Chuong 2 sinh học phân tử

Xây dựng thư viện genomic DNAToàn bộ bộ gene DNA của sinh vật được thu nhận, phân cắt ra các mảnh nhỏ và tạo dòng chocác mảnh nhỏ đó.. Xây dựng thư viện genomic DNA• Phân cắt bộ gene để

CHƯƠNG 2

NGUYÊN LÝ VÀ KỸ THUẬT

TÁCH DÒNG

Nguyên lý:

Quá trình phân tách một đoạn DNA định trước và

thu nhận rất nhiều các phiên bản của nó in vitro.

Mục đích:

• Thiết lập ngân hàng gen

• Thiết lập ngân hàng cDNA

• Sản xuất protein, enzyme, vaccine, kháng sinh, v.v

Bước 1: Tách chiết và xử lý các đoạn DNA cần tạo dòng.

• Các DNA cần tạo dòng thường là các đoạn DNA chứa gene hoặc một phần của gene, cũng có

thể là các phân đoạn DNA của 1 bộ gene, các

oligonucleotides tổng hợp hóa học Sản phẩm

tạo dòng được phân lập cũng có thể lại được

đưa vào một vector mới, và quá trình này đượcgọi là tạo dòng “thứ cấp” (subcloning)

• Xác định DNA cần tạo dòng theo mục đích sử

dụng cụ thể của sản phẩm tạo dòng Ví dụ như

để nghiên cứu đặc tính hay tạo sản phẩm

protein của 1 gene nhất định, hay để giải mã cả

1 bộ gene

2.1 Tạo dòng cho 1 gene nhất định

• Vấn đề: Tách gene cần thiết đó khỏi các DNA

khác trong bộ gene đang nghiên cứu Æ Khôngđơn giản

A/ Biết thông tin chuỗi DNA của gene

Ví dụ như biết vị trí của gene này trong 1 bộ gene

đã được giải mã Æ tìm trên cơ sở dữ liệu của bộgene các thông tin về chuỗi DNA của gene đó cũngnhư của khu vực “đầu nguồn” và “cuối nguồn”

Hoặc chuỗi DNA của gene tương tự ở các sinh vật

“họ hàng” hay chuỗi protein mã hóa bởi gene này

2.1 Tạo dòng cho 1 gene nhất định

A/ Biết thông tin chuỗi DNA của gene (tiếp)

Æ Thiết kề mồi PCR đặc hiệu để nhân bản chínhxác khu vực (chuỗi DNA) của gene nghiên cứu

và từ đó tách nó ra khỏi các đoạn DNA khác (Sẽ học kỹ hơn ở phần kỹ thuật PCR)

2.1 Tạo dòng cho 1 gene nhất định

B/ Chưa biết thông tin chuỗi DNA của gene

ÆXây dựng thư viện DNA (DNA library): thu nhận

các phân đoạn DNA từ sinh vật đang nghiên

cứu và tạo dòng cho từng phân đoạn đó bằngmột vector thích hợp Thư viện DNA là tập hợpcác dòng (clones), mỗi dòng chứa một phần bộgene của sinh vật nghiên cứu

Mảnh DNA chứa gene cần nghiên cứu sẽ đượctìm ra qua quá trình tìm kiếm, chọn lọc dùng thưviện DNA

Thư viện DNA cần đủ lớn để đảm bảo trong đó

có 1 dòng chứa gene ta đang quan tâm

2.1.1 Xây dựng thư viện DNA

• Có 2 loại thư viện cơ bản: genomic (bộ gene) và

cDNA (complementary DNA- DNA tương thích).

1/ Thư viện genomic DNA: là tập hợp của các

dòng tái tổ hợp đại diện cho toàn bộ bộ gene

của 1 sinh vật nhất định

Thư viện này không chỉ chứa khu vực mã hóa

protein của gene mà còn chứa các khu vực DNA giữa các gene có thể có vai trò điều khiển hoạtđộng của các gene

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

Toàn bộ bộ gene DNA của sinh vật được thu

nhận, phân cắt ra các mảnh nhỏ và tạo dòng chocác mảnh nhỏ đó

Bộ gene

Vector

BamHI

Thư viện genomic DNA

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

• Phân cắt bộ gene để xây dưng thư viện

a/ bằng phương pháp cơ học (DNA shearing)

dùng lực cơ học (thông qua lực thủy động học,

vi sóng) để phân cắt phân tử DNA ra các mảnhnhỏ một các ngẫu nhiên

Nhược điểm: có khoảng phân bố kích thước

của các mảnh DNA rộng, có thể làm hỏng cấu

trúc hóa học của các mảnh DNA, độ lặp lại thấp, khó ghép thẳng vào vector (do tạo ra đầu tù ở

các mảnh DNA)

Một số thiết bị và phương pháp thực nghiệm

mới có thể khắc phục được các nhược điểm

trên

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

• Phân cắt bộ gene để xây dưng thư viện

b/ bằng enzyme giới hạn:

Enzyme giới hạn – các endonuclease loại II

Chúng nhận biết và cắt các điểm nhất định trongchuỗi DNA

Phân loại Mức Phổ biến Điểm tác dụng Ứng dụng trong công nghệ DNA tái

tổ hợp

Loại I Ít hơn loại II Cắt 2 nhánh DNA ở vị trí

không nhất định cách điểm nhận dạng từ 1000 bp trở lên

Ít ứng dụng

Loại II Phổ biến Cắt 2 nhánh DNA ở 1 vị trí

nhất định là điểm nhận dạng (cỡ 4-8bp).

