sinh hoc phan tu

Một số ứng dụng của PCR trong y học • Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy mẫu đem phân tích... I.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR• Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đ

• I Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR

• II Nguyên lí hoạt động của PCR

• III Một số ứng dụng của PCR trong y học

• Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR

trong việc lấy mẫu đem phân tích

I.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR

• Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu

trong tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ

Karry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật

tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR)

vào năm 1985 PCR là phương pháp in

vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với

sự tham gia của DNA polymerase

• Phản ứng PCR được thực hiện

qua 3 giai đoạn trong 1 chu kì:

- Giai đoạn biến tính

(denaturation)

- Giai đoạn bắt cặp (annealing)

- Giai đoạn kéo dài

(elongaction)

Chu kì này được lặp đi

lặp lại từ 20 - 40 lần và cho ra

các sản phẩm cuối cùng của

PCR là các đoạn DNA hoặc

RNA phiên bản Số lượng các

bản sao này được tính theo

hàm số mũ.

Máy PCR

II.Nguyên lí hoạt động của PCR

1 Các thành phần tham gia vào

- Giai đoạn bắt cặp (annealing)

45 thoi gian 20s-2phut

- Giai đoạn kéo dài (elongaction)

nhiệt độ 68-72

Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy

mẫu đem phân tích

Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR

• 1 Lấy mẫu : ADN có thể

tách chiết từ những mẫu

khác nhau, như máu tươi,

máu khô, tế bào niêm mạc,

nước xúc miệng, tóc, da,

phân, v.v Mẫu có thể lấy

tại chỗ hoặc gửi từ xa hàng

nghìn kilômet, mất nhiều

ngày, trong phong bì bình

thường, qua bưu điện, không

cần bảo quản lạnh

Lấy mẫu đem phân tích

• 2 Tách chiết ADN : Nhiều

quy trình tách chiết ADN

khác nhau của thế giới đã

được nghiên cứu, thử

nghiệm và thích ứng với

điều kiện nước ta Do vậy,

góp phần giảm giá thành,

tiết kiệm kinh phí Với

mỗi loại mẫu có một quy

trình tách chiết thích hợp

riêng Đảm bảo chất lượng

và số lượng ADN từ

Tách chiết ADN

• 3 Nhân ADN đặc hiệu : Đây

là khâu quan trọng nhất của

quy trình Các hỗn hợp hoá

chất khác nhau và các chu

trình nhiệt khác nhau đã

được thử nghiệm cho từng

cặp mồi Trên cơ sở đó, đã

tối ưu hoá thành phần của

từng hỗn hợp, từng chu trình

nhiệt cho từng cặp mồi, dựa

vào những hoá chất sẵn có

trên thị trường trong nước

Nhân ADN đặc hiệu

• 4 Điện di : Điện di được

dùng để tách biệt các đoạn

ADN có độ dài ngắn khác

nhau Độ tách biệt này phụ

thuộc nhiều yếu tố Các yếu

tố đã được lựa chọn và tối

ưu hoá trên cơ sở vật liệu

sẵn có, hạ giá thành đáng kể

và tăng độ phân giải lên

hàng trăm lần, giúp phân

biệt rõ các đoạn ADN chỉ

chênh lệch nhau bốn

Điện di

• 5 Nhuộm màu ADN: Chất

lượng điện di và kết quả

nhân ADN đặc hiệu chỉ có

thể hiện rõ trên bản gel với

quy trình nhuộm ADN

được tối ưu hoá và phương

pháp nhuộm thích hợp

được lựa chọn Ngoài ra,

kinh nghiệm và kỹ năng

của kỹ thuật viên cũng rất

cần thiết, góp phần hạ giá

thành chung

Nhuộm màu ADN

• 6 Phân tích kết quả: Bản gel

sau khi nhuộm xong sẽ có

dạng như hình trên Các đoạn

ADN có độ dài khác nhau

hiện rõ trên bản gel, có thể

như thế đã được phân tích và

hiện được lưu giữ tại Phòng

Phân tích kết quả

III Một số ứng dụng của PCR

trong y học

1 Xách định quan hệ huyết thống

• Để xác đinh quan hệ huyết thống giữa hai

người, có thể lấy ADN tách chiết từ những mẫu khác nhau như: máu tươi, máu khô, tế bào viêm mạc miệng

• Có hai cách để lấy mẫu đem phân tích đó là:

