Nghiên cứu sử dụng alginat làm chất bảo vệ trong quá trình đông khô lactobacillus acidophilus

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về probiotics: 1.1.1. Định nghĩa: Thuật ngữ probiotics là một thuật ngữ được dùng để chỉ các vi khuẩn có lợi cho con người và động vật 32. 1.1.2. Lịch sử phát triển của probiotics: Các vi khuẩn có lợi cho cơ thể con người lần lượt được phát hiện ra từ hơn một thế kỷ trước. Nhóm các vi khuẩn lactic (LAB) được Elie Metchnikoff (1845 – 1916) phát hiện ra khi ông nghiên cứu mối liên quan giữa chế độ ăn có sử dụng sữa lên men với đời sống khỏe mạnh của người nông dân Bulgari. Cùng thời gian đó, lần đầu tiên Bifidobacterium được bác sĩ nhi khoa người Pháp Henry Tissier phân lập từ phân của những đứa trẻ sơ sinh được bú mẹ. Chi Bacillus đã được sử dụng trong các chế phẩm sinh học trong 1 thời gian dài với chế phẩm được biết đến nhiều nhất là Enterogermina (được đăng ký tại Italy năm 1958) 30. Hiện nay, probiotics được đưa vào các chế phẩm dưới nhiều dạng: thuốc, thực phẩm, thực phẩm chức năng. Ngoài chi Lactobacillus và Bifidobacterium là các probiotics đã được sử dụng phổ biến và lâu đời thì Enterococcus, Bacillus, Streptococcus và Pediococcus cũng đang được ứng dụng rộng rãi 11. 1.1.3. Vai trò của probiotics:  Điều trị tiêu chảy do các nguyên nhân: Do sử dụng kháng sinh (AAD): Một nghiên cứu tại Mỹ năm 2006 đã chỉ ra rằng: Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, và hỗn

HÀ THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG KHÔ

Lactobacillus acidophilus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG KHÔ

Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh – bộ môn Công nghiệp Dược Trong thời gian thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình

Trước tiên, với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm

ơn chân thành tới TS Đàm Thanh Xuân, người đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt và

động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS Lê Ngọc Khánh, người đã giúp đỡ và cho

tôi nhiều ý kiến quý báu để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn

Nhân dịp này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy cô trong trường đã dạy dỗ và dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học ở trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người

đã luôn luôn động viên, chia sẻ, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

và nghiên cứu

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Hà Thị Thanh Huyền

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 2

1.1.1 Khái niệm Probiotic 2

1.1.2 Các vi sinh vật thường dùng trong các chế phẩm probiotic 2

1.1.3 Vai trò 3

1.1.4 Cơ chế tác dụng 5

1.2 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 5

1.2.1 Khái niệm 5

1.2.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô 5

1.2.3 Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô 6

1.2.4 Ứng dụng của phương pháp đông khô 6

1.2.5 Một số tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật 7

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC 10

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 15

2.1.1 Nguyên vật liệu 15

2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 15

2.1.3 Thiết bị 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.2 Đánh giá chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp nhân giống 17

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 17

2.3.3 Phương pháp tạo nguyên liệu đông khô chứa L acidophilus 17

2.3.4 Phương pháp xác định hàm ẩm 18

2.3.5 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng liên tục 19

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu tạo thành khi sử dụng alginat và phương pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu đông khô 21

3.1.1 Đánh giá cảm quan, thể chất của các nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus tạo thành sau khi đông khô 21

3.1.2 Khảo sát tác dụng bảo vệ của alginat trong quá trình đông khô Lactobacillus acidophilus khi tạo các dạng nguyên liệu khác nhau 24

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của lượng sinh khối ban đầu đến số lượng vi sinh vật sống sót của nguyên liệu đông khô 28

3.2 Đánh giá chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

(Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì) CFU, cfu : Colony – Forming Units (Số đơn vị khuẩn lạc)