Ứng dụng rất nhiều

Loại III Hiếm gặp Cắt 1 nhánh DNA, ở vị trí

24-26 bp phía dưới điểm nhận dạng

Ít ứng dụng

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

• Phân cắt bộ gene để xây dưng thư viện

b/ bằng enzyme giới hạn:

Tác động của enzyme giới hạn EcoRI

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

• Phản ứng của enzyme giới hạn (RE)- các thànhphần:

- DNA: phải có điểm giới hạn; không bị lẫn tạp chất như

phenol, alcohol, hay quá nhiều muối.

- RE: chú ý RE thường dễ mất hoạt tính Æ luôn để dd RE

trên đá.Dùng trong dd đệm tiêu chuẩn Thêm RE cuối

cùng vào hỗn hợp phản ứng RE thường được bảo quản

lượng RE không quá 10% tổng thể tích phản ứng.

- DD Đệm: đúng nồng độ ion và pH tối ưu cho enzyme; Tris

và mô phỏng điều kiện trong tế bào, 0.025% Triton X-100 (chất tẩy rửa)- để giữ proteins và DNA dính vào thành ống nghiệm phản ứng.

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

• Phản ứng của enzyme giới hạn (RE)- các thànhphần:

- BSA (serum albumin): một số enzyme giới hạn đòi hỏi

yếu tố này để có hiệu suất tối ưu.

- Nước: môi trường phản ứng và để pha các chất đúng tỷ

lệ.

Một số enzyme giới hạn khác

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

b/ Phân cắt bộ gene bằng enzyme giới hạn:

Các yếu tố cần chú ý để tạo dòng được cho gene:

• Số dòng: xác định thư viện cần bao nhiêu dòng

để đảm bảo có chứa gene ta quan tâm

Tính xác suất:

N= ln(1-P)/ ln(1- f/g) (1)trong đó: N- số dòng, P- xác suất của 1 gene cómặt, f- kích thước trung bình của 1 mảnh DNA, g- kích thước của bộ gene

f – phụ thuộc vào kích thước điểm nhận dạng

của enzyme giới hạn

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

b/ Phân cắt bộ gene bằng enzyme giới hạn:

Công thức (1) giả sử các phần khác nhau trong 1

bộ gene có cơ hội tạo dòng thành công như nhau

Do một số nguyên nhân( ví dụ do sự xuất hiện

ngẫu nhiên của các điểm giới hạn nên gene có thểnằm ở mảnh DNA kích thước lớn và dẫn đến ít cókhả năng xuất hiện trong thư viện DNA), giả địnhtrên thường sai và người ta phải chuẩn bị số dòngtrong thư viện gấp 2-3 lần số dòng lý thuyết cần có

để đảm bảo có sác xuất cao tìm thầy gene cần

thiết

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

b/ Phân cắt bộ gene bằng enzyme giới hạn:

• dùng phân cắt không toàn bộ:

Nếu gene cần nghiên cứu chứa 1 hay nhiều hơnđiểm nhận dạng của enzyme giới hạn dùng để xâydựng thư viện, thì gene đó sẽ bị chia cắt thành 2hay nhiều dòng và sẽ không được phát hiện khi

chọn lọc từ thư viện

Do đó, thư viện genomic DNA thường được xâydựng bằng cắt phân cắt không toàn bộ bằng

enzyme giới hạn

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

• dùng phân cắt không toàn bộ:

B: điểm giới hạn của enzyme BamHI, S: điểm giới hạn của enzyme Sau3AI (a)- một phần của bộ gene có chứa 2 gene

có các điểm B và S; (b)- thư viện tạo ra bằng phân cắt toàn

bộ dùng enzyme BamHI; (c)- thư viện tạo ra bằng phân cắt không toàn bộ dùng enzyme Sau3AI.

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

• dùng phân cắt không toàn bộ:

Để thực hiện việc phân cắt không toàn bộ thì phảnứng giới hạn được diễn ra ở điều kiện không tối

ưu để enzyme giới hạn không cắt hết tất cả nhữngđiểm giới hạn của nó Thường người ta giảm nồng

độ enzyme hoặc thời gian phản ứng hoặc giảm cảhai yếu tố đó

2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA

• Ưu điểm của thư viện genomic DNA:

Có khả năng thu nhận được đầy đủ đại diện của

bộ gene, do đó thường đảm bảo sẽ tạo dòng

cho gene cần nghiên cứu và các yếu tố điều

khiển của nó

• Nhược điểm của thư viện genomic DNA:

- Đòi hỏi số dòng tạo ra tương đối lớn, do đó chi phí cao nhất là khi thực hiện đối với các bộ gene lớn như bộ gene của các sinh vật bậc cao

