Chuong 1 sinh học phân tử

MÔN HỌCCÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ Giáo viên: TS.. THÔNG TIN CHUNG VỀ LỚP HỌC• THỜI LƯỢNG: 2 TÍN CHỈ 30 TIẾT = 10 TUẦN HỌC • MỤC TIÊU MÔN HỌC: - Nắm được cơ sở lý thuyết

MÔN HỌC

CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ

Giáo viên: TS Đặng Đức Long

THÔNG TIN CHUNG VỀ LỚP HỌC

• THỜI LƯỢNG: 2 TÍN CHỈ ( 30 TIẾT) = 10 TUẦN

HỌC

• MỤC TIÊU MÔN HỌC:

- Nắm được cơ sở lý thuyết và các yêu cầu quan trọng trong thực hành của các kỹ thuật thông dụng nhất trong SHPT hiện nay;

- Hiểu được cách vận dụng các kỹ thuật đó vào các vấn

đề trong SHPT;

- Biết được các nguồn tài liệu và hướng phát triển của

các kỹ thuật mới trong SHPT.

THÔNG TIN CHUNG VỀ LỚP HỌC

• NHIỆM VỤ SINH VIÊN:

- Theo dõi bài giảng và đọc các tài liệu tham khảo theo hướng dẫn;

- Làm bài tập và tham gia seminar;

- Tham dự kiểm tra giữa kì và thi kết thúc học phần.

• CÁCH ĐÁNH GIÁ:

- Điểm báo cáo (bài tập, seminar): 20 %

- Điểm thi kết thúc môn học: 50 %

- Điểm cộng cho tham gia thảo luận trên lớp: tối đa 10%

CHƯƠNG TRÌNH MÔN HỌC

Phần I: Kỹ thuật sử dụng cho DNA, RNA

1 Chiết tách DNA từ các nguồn tự nhiên và phân tách các phân tử DNA bằng phương pháp điện di: ôn lại kiến thức cũ.

2 Kỹ thuật tách dòng phân tử (molecular cloning): 3 tuần

3 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng của chúng trong phân tích di truyền: 2 tuần.

4 Kỹ thuật đọc chuỗi DNA: 1 tuần.

5 Kỹ thuật tạo và phân tích đột biến ở DNA: 1 tuần

Phần II: Kỹ thuật sử dụng cho protein

1 Tổng hợp protein ghép (fusion protein): 1 tuần.

2 Kỹ thuật biểu hiện và tinh sạch protein: 1 tuần.

3 Kỹ thuật nhận dạng protein: 1 tuần.

Seminar vào 1-2 tuần cuối.

KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

- TẦM QUAN TRỌNG

• Kỹ thuật (KT) SHPT là một phần không thể tách rời trong sự phát triển chung của sự phát triển của SHPT Sự phát triển của kỹ thuật cho phép con người nghiên cứu sâu hơn, nhanh hơn, với giá thành rẻ hơn mọi vấn đề trong SHPT Việc

nghiên cứu các kỹ thuật mới trong SHPT còn trực tiếp đem lại các kiến thức, hiểu biết mới trong SHPT.

Tầm quan trọng của việc nghiên cứu các KT SHPT được thể hiện qua việc một số giải Nobel trong khoa học đã được trao cho việc phát triển các kỹ thuật SHPT, ví dụ như kỹ thuật đọc chuỗi DNA của Sanger, kỹ thuật PCR của Mullis, v.v KT

SHPT cũng là yếu tố quyết định sự phát triển của ngành công nghiệp sinh học với giá trị là 153,7 tỷ USD vào năm 2006

KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

- NGUỒN THAM KHẢO

1.1 Chiết tách DNA từ các loại tế bào

• Bước 1: phá vỡ màng mô, tế bào, màng nhân tế bào để

thu được dung dịch có chứa DNA Cách phá vỡ có thể dùng các biện pháp cơ học, hóa học hay kết hợp cả hai Điều kiện cụ thể tùy loại tế bào.

• Bước 2: tách DNA khỏi các protein, lipid,

polysaccharide di kèm trong dung dịch bằng các biện

pháp như chích ly bằng phenol và chloroform, chích ly bằng dung dịch muối bão hòa, hấp phụ và rửa DNA

bằng cơ chất nền silicat, v.v.