EDTA : Dinatriethylen diamintetraacetat

FAO : Food and Agriculture Organization

(Tổ chức Nông lương thế giới) IDF : International Dairy Federation

(Liên đoàn bơ sữa thế giới) MRS : de Man, Rogosa, Sharpe

1 Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 15

2 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 16

3 Bảng 3.1 Các mẫu nguyên liệu khảo sát thể chất 21

4 Bảng 3.2 Thể chất của một số mẫu nguyên liệu đông khô chứa

5 Bảng 3.3 Các mẫu nguyên liệu khảo sát số lượng vi sinh vật 25

6 Bảng 3.4 Số lượng vi sinh vật sống sót của các mẫu nguyên liệu

7 Bảng 3.5 Số lượng vi sinh vật sống sót và hàm ẩm của các mẫu

hạt đông khô chứa L acidophilus 29

8 Bảng 3.6 Hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu trong thời gian bảo

9 Bảng 3.7 Số lượng VSV của các mẫu nguyên liệu trong thời

1 Hình 1 Công thức cấu tạo của acid α – L - guluronic và β – D –

2 Hình 2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng sinh khối

ướt thu được vào tổng thể tích dịch nuôi cấy 30

3 Hình 3 Đồ thị biểu diễn số lượng vi sinh vật trong 1g hạt chưa

đông khô khi thay đổi thể tích dịch nuôi cấy ban đầu 31

4

Hình 4 Đồ thị biểu diễn biến thiên số lượng vi sinh vật và hàm

ẩm của các mẫu nguyên liệu sau đông khô theo thể tích dịch nuôi

cấy

32

5 Hình 5 Đồ thị biểu diễn hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu đông

6 Hình 6 Đồ thị biểu diễn số lượng L acidophilus trong các mẫu

nguyên liệu trong thời gian bảo quản 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thời gian gần đây, các sản phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotic đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng Probiotic ngày càng được bào chế dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như bột, cốm, viên nang hay sử dụng trong các sản phẩm cho đường dùng khác như viên đặt, kem bôi

da Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn probiotic trong các chế phẩm này rất nghèo nàn [37], [39] Nguyên nhân là do các vi sinh vật này rất nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện môi trường bảo quản như nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ oxy hòa tan và hàng rào sinh học của hệ tiêu hóa Do đó, trong quá trình bảo quản và sau khi vi khuẩn được đưa vào hệ tiêu hóa, số lượng vi khuẩn bị giảm đáng kể làm hạn chế tác dụng của chế phẩm [30], [33]

Để giải quyết vấn đề này, cần phải tìm ra những phương pháp gia tăng tỉ lệ sống sót và khả năng chống chịu của vi khuẩn probiotic trước các điều kiện bất lợi trong sản xuất, bảo quản và sử dụng Một trong các hướng nghiên cứu đáng chú ý trong thời gian gần đây là sử dụng alginat như một tác nhân bảo vệ nhằm gia tăng tỉ lệ sống sót của các vi khuẩn probiotic trong quá trình đông khô

Xuất phát từ các lí do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng

alginat làm chất bảo vệ trong quá trình đông khô Lactobacillus acidophilus”

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC

1.1.1 Khái niệm Probiotic

Probiotic là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho sự sống”, dùng để chỉ những vi khuẩn mang lại những tác động có lợi cho con người

và cho vật chủ [45]

Từ hàng nghìn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên men với mục đích tăng cường sức khỏe Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỉ XIX, nhà khoa học người Nga Elie Metchnikoff mới thực sự nghiên cứu vấn đề này trên cơ sở khoa học Thuật ngữ “Probiotic” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi Kollath Theo ông, Probiotic là “các yếu tố có nguồn gốc từ vi khuẩn, kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác” [19] Năm 1989, Fuller đã đưa ra một định nghĩa khác về Probiotic: “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” [36] Năm 2002, WHO và FAO đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về Probiotic ở thời điểm hiện tại như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [44], [45] Theo FAO, để có được hiệu quả thực sự thì VSV trong các chế phẩm probiotic cần phải đến được vị trí tác dụng trong đường tiêu hóa Do trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotic phải đối mặt với các điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng, các chế phẩm probiotic phải chứa ít nhất

106 – 107cfu/ml tế bào VSV sống cho đến ngày hết hạn sử dụng để đảm bảo tác dụng điều trị (FAO/WHO) [23], [40]

1.1.2 Các vi sinh vật thường dùng trong các chế phẩm probiotic

Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic là:

Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus Trong đó, Lactobacillus và Bifidobacterium là hai loại vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất [40] Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, thuộc

nhóm vi khuẩn lactic Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn Gram (+), kích thước

từ 0,6 – 0,9 × 1,5 – 6,0µm, mọc đơn hoặc mọc đôi tạo thành chuỗi ngắn không sinh bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm tính Nhiệt độ phát triển: tối ưu 37oC, không phát triển trong khoảng 20o

C – 22oC, tối đa trong khoảng 43oC – 48oC Tên gọi của loài có nghĩa là “ưa acid” cho thấy loài có thể phát triển trong môi trường acid, pH khoảng 5 - 6, thời gian 24 – 36h [2]

L acidophilus chiếm tỉ lệ chủ yếu trong số các vi sinh vật có ích cư trú ở đoạn

trên của ống tiêu hóa [22] Chúng có khả năng làm giảm số lượng các vi sinh vật hoặc nấm có hại ở ruột non; có khả năng sinh lactase – một enzym quan trọng trong

quá trình chuyển hóa sữa Trong quá trình tiêu hóa, L acidophilus còn tham gia sản sinh niacin, acid folic, pyridoxin Một vài nghiên cứu đã chứng minh L acidophilus

làm tăng cường chức năng của hệ tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch cơ thể, ngăn chặn bệnh tiêu chảy và làm giảm triệu chứng khó tiêu [22]