- Các mảnh DNA thu được từ sinh vật có nhân

tế bào thường có chứa intron và sẽ không đượcbiểu hiện khi biến nạp vào vi khuẩn nên đòi hỏibiện pháp chọn lọc đặc biệt

2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA

• Để khắc phục các nhược điểm trên của thư việngenomic DNA, người ta có thể xây dựng thư

viện DNA từ mRNA

Chỉ một phần của bộ gene được phiên mã

thành mRNA ở 1 loại tế bào nhất định và ở 1

giai đoạn phát triển nhất định và trong các

mRNA này thì các intron (nếu có) đã được loại

bỏ

• Không thể tạo dòng trực tiếp từ mRNA, bởi vì

mRNA chỉ có 1 nhánh nucleic acid và nó khôngthể gắn trực tiếp vào vector (vì không phải là cơchất của enzyme DNA ligase)

2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA

• Các bước xây dựng thư viện cDNA:

a/ thu nhận các mRNA

b/ tổng hợp phiên bản DNA của các mRNA –tạo

ra các DNA tương hợp (cDNA)

c/ các cDNA được gắn vào vector và biến nạp

vào sinh vật chủ (ví dụ E.coli) để tạo ra thư viện.

a/ thu nhận mRNA:

quá trình: phá vỡ tế bào Æ loại bỏ các tạp chất cơbản Æ phân lập toàn bộ RNA của tế bào Æ phântách mRNA khỏi các loại RNA khác như tRNA,

rRNA

2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA

a/ thu nhận mRNA:

Để phân tách mRNA khỏi các loại RNA khác, người

ta tận dụng đặc điểm của mRNA từ các sinh vật cónhân tế bào là phần đuôi (đầu 3’) của chúng có

đoạn poly-A nên có thể phân tách mRNA ra bằngcách cho RNA tổng số của tế bào chẩy qua cột cócác oligonucleotide poly-T gắn cố định

2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA

a/ thu nhận mRNA:

(a) toàn bộ RNA tế bào chẩy qua cột có chứa oligonucleotide polyT cố định; (b) đuôi polyA của mRNA gắn với các polyT cố định trên cột; (c) các RNA khác được rửa ra khỏi cột; (d) mRNA tinh sạch được rửa ra khỏi cột bằng dd đệm với nồng độ muối loãng.

2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA

b/ tổng hợp cDNA:

(a) dùng mồi oligonucleotide polyT để bắt đầu phản ứng tổng hợp cDNA dùng mRNA làm khuôn xúc tác bởi Reverse transcriptase; (b)enzyme RNAse H thêm vào để loại bỏ một phần các nhánh mRNA; (c) các phần nhỏ RNA còn lại là mồi cho phản ứng tổng hợp nhánh DNA kia bởi DNA polymerase I và cac mồi RNA sẽ bị loại bỏ bởi enzyme này; (d) DNA ligase dùng để nối kết các vị trí cắt cón sót lại và tạo ra nhánh DNA mới hoàn chỉnh (e).

2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA

c/ gắn cDNA vào vector:

Điểm khác của cDNA so với các mảnh DNA đượcphân cắt bởi đa số enzyme giới hạn là các cDNAkhông có đầu dính, do đó khó gắn trực tiếp vàonhiều loại vector Một giải pháp thường dùng chovấn đề này là gắn thêm các đoạn nối (linker) hoặcđoạn thích ứng (adaptor) vào hai đầu cuối của

cDNA

2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA

c/ gắn cDNA vào vector:

• gắn đoạn nối (linker):

điểm giới hạn BamHI

gắn linker bằng ligase

cắt bởi BamHI

(a) linker tạo bởi 2 nhánh oligonucleotide tương hợp lai tạo thành phân tử 2 nhánh đầu tù (b) có chứa điểm giới hạn; (c) pha trộn với

dd có nồng độ cao các mảnh DNA đầu tù (cDNA) nhiều linker sẽ được nối vào mỗi đầu của phân tử DNA; (d) cắt phân tử mới tạo ra bằng

enzyme giới hạn sẽ loại bỏ các linker dôi ra và tạo ra sản phẩm có đầu tù.

Nhược điểm: nếu trong mảnh cDNA cũng có chứa điểm giới hạn thì nó cũng bị phân cắt.

2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA

c/ gắn cDNA vào vector:

• gắn đoạn thích ứng (adaptor):

điểm giới hạn BamHI

(a) adaptor tạo bởi 2 oligonucleotide giống nhau và không có nhóm 5’ P

để chúng không nối đuôi vào nhau (b) phân tử lai tạo được cắt bởi enzyme giới hạn để tạo ra phân tử adaptor có 1 đầu tù và 1 đầu dính (c); (d) adaptor được nối vào đầu tù của cDNA

đầu tù của BamHI

2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA

• Nhược điểm của thư viện cDNA:

Không có các yếu tố điều khiển quá trình giải mãcủa gene nên có khi khó biểu hiện được gene cầnnghiên cứu trong sinh vật chủ khác