Tài liệu Sinh học phân tử

2.3: Tạo vector tái tổ hợp• Vector tái tổ hợp được tạo ra bằng việc nối tạo liên kết hóa trị bền vững vector đã qua xử lý với đoạn DNA ngoại lai insert.. 2.3: Tạo vector tái tổ hợpPhản ứ

CHƯƠNG 2

NGUYÊN LÝ VÀ KỸ THUẬT

TÁCH DÒNG

Cách tiến hành dòng hóa

- Bước 1: Tách chiết và xử lý các đoạn DNA cần tạo dòng

- Bước 2: Chọn và xử lý vector

- Bước 3: Tạo vector tái tổ hợp (DNA tái tổ hợp), bản thiết kế vector-DNA nhân dòng

- Bước 4: Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ

- Bước 5: Nuôi cấy, tạo dòng và xác định dòng

cần tìm

- Bước 6: Kiểm tra và thu nhận sản phẩm của

gen tái tổ hợp

2.3: Tạo vector tái tổ hợp

• Vector tái tổ hợp được tạo ra bằng việc nối (tạo

liên kết hóa trị bền vững) vector đã qua xử lý với

đoạn DNA ngoại lai (insert)

• Phản ứng nối các phân tử DNA cần enzyme DNA ligase

DNA ligase xúc tác quá trình tạo liên kết

phosphodiester giữa nhóm 5′-phosphate của 1

nucleotide của 1 đoạn DNA và nhóm 3′-hydroxyl của đoạn DNA kia

Enzyme DNA ligase thường được dùng nhất là T4 DNA ligase (thu từ bacteriophage T4)

2.3: Tạo vector tái tổ hợp

Phản ứng nối các phân tử DNA dùng DNA ligase:

(a) 2 phân tử DNA tạo ra từ phản ứng cắt với EcoRI; (b) Liên kết

hydrogen giữa các base tương hợp làm 2 phân tử tạm thời dính

với nhau; (c) 2 phân tử được tạo liên kết hóa trị ở nhánh trên bởi DNA ligase, phần hở ở nhánh dưới có thể được nối lại bởi DNA ligase hoặc bằng cơ chế sửa chữa DNA của tế bào chủ.

2.3 Tạo vector tái tổ hợp

• Phản ứng dùng DNA ligase đòi hỏi ATP là nguồn năng lượng hóa học

• T4 DNA ligase cũng có thể giúp nối các phân tử DNA có đầu tù, nhưng hiệu suất phản ứng thấp Æyêu cầu nồng độ enzyme lớn hơn trong các

phản ứng in vitro.

• Chú ý cần làm mất hoạt tính hay loại bỏ enzyme giới hạn trước khi thực hiện phản ứng nối DNA

• Trong phản ứng nối của plasmid và phân đoạn DNA cần tạo dòng xúc tác bởi DNA ligase có các trường hợp sau xẩy ra:

2.3 Tạo vector tái tổ hợp

(c) 1 đoạn DNA cần tạo dòng nối vào vector- kết quả mong đợi; (d) 2 đầu dính của vector được nối lại và không có đoạn DNA mới được gắn vào; (e) các đoạn DNA được gắn với nhau ngẫu nhiên

và không gắn vào vector

2.3 Tạo vector tái tổ hợp

Quá trình tạo vector tái tổ hợp với vector khác plasmid

a/ với bacteriophage λ

Tách λ DNA

Cụm gene

Tay λ

Cắt vector và DNA ngoại lai bằng 1 enzyme giới hạn

Nối DNA (ligation) Nạp vector mới vào áo

phage in vitro

2.3 Tạo vector tái tổ hợp

Quá trình tạo vector tái tổ hợp với vector khác plasmid b/ với YAC vector

DNA ngoại lai

Nối DNA (ligation)

2.4 Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ (biến nạp vector -transformation).

• Các loại tế bào chủ có năng lực cao trong thu

nhận DNA từ bên ngoài gọi là tế bào chịu biến nạp hay tế bào khả biến (competent cell) Hiện tượng một tế bào tiếp nhận DNA ngoại lai gọi là hiện tượng chịu biến nạp (competency) của tế bào

• Tế bào chủ thường dùng trong kỹ thuật tạo dòng

và DNA tái tổ hợp là tế bào vi khuẩn E.coli

• E.coli không có khả năng khả biến tự nhiên

(khác với 1 số vi khuẩn khác) nên nó cần được

xử lý đặc biệt để di nạp DNA bên ngoài Có 2

phương pháp biến nạp chính

2.4.1 Biến nạp DNA bằng ph pháp hóa học

E.coli được nuôi cấy và thu nhận ở giai đoạn phát triển

log; tế bào được ly tâm và rửa vài lần dd lạnh chứa ion

hóa trị 2, thường là CaCl 2 ; sau đó các tế bào khả biến này được hòa trong 1 lượng nhỏ dd đệm để tiếp nhận DNA.

Thêm plasmid

4 o C 30 phút

Tế bào khả biến

Sốc nhiệt

42 o C 1 phút Phục hồi37o C 30 phút

Thêm dịch nuôi cấy

Trải trên đĩa thạch chọn lọc, 37 o C 16 giờ

2.4.1 Biến nạp DNA bằng ph pháp hóa học

• Cơ chế: DNA từ bên ngoài kết nối với

lipopolysaccharide ở màng tế bào của tế bào

khả biến và các DNA được đưa vào tế bào qua

sự “dò dỉ” của màng tế bào bởi tác dụng của

Ca2+ và sốc nhiệt

• Hiệu suất của tế bào chịu di nạp phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó, quan trọng nhất là chủng

E.coli được sử dụng.