Với những đặc điểm trên, L acidophilus là lựa chọn hàng đầu để sản xuất các

chế phẩm probiotic

 Đặc điểm hạn chế của L acidophilus

Khả năng sống sót của L acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: pH, sự

acid hóa trong sản phẩm lên men, sản phẩm hydroperoxid, nồng độ oxy hòa tan (khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ bảo quản, độ

ổn định của dạng khô hoặc đông khô [38], [39] Trong đó, nồng độ oxy hòa tan có

vai trò đáng kể trong việc hạn chế khả năng sống sót của L acidophilus Do đó, sau một thời gian bảo quản, số lượng L acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [20]

1.1.3 Vai trò

Probiotic có một số tác dụng chính như sau:

 Ứng dụng trị liệu trong một số bệnh đường tiêu hóa ở người:

- Ngăn chặn bệnh tiêu chảy:

Probiotic được chứng minh là có tác dụng trong 5 loại tiêu chảy: tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, do nhiễm khuẩn, do nhiễm virus, tiêu chảy ở người đi du lịch, tiêu chảy do không dung nạp lactose Hai tác nhân có hiệu quả với những bằng chứng rõ ràng trong việc phòng ngừa tiêu chảy do kháng sinh là vi khuẩn

Lactobacillus rhamnosus GG và nấm men S boulardii (S cerevisiae) [42] Các tác

nhân khác đang được nghiên cứu là Bacillus clausii, B longum, L acidophilus, L

bulgaricus, L plantarum, Enterococcus faecium, Clostridium butyricum [9], [42]

- Tác dụng lên Helicobacter pylori (H pylori)

Helicobacter pylori đóng vai trong chủ yếu trong nguyên nhân và bệnh sinh loét

dạ dày tá tràng Các nghiên cứu dùng kết hợp phương pháp điều trị bằng PPI và kháng sinh với chế phẩm probiotic đã làm giảm đáng kể tác dụng không mong muốn của kháng sinh đến hệ vi sinh vật đường tiêu hóa Do vậy, sử dụng probiotic

để phòng ngừa các bệnh lí liên quan đến viêm loét dạ dày tá tràng là một hướng điều trị được chú ý trong những năm gần đây [22], [16], [41]

Ngoài ra, probiotic còn có một số tác dụng khác như: “tăng cường khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzym khác”, “điều trị rối loạn tiêu hóa do dùng kháng sinh” [9], “viêm ruột mạn tính”, “bội nhiễm ở ruột non”, “điều trị ung thư ruột kết” [22]

 Tăng cường miễn dịch

Vi khuẩn lactic làm tăng cả 2 loại đáp ứng miễn dịch: miễn dịch đặc hiệu (tăng sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh tế bào lympho) và miễn dịch không đặc hiệu - miễn dịch tự nhiên (tăng cường chức năng của đại thực bào, tăng số lượng và tăng hoạt động của tế bào diệt tự nhiên) [6], [30], [35], [40]

 Hạ cholesterol máu

Vi khuẩn probiotic có thể lên men carbohydrat không thể tiêu hóa được và tạo các acid béo chuỗi ngắn trong ruột, những chất này ức chế sự tổng hợp cholesterol trong gan hoặc tái phân phối cholesterol từ huyết tương đến gan, vì vậy làm giảm lượng cholesterol trong máu Các chủng đơn lẻ có thể phân hủy muối mật và cản trở

sự hấp thu cholesterol từ đường ruột [19], [27], [28], [41]

 Chống lại tác nhân gây ung thư

Tác dụng chống khối u của probiotic có thể do một số cơ chế sau: gắn với tác nhân đột biến, sản xuất các chất chống đột biến, ức chế enzym tiền ung thư như

nitroreductase và β-glucuronidase, tăng cường sản xuất β-glucosidase, chất giải phóng flavonoids, sản xuất các chất chống oxy hóa [19]

1.1.4 Cơ chế tác dụng

- Cạnh tranh năng lượng, vị trí bám

Probiotic khi phát triển trong đường tiêu hóa sẽ cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng với các vi khuẩn gây bệnh, từ đó hạn chế sự sinh trưởng và phát triển

của chúng Một số nghiên cứu in vitro cho thấy cả hai dạng vi khuẩn L acidophilus

còn sống hoặc đã chết do nhiệt đều có khả năng ức chế sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh [6], [45]