Cách thu thập mẫu ADN bằng tăm bông

•  Xúc miệng bằng nước sôi để nguội cho thật sạch,

khoảng mười lần

 Lấy một que tăm bông trong phong bì có tên

mình, không chạm tay vào đầu có bông Há rộng

miệng, đưa đầu bông vào phía trong má rồi chà xát đầu bông vào thành má lên xuống tối thiểu mười

lần, vừa chà xát, vừa xoay tròn đầu tăm bông để

toàn bộ các mặt của đầu tăm được thấm tế bào má

 Lấy xong que thứ nhất, đưa trả lại ngay vào

phong bì mà bạn vừa lấy ra

 Lặp lại như thế với ba que tăm còn lại (nên nhớ là

có bốn que thì hai que lấy tế bào má bên trái, hai

que lấy tế bào má bên phải)

 Với trường hợp trẻ còn nhỏ, không tự lấy được thì

Việc lấy mẫu máu khô sẽ do y tá thực hiện, theo

tiến trình sau:

•  Chuẩn bị một miếng vải bông trắng sạch (mới),

kích thước khoảng 3x3 cm Viết tên người cho mẫu vào mép miếng vải trước khi lấy mẫu

 Dùng cồn và bông lau sạch đầu ngón tay Dùng kim chích máu chích vào đầu ngón tay Nhỏ ba -

bốn giọt máu thấm vào giữa miếng vải Sau đó, phơi hoặc hong khô

 Sau khi khô, mỗi mẫu được cho vào một túi

ny-lông sạch, mới

2 Xách định bệnh lao nhờ vsv

Phát hiện M tuberculosis:

sáng sớm sau khi súc miệng thật sạch với

nước muối sinh lý hay nước lọc, tránh lấy quá nhiều bọt).

lao màng phổi (dịch màng phổi), lao màng

bụng (dịch màng bụng), lao xương/khớp (dịch hay mủ), lao đường tiết niệu (nước tiểu), lao hạch (chọc dịch hạch), lao màng tim (dịch

3 Xách định bệnh HIV, HBV, HCV, KST,

Dengue virus

• Máu bệnh nhân lúc đói

• Mẩu sinh thiết mô gan

• 2 Xử lí bệnh phẩm: Bệnh

phẩm phải đựng trong

biopure hay PCR tube

• Sau khi lấy để ngay ở

Mẫu sinh thiết

Dịch cơ thể khác

Làm đồng nhất, khử tạp

Xử lí với proteinase K và thuốc tẩy rửa

Ly trích DNA, RNA tinh khiết

4 Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định

thành phần , cơ cấu ký sinh trùng sốt rét

• Xác định chính xác từng loài KSTSR gây bệnh trên người là một khởi đầu quan trọng cho việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Một vấn đề

mà kỹ thuật viên xét nghiệm KSTSR cần biết là

P faciparum kháng thuốc và sự biến đổi gen đã

làm biến dạng hình thái các chủng loại KST

SR Hiện nay đối với sốt rét, ngoài phương

pháp nhuộm giemsa phát hiện KST SRcòn có nhiều kỹ thuật mới đã và đang được áp dụng như : nhuộm Acridine Orange (AO),

Paracheck, Para-sight F …và đặc biệt là kỹ

Cách lấy mẫu phân tích

Tuỳ theo đối tượng nghiên cứu và ngẫu nhiên về giới tính, tuổi, nghề nghiệp,

….mẫu được lấy khác nhau Thường thì mẫu được lấy máu đầu ngón tay nhỏ lên giấy thấm Whatman 3MM (thể tích máu 30-50µl) để khô ở môi trường thực địa và cho vào các túi nhựa riêng biệt có đánh số thứ tự

• + Tag polymerase ( Abgene )

• + Primer ( mồi ) : PLU5, PLU6 (Poligo ) ,

FAL,VIV, MAL, OVA (Sigma )

• - Lam kính , thuốc nhuộm giêmsa

• - Giấy thấm Whatman 3MM

• Phương pháp được tiến hành qua 2 giai đoạn

* Nested 1 : Phản ứng PCR để nhân bản

gen đặc hiệu của Plasmodium.

• Mồi sử dụnglà Plu5, Plu6

• Trình tự mồi : Plu55’-CCT GTT GTT GCC TTA

* Nested 2 : Phản ứng PCR nhân bản

gen đặc hiệu cho từng loài P falciparum,

P vivax, P malariae, P ovale

• Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho từng

loài

• Thành phần phản ứng như Nested 1, chỉ

khác DNA khuôn được lấy từ sản phẩm

của Nested 1 Điều kiện phản ứng như

Nested 1, chỉ khác từ bước 2 đến bước 4

được lặp lại 30 chu kỳ

Phương pháp phân tích kết quả:

Kích thước sản phẩm PCR

P falciparum 205 bp

P vivax 120 bp

P malariae 144 bp

P ovale 800 bp