• Bước 3: kết tủa và cô đặc DNA bằng Ethanol (EtOH),

hoặc isopropanol, hoặc hỗn hợp ethanol-acetate, v.v.

1.2 Kỹ thuật điện di DNA ứng dụng trong nghiên cứu và xác định chuỗi gen

Nguyên lý chung

- Điện di là kỹ thuật dùng trong thí nghiệm để phântích các đại phân tử tích điện dựa theo kích thước(và cấu hình trong một số trường hợp) của chúng Việc phân tách DNA được thực hiện thông qua

trường tĩnh điện trong 1 cấu trúc gel

- Trong PTN CNSH, kỹ thuật điện di được dùng đểtách ly, phát hiện các DNA nguyên vẹn, DNA bị cắthạn chế, hoặc DNA là sản phẩm của PCR

- Ứng dụng của điện di trên gel agarose:

+ Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau

tính mẫu, mẫu cũng dễ thu hồi

quá trình điện di, tiêu hao đệm, và các dạng khác

nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định

Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong gel agarose

1 Kích thước của phân tử DNA

2 Nồng độ agarose

Bảng 0.1 Các thông số điện di DNA bằng gel agarose

3 Cấu hình DNA:

Nếu các phân tử DNA đều là mạch thẳng, thì độ di

chuyển của chúng chỉ phụ thuộc vào kích thước

phân tử

Plasmid DNA thường ở dạng siêu xoắn (vòng đóng) và ở dạng này chúng di chuyển NHANH HƠN các phân tử mạch thẳng có cùng kích thước Hoặc nếu plasmid DNA ở dạng vòng đứt (1 nhánh bị cắt, nhánh kia không cắt), thì nó sẽ di chuyển CHẬM HƠN phân tử mạch thẳng cùng kích thước.

1.2.3 Các bước tiến hành kỹ thuật điện di

Hình 0.2 Sơ đồ minh họa các bước điện di trên gel agarose

1.2.3.1 Chế tác gel agarose

- Bước 1: Cho đủ lượng agarose cần pha vào dung dịch TAE 1X trong một bình tam giác theo bảng 0.1

để có độ phân li nucleic acid thích hợp

- Bước 2: Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút trong nồihấp cao áp ở 1150C hoặc bằng vi sóng

- Bước 3: Cho vào chậu bảo ôn ~500C cho đến khidịch gel đạt đến khoảng 50 – 600C thì cho vào gel một lượng dung dịch ethidium bromide để có hàmlượng cuối cùng của chất màu này là 50 µg/ml

- Bước 4: Rót gel vào khuôn đã được chắn hai đầubằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã cài sẵn lược

(comb) và đặt trên mặt phẳng

- Bước 5: Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩnthận tháo lược ra khỏi gel

- Bước 2: Pha nucleic acid cần điện di với dung dịch

Loading dye 6X Dịch màu này giúp nucleic acid khi tải

vào lỗ răng lược thì nằm gọn trong đó và có màu rõ ràng Dung dịch màu tải mẫu 6X (dịch nạp mẫu) chứa 30%

glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) và 0,25%

xylencyanol (XC).

- Bước 3: Dùng micropipet hút mẫu DNA nhỏ vào lỗ răng lược

- Bước 4: Bật điện một chiều để thực hiện điện di Cường

độ dòng điện khoảng 50-150V tùy loại thiết bị điện di

Thời gian điện di phụ thuộc vào độ lớn của DNA, nồng độ agarose của gel và cường độ dòng điện.

Kiểm tra băng DNA

- Nếu điện di DNA trong gel có pha sẵn ethidium

bromide thì khi chiếu tia tử ngoại cũng có thể pháthiện được các băng DNA trong quá trình điện di

cũng như sau khi điện di Kiểu dạng (pattern) cácbăng phụ thuộc vào thành phần DNA có trong mẫucần điện di

- Nếu không cho trước ethidium bromide thì sau khiđiện di cần ngâm gel 30 - 60 phút trong dung dịchthuốc nhuộm này ở nồng độ 0,5 µg/ml

- Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu thì có thể dùng máyảnh pollaroid với ống kính có phin lọc ánh sáng

thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiết bịphân tích gel số hóa (gel documentation system)

1.3.1 Điện di acid nucleic

6-10020

25-15015

40-20012

60-4008

80-5005

1000-20003.5

Hiệu quả phân tách (bp)Acrylamide (%)