- Kích thích đáp ứng miễn dịch

Bằng việc bám dính vào niêm mạc ruột – nơi có nhiều tế bào lympho, probiotic kích thích cả miễn dịch tại chỗ và miễn dịch toàn bộ cơ thể Chúng làm tăng cả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu bằng cách kích thích các tế bào tham gia phản ứng miễn dịch (macrophase, lymphocytes) và tăng cường sản xuất các chất tham gia miễn dịch (cytokines, immunoglobulins, interferon) [40]

Ngoài ra một số cơ chế khác có thể kể đến như: “sản sinh ra các chất kháng khuẩn”, “tăng cường khả năng chống đỡ của niêm mạc ruột”, “tăng cường chức năng của hệ tiêu hóa” [6], [30]

1.2 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ

1.2.1 Khái niệm

Đông khô (sấy thăng hoa) là phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng cách thăng hoa, nghĩa là ẩm được chuyển thẳng từ pha rắn sang pha hơi mà không qua trạng thái lỏng Muốn vậy trước khi đông khô phải biến ẩm trong vật liệu thành thể rắn, nghĩa là phải tiến hành làm lạnh đông vật liệu Như vậy, đông khô được thực hiện ở môi trường có độ chân không cao và nhiệt độ rất thấp (thường là âm) Chế độ làm việc phải thấp hơn điểm ba của nước Ở áp suất nhất định, nhiệt độ thăng hoa của vật là không đổi, khi áp suất tăng thì nhiệt độ thăng hoa cũng tăng [34]

1.2.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô

 Giai đoạn lạnh đông

Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc được làm lạnh đông riêng bên ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ điểm ba của ẩm [34]

 Giai đoạn thăng hoa

Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng thời tiến hành hút chân không Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa: áp suất và nhiệt độ phải thấp hơn điểm ba Ẩm trong vật chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua trạng thái lỏng [34]

 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại

Ở giai đoạn này, nhiệt độ của vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng thái lỏng Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết

bị sấy chân không bình thường Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa [34]

1.2.3 Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô

 Ưu điểm

Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp từ dạng rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy khác như: giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; giữ được hoạt tính sinh học; bảo

vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin…; giữ nguyên được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ nước để trở lại trạng thái ban đầu [34]

 Nhược điểm

- Giá thành thiết bị cao

- Vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao

- Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao

Do những ưu nhược điểm trên nên đông khô chỉ được áp dụng khi yêu cầu sản phẩm phải có chất lượng cao [34]

1.2.4 Ứng dụng của phương pháp đông khô

Đông khô được ứng dụng trong ngành dược: trong sản xuất các thuốc kháng sinh (penicillin, cephalexin );làm khô các chế phẩm sinh học như albumin, vi sinh vật Ngoài ra, đông khô cũng được sử dụng như một phương pháp bảo quản trong các ngành công nghiệp thực phẩm, vi sinh, thú y để bảo quản một số sản phẩm khác [34]

1.2.5 Một số tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật

Đông khô là một trong những phương pháp phổ biến nhất để sản xuất lượng lớn

vi sinh vật với nồng độ cao [13] Tuy nhiên, trong quá trình này, vi khuẩn vẫn gặp phải nhiều điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong giai đoạn tiền đông Một số nghiên cứu cho rằng các biến đổi sinh học xảy ra trong quá trình chuyển nước thành băng

là nguyên nhân chính gây tổn thương cho tế bào Các tinh thể nước đá lớn hình thành bên ngoài tế bào gây ra một áp lực thẩm thấu lớn do làm tăng nồng độ chất tan bên ngoài tế bào làm tế bào bị mất nước, giảm khối lượng dẫn đến một số tình trạng như thay đổi cấu trúc màng tế bào, mất hoặc hợp nhất lớp màng kép hay phá hủy các cơ quan trong tế bào Tiếp theo là sự hình thành các tinh thể nước đá bên trong tế bào Cơ chế chính xác gây tác hại từ băng trong tế bào vẫn chưa rõ ràng, nhưng có thể do sự phá hủy vật lý của màng tế bào, sự hình thành bong bóng khí trong tế bào và phá vỡ bào quan [14] Một số nghiên cứu khác lại cho rằng nước kết tinh và nhiệt độ thấp làm biến tính protein và tổn thương màng vi khuẩn tế bào vi khuẩn, làm cho vi khuẩn giảm khả năng tồn tại, độ nhạy cao hơn với không khí và mất khả năng sinh sản [33] Để ngăn chặn hoặc giảm thiểu các tác dụng bất lợi này, nhiều chất đã được sử dụng như tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô [13] Các chất bảo vệ hay tá dược đông khô (Cryoprotectant – CPA) là các chất được thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của VSV trong quá trình làm khô [33] Một số tá dược được sử dụng trong đông khô:

- Sữa gầy: là sữa béo đã loại bỏ các acid béo, thành phần gồm lactose (chủ yếu), acid amin, các vitamin và khoáng chất

