martin (1952) cho thấy:

• Nồng độ virus trong tế bào các cây bị bệnh

phụ thuộc và tốc độ phân chia tế bào và khả năng sinh trưởng của tế bào Tế bào càng

phân chia mạnh thì nồng độ virus càng thấp, nghĩa là những tế bào càng gần đỉnh sinh

trưởng thì càng chứa ít virus hơn

• Từ đây các ông đã đề xuất kỹ thuật: nuôi cấy

meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo ra cây

hoàn toàn sạch virut từ cây đã nhiễm bệnh

Nuôi cấy meristem-Nguyên lý

• Cụ thể:

• White (1934) đã sử dụng phương pháp lây nhiễm

quả cho thấy 2 cm ở đầu rễ hầu như không phát hiện ra virus.

• Limasset và Cornuet (1950) đã dùng phương pháp huyết thanh định lượng, chứng minh được sự tồn tại một gradient nồng độ virus từ các mô non đến

bằng không ở mô đỉnh và lá bao thứ nhất sau đó tăng dần, đạt cực đại ở lá thứ năm rồi giảm dần ở

Regions of the SM:

CZ - Central zone –vùng trung tâm

Center of shoot meristem; low rates of cell division; cells remain undifferentiated

PZ - Peripheral zone – vùng ngoại vi

Surrounds the CZ; rapid rates of cell division; cells can differentiate

Mô phân sinh đỉnh Lá bao sơ cấp

Các lớp tế bào

Chồi bên Meristem thực vật

Giả thiết về sự không tồn tại virus ở meristem

• Theo Mathews (1970), Wang et Hu (1980): meristem

(mô phân sinh đỉnh) không có virus có thể do các

lý do sau đây:

• Virus vận chuyển trong cây chủ yếu nhờ hệ mô

dẫn, hệ thống này không có ở mô phân sinh đỉnh.

• Trong sự phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus.

• Nồng độ auxin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép virus.

• Hệ thống vô hiệu hoá virus ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây.

Kỹ thuật tách và nuôi cấy meristem

• Tách chính xác meristem có kích thước < 0,3mm,

nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng phù

hợp để tái sinh thành cây nguyên vẹn Sau đó kiểm tra độ sạch virus ở cây tái sinh bằng các phương

pháp khác nhau để thu nhận được cây sạch bệnh.

Chuẩn bị mẫu Khử trùng mẫu cấy

Tách mẫu cấy Cấy mẫu

Tách Meristem

Sự hình thành chồi từ

meristem khoai lang

Ảnh hưởng của tổ hợp cytokinin và auxin

Củ từ cây sạch bệnh và bị bệnh virus

Nhân nhanh và duy trì tình trạng sạch

bệnh

• Sau khi đã tẩy sạch virus khỏi các mẫu

bị nhiễm virus thì việc nhân nhanh giống sạch bệnh và duy trì độ sạch virus của

giống có ý nghĩa quan trọng quyết

định

Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp

tế bào trần (protoplast)

Các ứng dụng của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

• Tế bào trần (protoplast) là tế bào

thực vật bị tách bỏ thành tế bào,chỉ

còn phần nguyên sinh chất, nhân,

các cơ quan tử khác và màng sinh

chất là ranh giới phân biệt bên trong

và bên ngoài tế bào trần

• Kỹ thuật tách protoplast do Cocking

khởi xướng(1960), sau đó đã được

cải tiến và sử dụng thành công trên

nhiều đối tượng cây trồng khác

nhau Đặc biệt là trên các cây họ cà

và họ hòa thảo

• Protoplast là cơ sở quan trọng cho

các biện pháp lai soma và chuyển

nạp gen nhằm cải tạo các giống cây

Giới thiệu chung