1.3.1.1 Chuẩn bị gel polyacrylamide không biến tính

1 Chuẩn bị các dung dịch sau:

- 30% acrylamide (bao gồm bis-acrylamide)

- TBE 1X

- 10% ammonium persulphate

2 Lau sạch hai tấm kính dùng làm khuôn gel và

miếng đệm bằng KOH/methanol hoặc ethanol

Xử lý bề mặt của hai tấm kính bằng dung dịch silicon

để ngăn gel dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy nó ra khỏi khuôn sau khi điện di xong

3 Tính toán thể tích của các dung dịch dùng để

tạo polyacrylamide gel trên cơ sở kích thước tấm kính, độ dày của miếng đệm

66.6 40

26.6 16.6

11.6 30% acrylamide

0.7 0.7

0.7 0.7

0.7 Amonium persulphate 10%

20 20

20 20

20 TBE 1X

12.7 39.3

52.7 62.7

67.6 Nước

20 15

8 5

3.5

Nồng độ gel (%) Dung dịch

4 Polymer hóa acrylamide trong khoảng 60 phút ở nhiệt

độ phòng, bổ sung thêm dung dịch tạo gel nếu thấy gel

ra khỏi đáy gel và các giếng bằng đệm TBE 1X.

6 Trộn các mẫu DNA với một lượng thích hợp của đệm

gel-loading dye 6X Đặt mẫu vào trong giếng bằng

micropipette hoặc Hamilton syringe.

7 Nối buồng điện di với bộ nguồn.

Polyacrylamide gel không biến tính thường chạy điện di

trong khoảng 1 - 8 V/cm Chạy gel cho đến khi thuốc nhuộm chỉ thị dịch chuyển đến vị trí mong muốn Tắt nguồn, lấy

khuôn gel ra và đặt lên bàn Tháo tấm kính nhỏ ở mặt trước

ra, tấm kính lớn ở phía sau được dùng làm giá đỡ, và chuẩn

bị nhuộm gel.

1.3.1.2 Phát hiện DNA trong gel polyacrylamide

1 Nhuộm bằng ethidium bromide

- Ngâm nhẹ gel cùng với tấm kính đỡ vào trong

dung dịch nhuộm (0,5 µg/mL EtBr trong TBE 1X) Cho vừa đủ dung dịch nhuộm phủ hoàn toàn lên bềmặt gel

- Sau khi nhuộm 30-45 phút ở nhiệt độ phòng, lấy gel và tấm kính đỡ ra, cẩn thận thấm khô bề mặt

gel bằng giấy thấm Kimwipe Phủ lên bề mặt gel

bằng giấy nylon (Saran wrap), tránh tạo ra bọt khí

hoặc nếp gấp của Saran wrap

- Sau đó lật ngược gel và đặt nó trên máy soi tử

ngoại UV transilluminator, lấy tấm kính đỡ ra để tiến hành chụp ảnh

3 Phóng xạ tự ghi

muốn quan sát kết quả điện di

+ Bước 1 : Gói bản gel cùng với tấm kính đỡ trong

giấy nylon Saran wrap Đánh dấu bằng mực

phóng xạ lên bề mặt Saran wrap

+ Bước 2 : Lật ngược gel và ủ với phim X-quang

(tiến hành trong phòng tối) ở -700C trong khoảng thời gian thích hợp

- Cố định, làm khô gel :

+ Bước 1 : Ngâm gel cùng với tấm kính đỡ trong

acetic acid 7% trong 5 phút Lấy gel khỏi thuốc

hãm màu một cách cẩn thận bằng cách cầm nhẹtấm kính ra khỏi chất lỏng

+ Bước 2 : Rửa nhanh gel trong nước khử ion

Dùng giấy thấm Kimwipe để thấm khô bề mặt gel Bọc gel và tấm kính đỡ trong Saran wrap, thiết kếphóng xạ tự ghi như trên

Một cách khác là làm khô gel trên giấy Whatman 3MM bằng cách dùng máy làm khô gel (sấy ở

800C trong điều kiện chân không từ 1-2 giờ) Làm khô gel cần thiết chỉ khi gel chứa DNA được đánh dấu đồng vị phát xạ yếu như 35S hoặc một lượng nhỏ 32P (cần phải ủ phim 24 giờ hoặc lâu hơn)