- Các loại đường: glucose, lactose, dextrin glucose,

- Các acid amin: arginin, acid glutamic,

- Peptid, protein, dịch chiết sinh học tự nhiên và polyme

 Sữa gầy

Sữa gầy hay còn gọi là “skim milk” là các sản phẩm sữa mà trong thành phần

có chứa không quá 0,5% chất béo Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa gầy: 32% - 35,7% protein; 48,4% - 54,1% lactose

Sữa gầy có trong các chế phẩm đông khô probiotic vì nó có tác dụng bảo vệ tốt probiotic trong quá trình đông khô Theo nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước từ trước tới nay thì sữa gầy sử dụng ở nồng độ khoảng 10% cho tỉ lệ sống sót cao nhất Tác dụng bảo vệ này có thể do nó chứa tỉ lệ lớn protein và carbohydrat - những chất

có khả năng bảo vệ tế bào

Thành phần lactose có trong sữa gầy cũng như một số disaccharid khác có thể thấm qua thành tế bào, sau đó chúng hình thành liên kết hydro giữa đường - protein Các liên kết này giúp duy trì cấu trúc của protein màng khi nước bị loại đi Protein giúp hình thành trạng thái glass xung quanh và bên trong tế bào tạo ra một môi trường đủ nhớt bên trong và ngoài tế bào giúp ngăn cản sự biến đổi của tế bào ở mức thấp nhất [17]

Theo một nghiên cứu khác thì protein trong sữa gầy có thể tạo thành lớp áo bảo

vệ trên thành tế bào, đồng thời sữa gầy còn cung cấp những chất đệm tan trong nước (muối phosphat, muối citrat) giúp ổn định pH trong quá trình đông khô [33] Nguyên liệu đông khô với sữa gầy vừa tạo cấu trúc xốp giúp quá trình bù nước

dễ dàng, nhưng đồng thời cũng làm cho nguyên liệu đông khô hút ẩm khá nhanh nếu không được bảo quản tốt

 Alginat

 Nguồn gốc, cấu trúc của alginat

Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic với các ion kim loại như

Ca2+, Ba2+, Mg2+, Na+ Alginat có nguồn gốc chủ yếu từ tảo nâu, rong mơ

Sargassum polycystum, S kjellmanianum,

Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M) [13], [25]

Acid α – L – Guluronic Acid β – D – Mannuronic

Hình 1 Công thức cấu tạo của acid α - L - guluronic và β – D - mannuronic

Hai monome này gắn với nhau bằng liên kết 1 – 4 glycosid nhưng các liên kết này không phải ngẫu nhiên mà thành block: block homopolyguluronic (GGGG), block homopolymannuronic (MMMM), block liên hợp (MGMG)

Tùy theo nguồn gốc của alginat mà độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau Điều này làm cho tính chất của alginat biến đổi trong một dải rộng [13], [25]

 Một số tính chất của alginat

Độ hòa tan: Các muối kim loại hóa trị I (Na+, K+ ), muối amoni và muối của các amin phân tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước tạo dung dịch keo nhớt Các muối của acid alginic với các kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+ ) không tan trong nước (trừ muối Mg2+) Các muối alginat hòa tan được trong các dung môi

thân nước như alcol, aceton và hòa tan dễ dàng hơn khi đun nóng [25]

Độ nhớt: Natri alginat khi tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt dao

động trong khoảng từ 10 – 3500 cps Độ nhớt của dung dịch alginat ảnh hưởng bởi khối lượng phân tử trung bình, nồng độ alginat sử dụng, nhiệt độ pH và sự có mặt

của các ion kim loại có trong dung dịch

Sự gel hóa: Dung dịch natri alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion

kim loại hóa trị II, III Các gel này được hình thành ở các mức nhiệt độ nhỏ hơn

100oC, không tan chảy khi đun nóng Sự tạo gel được giải thích bằng mô hình cấu

trúc phân tử của alginat - mô hình vỉ trứng: đoạn mạch của polymannuronic (MMMM) là các dải hẹp, đoạn mạch của acid polyguluronic (GGGG) có dạng gấp nếp như vỉ trứng Khi có mặt các ion hóa trị II, III ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra, các phân tử alginat sắp xếp lại song song với nhau, các phần gấp nếp của đoạn GGGG tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt quả trứng Các ion

Ca2+ khớp vào khoảng trống này liên kết với các nhóm chức carboxyl và các nguyên tử oxy ở mỗi đoạn song song để hình thành gel alginat [11], [25] Với tính chất này, alginat được sử dụng rất rộng rãi trong công nghệ cố định tế bào và vi nang hóa