• Nhược điểm: hiệu suất biến nạp thấp, tốn thời gian ( xử lý với CaCl2), mỗi loại tế bào cần 1 quá trình riêng, và thường không dùng cho tế bào

động vật, thực vật được

2.4.1 Biến nạp DNA bằng ph pháp hóa học

• Ví dụ của quy trình xử lý E.coli bằng pp hóa học:

1) Nuôi cấy 1 ml vi khuẩn E coli đã nuôi qua đêm vào 100 ml môi trường SOC.

SOC: Tryptone 20g, yeast extract 5g, NaCl 10mM, KCl 2,5mM, MgCl2 10mM, MgSO4 10mM, glucose 20mM

2) Ủ ở 37 0 C cho đến khi đủ mật độ tế bào, lắc nhẹ nhàng khi ủ.

3) Chuyển sang ống đã tiệt trùng Để trên nước đá 10 - 15 phút.

4) Quay li tâm 1.000 ×g trong 15 phút ở 4 0 C.

5) Đổ bỏ nước mặt, chỉ để lại chút nước không thể rót bỏ hết được, lật úp ống, gõ nhẹ lên mặt giấy thấm một số lần cho hết nước mặt thì tốt.

6) Cho vào ống 30 ml dung dịch CPG đã làm lạnh, trộn đảo nhẹ.

Dung dịch CPG chứa CaCl2.2H2O 50mM, KCl 100mM, glycerol 10% (w/v) và CH3COOK (pH 7,5) 10mM, điều chỉnh pH cuối cùng đến 6,2, hấp cao áp tiệt trùng (hoặc lọc qua lọc vi khuẩn 0,2 µm).

7) Để trên nước đá khoảng 30 phút.

8) Quay li tâm 1.000 ×g ở 4 0 C trong 15 phút.

9) Bỏ nước mặt, chỉ để lại ít giọt dịch không thể rót bỏ hết.

10) Hòa vào 8 ml CPG đã làm lạnh (Glycerol có trong thành phần dung dịch CPG

là chất chống đóng băng, ngăn trở sự hình thành các tinh thể nước đá càng lạnh sâu càng tăng thể tích và có khả năng chọc thủng tế bào vi khuẩn).

11) Rót khoảng 0,2 - 1,0 ml vào ống có nắp (cryo vial, ống Eppendorf 1,5 hay 2,0 ml), đậy kín rồi làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng Bảo quản trong nitơ lỏng hoặc ở

−70 0 C.

2.4.2 Biến nạp DNA bằng pp điện biến nạp (electroporation)

• Các tế bào vi khuẩn được thu hoạch và rửa như trong pp trước nhưng với nước cất lạnh hoặc dd đệm với nồng độ ion rất thấp 1 mẫu nhỏ của dịch huyền phù đặc chứa các tế bào được trộn với

DNA ngoại lai trong 1 cuvette đặc biệt và 1 xung điện ngắn với điện thế (voltage) rất cao được đưa qua dịch huyền phù đó

• Ưu điểm: hiệu suất biến nạp cao hơn pp hóa học;

có thể sử dụng cho tế bào động vật và thực vật

• Tuy vậy hiệu suất biến nạp nhìn chung vẫn rất

thấp

Edit your company slogan

Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo

thành dịch huyền phù và cho vào trong một

cuvette nhựa có điện cực..

Multiporator với các cuvette

và đệm chuyên dụng cho biến nạp (transfection).

Cuvet nhựa với hai điện cực

alluminum bên trong.

Có 3 kích thước:

Dung tích 100µl (độ rộng của khe

giữa hai điện cực là: 1mm)

Dung tích 400µl (độ rộng của khe

giữa hai điện cực là 200)

Dung tích 800µl (độ rộng của khe

giữa hai điện cực là 4mm).

Đóng gói riêng từng chiếc và được

khử trùng bằng tia gamma.

Thành cuvet được cấu tạo dưới dạng

nhám, dễ dàng ghi chú hoặc đánh dấu

Các cuvette của máy xung gen

Electroporator 2510

Ðể tạo ra xung điện cao thế trong

một thời gian ngắn người ta sử

dụng một thiết bị gọi là máy xung

gen (gene pulser).

Chức năng chính

- Biến nạp bằng xung điện vi khuẩn, nấm

hay các vi sinh vật khác - Dung hợp tế

bào với các tế bào động vật, thực vật,

nấm

Các thông số kĩ thuật

• Nặng khoảng 5,5 kg,

• Kích thước chỉ 25x35x12 cm (chỉ lớn

hơn trang giây A4 một ít)

• Xung điện cao trong thời gian cực ngắn

(tới 1200 V trong 5µs) Với khoảng thời

gian cực ngắn, tế bào đủ để nhận được

DNA/RNA/Protein ngoại lai mà khả

năng sống lớn

Multiporator – Máy xung điện

đa năng của Eppendorf

Hiệu suất của điện biến nạp

hợp, tuy nhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều

thường lên tới 70-90%.

Hiệu suất của phương pháp này phụ thuộc vào các yếu

tố sau:

- Nồng độ tế bào chủ.

- Nồng độ DNA tái tổ hợp.

- Giai đoạn phát triển của tế bào (tế bào quá già hoặc quá non đều không thích hợp).

- Môi trường dung dịch đệm.

- Cấu trúc màng tế bào.

- Độ mạnh của điện trường tác động khác nhau đối với

các loại tế bào khác nhau.

- Độ dài của thời gian (thời gian ngắt xung - ms)