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC

Có rất nhiều phương pháp tạo chế phẩm probiotic như tạo dạng bột đông khô, tạo cốm Các phương pháp này đã và đang được sử dụng phổ biến do đã được nghiên cứu lâu đời nên giá thành rẻ và dễ triển khai trên quy mô công nghiệp, tuy nhiên khả năng sống sót của vi khuẩn lại không cao Để cải thiện số lượng vi khuẩn sống sót trong quá trình bảo quản và trong những điều kiện bất lợi về môi trường như pH thấp ở dạ dày, các enzym tiêu hóa , trên thị trường đã có các sản phẩm probiotic được bào chế dạng pellet, vi nang và được bao bảo vệ tới thế hệ 4 [4]

Thế hệ 1 Không bao như bột, cốm, pellet (Non – Coated)

Thế hệ 2 Bao tan trong ruột (Enteric – Coated)

Thế hệ 3

Vi nang hóa (Micro – Encapsulated)

Thế hệ 4 Bao 2 lớp ( Dual – Coated)

Hiện nay, hầu hết các nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm probiotic trên thị trường là dạng bột đông khô do khả năng duy trì số lượng VSV sống ngay cả trong quá trình bảo quản thời gian dài Ngoài ra, bột đông khô còn là dạng nguyên liệu tốt nhất để sản xuất chế phẩm probiotic dạng rắn như bột, cốm hoặc viên nén, viên nang

Nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng VSV sống sót trong các chế phẩm probiotic rất nghèo nàn Hơn thế, khả năng tồn tại của các vi khuẩn trong hệ thống tiêu hóa là một vấn đề lớn cần giải quyết Cung cấp cho các tế bào sống một rào cản vật lý để chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường là một trong những hướng tiếp cận được quan tâm hiện nay, trong đó phải kể đến công nghệ vi nang hóa [37]

 Kỹ thuật vi nang hóa probiotic

Kỹ thuật vi nang hóa phát triển từ kĩ thuật cố định tế bào trong công nghệ sinh học Vi nang hóa là sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polyme có nguồn gốc tự nhiên hoặc nhân tạo để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống, kết quả tạo thành các hạt vi nang hình cầu có kích thước từ 0,1µm tới 2mm [37], [39]

Ưu điểm: Vi nang hóa cho phép cố định tế bào với số lượng lớn so với các

phương pháp khác; đồng thời tạo ra lớp màng bảo vệ cách li tế bào vi khuẩn khỏi môi trường cho đến khi tế bào được giải phóng, bảo vệ vi khuẩn khỏi các tác động bất lợi của môi trường, từ đó tăng độ ổn định, tăng tuổi thọ của vi khuẩn và kiểm soát giải phóng Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện và dễ triển khai ở quy mô công nghiệp [39]

Tá dược vi nang hóa

Tá dược phổ biến nhất dùng để vi nang hóa vi sinh vật là alginat

Ưu điểm: Alginat không độc, tạo gel dễ dàng với Calci clorid, gel có độ ổn định

cao Vi khuẩn sống không bị ảnh hưởng trong suốt quá trình bất động nhờ tính thuận nghịch của gel: hòa tan lại trong môi trường có chứa ion Calci hoặc pH hơi kiềm sẽ giúp giải phóng các tế bào bên trong Alginat có độ ổn định cao, độ xốp cao

và có khả năng chống chịu các muối và chất tạo phức

Nhược điểm: Khi có mặt acid lactic, các yếu tố tạo phức như lactat có thể làm

giảm độ bền của gel Calci alginat và làm cho tế bào thoát ra ngoài

Các chất tạo gel khác gồm: chitosan, carboxylmethyl cellulose (CMC), gelatin, pectin, gôm kappa-carrageenan-locust đậu, gellan và agar

Các kỹ thuật vi nang hóa

 Trong phòng thí nghiệm

Kỹ thuật tách pha đông tụ

Tế bào vi khuẩn và polyme được tạo thành hỗn dịch và được bơm qua một đầu kim phun, tạo thành các giọt nhỏ hình cầu và hóa rắn lại khi rơi xuống một dung dịch hóa rắn [37]

Kỹ thuật nhũ hóa

Tạo một hệ nhũ tương N/D gồm pha nội thân nước là hỗn dịch polyme chứa vi khuẩn và pha ngoại thân dầu Các giọt nhũ tương polyme chứa vi khuẩn sẽ được hóa rắn bằng cách làm lạnh nhanh hoặc bằng một tác nhân hóa rắn [37]

 Trong công nghiệp

Trong công nghiệp, thường tiến hành vi nang hóa vi sinh vật bằng các kĩ thuật sấy phun (spray drying), kỹ thuật phun sương và kỹ thuật nhũ hóa Trong đó, kỹ thuật sấy phun là kỹ thuật phổ biến nhất bởi tính kinh tế, linh hoạt và tạo ra sản phẩm có chất lượng cao [37]

Một số nghiên cứu sử dụng alginat làm tá dược vi nang hóa

Các công trình tiên phong trong lĩnh vực cố định tế bào được thực hiện bởi Chibata (1979) sử dụng tế bào VSV cố định cho sản xuất liên tục acid L- aspartic [39] Năm 1978, Sten Ohlsan, Per Olof Larsson và Klaus Mosbach cố định tế bào vi

sinh Arthrobacter simplex bằng gel calci alginat Từ đó đến nay, đã có rất nhiều

công trình nghiên cứu sử dụng alginat làm tá dược vi nang hóa tế bào vi khuẩn

 Trên thế giới

Năm 1989, những nghiên cứu của A V Rao và cộng sự đã chứng minh vi nang

hóa làm tăng khả năng sống sót của Bifidobacterium pseudolongum trong môi

trường dạ dày, ruột [12]

Từ 1990 - 1998, đã có thêm nhiều nghiên cứu về các lợi ích của quá trình vi nang hóa tế bào bằng alginat như: bảo vệ các tế bào bên trong các hạt vi nang khỏi các chủng phages [32]; bảo vệ tế bào vi khuẩn trong quá trình đông khô và bảo quản lạnh [26], [31], [43]; tăng độ ổn định trong quá trình bảo quản [24], [29]

Những năm gần đây, vi nang hóa trở thành một lĩnh vực đang được quan tâm nghiên cứu rất nhiều Các nghiên cứu chủ yếu nhằm tìm ra những lợi ích của vi nang hóa tế bào [13], [41]; cải thiện các kĩ thuật vi nang hóa [15], [18], [21], [44] hay cải thiện đặc tính của vi nang [20], [38], [44]

Năm 2004, V Chandramouli và cộng sự tiến hành nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình vi nang hóa nhằm tăng hiệu quả của vi nang trong việc bảo vệ các vi khuẩn trong điều kiện mô phỏng dạ dày [21]

Năm 2008, theo báo cáo của Se-Jin Kima và cộng sự, vi nang hóa làm tăng tỉ lệ

sống sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình xử lí nhiệt, tăng khả năng tồn

tại trong môi trường pH dạ dày; không ảnh hưởng đến khả năng bám dính vào ruột

và các dòng tế bào biểu mô của con người, không làm giảm tác dụng giảm cholesterol của chủng này [41]

Năm 2012, T P Ivanovska và cộng sự đã tiến hành vi nang hóa vi khuẩn

Lactobacillus casei trong vi hạt chitosan-Ca-alginat bằng phương pháp sấy phun,

kết quả tạo ra các vi hạt có kích thước nhỏ và ổn định hơn trong môi trường dạ ruột so với khi chỉ sử dụng alginat để vi nang hóa [44]

Năm 2014, Sha Cai đã tiến hành nghiên cứu cải tiến phương pháp vi nang hóa

bằng kĩ thuật nhũ tương hóa bằng cách thay CaCO3 bằng Ca-EDTA, thu được các vi nang đồng đều hơn về kích thước và số lượng vi khuẩn trong vi nang tương tự như khi sử dụng CaCO3 [18]

 Việt Nam

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, sử dụng alginat làm tá dược vi nang hóa cũng đang được quan tâm và nghiên cứu Nhiều nghiên cứu chứng minh vi nang hóa bằng alginat có tác dụng bảo vệ vi khuẩn probiotic trong môi trường dạ dày – ruột tốt hơn so với dạng tự do [1], [7] Theo nghiên cứu của tác giả Quách Thu

Trang (2010), sử dụng alginat 2% hóa rắn trong dung dịch CaCl2 2% cho vi nang dạng cầu ổn định và sử dụng tá dược độn là sữa gầy 10% có tác dụng nâng cao tỉ lệ sống sót của vi sinh vật trong quá trình đông khô và trong quá trình bảo quản [8]

Một số chế phẩm probiotic dạng vi nang trên thị trường

- Lactomin plus

Thành phần: Mỗi gói 3g chứa:

Hỗn hợp vi khuẩn lactic dạng vi nang gồm: Lactobacillus acidophilus,

Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis (108cfu/g): 300mg

Tá dược: bột Vegetable cream, fructo-oligosaccharid, bột hương yaourt

Nhà sản xuất: Novarex / Me-Auspharm JV

- Pro-X10

Thành phần: Vi nang probiotic chứa: 8.109CFU (Bifidobacterium breve,

Bifidobacterium lactis, L acidophilus, L plantarum, L rhamnosus);

Lactobacillus salivarius 2.109CFU; Bacillus subtilis 4.109CFU;

Saccharomyces boulardii 4.109CFU, Actazin : 250mg

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus ATCC 4653

 Nguyên liệu :

Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Glucose Trung Quốc Sữa gầy Trung Quốc

2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

 MRS lỏng (MT1)

Cao nấm men 5g MnSO4.4H2O 0,05g

Triamoni citrat 2g Nước máy vđ 1000ml

 Môi trường MRS đặc (MT2)

MT2 = MT1 + thạch agar (22g/1000ml môi trường)

2.1.3 Thiết bị

Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tủ cấy vô trùng Nhật (Sanyo)

Nồi hấp tiệt khuẩn ALP - Nhật

Cân phân tích Đức (Satorious)

Cân kĩ thuật Đức (Satorious)

Máy đo hàm ẩm MB23/25 – Ohaus - Mỹ

Bình nón, đĩa petri, ống nghiệm, đầu

côn, pipet, cốc có mỏ, ống ly tâm…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu tạo thành khi sử dụng alginat và phương pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu đông khô

 Đánh giá cảm quan, thể chất của các nguyên liệu chứa L acidophilus tạo thành

sau đông khô

 Khảo sát tác dụng bảo vệ của alginat trong quá trình đông khô Lactobacillus

acidophilus khi tạo các dạng nguyên liệu khác nhau

 Khảo sát ảnh hưởng của lượng sinh khối ban đầu đến số lượng vi sinh vật sống sót của nguyên liệu đông khô

2.2.2 Đánh giá chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản

 Đánh giá số lượng vi sinh vật và hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu trong thời gian bảo quản

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nhân giống

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan hết các thành phần Phân chia môi trường vào các ống nghiệm sạch bằng phễu thủy tinh, mỗi ống nghiệm 10ml MRS lỏng Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước) Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115o

C/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Sau khi tiệt khuẩn để nguội xuống khoảng 37 ÷ 40oC Cấy giống vào ống nghiệm trên Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống VSV trong

tủ ấm 5% CO2 trong 24h ở 37±1oC

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (theo công thức đã nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan các thành phần trong công thức trong cốc có

mỏ Chuyển môi trường MRS lỏng vào bình nón có dung tích thích hợp Đậy kín miệng bình bằng nút bông Hấp tiệt khuẩn ở 115oC/20 phút trong nồi hấp tự động Lấy ra, để nguội xuống khoảng 37÷ 40oC Cấy giống vào các bình nón trên trong tủ cấy vô trùng (tỉ lệ cấy giống: 10% thể tích môi trường) Ủ trong tủ ấm 5% CO2trong 24h ở nhiệt độ 37±1oC

2.3.3 Phương pháp tạo nguyên liệu đông khô chứa L acidophilus

 Phương pháp thu sinh khối

Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trường MRS ở điều kiện 37o

C trong 24h trong tủ ấm 5% CO2 (như phương pháp nêu trong mục 2.3.2) Gạn bớt phần dịch trong phía trên, phần hỗn dịch sinh khối phía dưới đong vào các ống li tâm Li tâm các ống này với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút Lấy các ống li tâm khỏi máy, loại bỏ phần dịch trong, giữ lại phần cắn sinh khối phía dưới, thu được sinh

khối từ các bình nuôi cấy

 Phương pháp tạo nguyên liệu dạng bột

Sinh khối thu được phân tán đều trong dung dịch tá dược độn đã được hấp tiệt khuẩn bằng máy lắc (Vortex) và máy khuấy từ Đổ hỗn dịch các mẫu này ra đĩa petri đã được làm sạch và hấp tiệt khuẩn từ trước, đậy kín bằng giấy nhôm, để các đĩa này vào tủ lạnh sâu ở -80oC cho đông rắn hoàn toàn, sau đó tiến hành giai đoạn làm khô trong máy đông khô Tạo các mẫu đông khô từ sinh khối của vi sinh vật và

các tá dược bảo vệ khác nhau

 Phương pháp tạo nguyên liệu dạng hạt

Sinh khối thu được đem phân tán đều trong 100ml dung dịch sữa gầy 20% bằng máy lắc (Vortex) và khuấy từ Hỗn dịch sinh khối trong sữa gầy đem phối hợp với 100ml dung dịch alginat 4% bằng khuấy từ trong 15 phút thu được 200ml hỗn dịch sinh khối trong dung dịch alginat 2% và sữa gầy 10% Tạo hạt bằng cách dùng pipet nhỏ hỗn dịch tế bào-alginat vào dung dịch CaCl2 2% đã được hấp tiệt khuẩn ở

115oC/20 phút Ngâm hạt trong 30 phút để hạt ổn định, sau đó rửa hạt bằng dung dịch nước muối sinh lý đã được hấp tiệt khuẩn Hạt tạo thành được chia vào các đĩa petri đã được hấp tiệt khuẩn, đậy kín bằng giấy nhôm rồi đem tiền đông trong tủ lạnh sâu ở -80oC trong 24h cho đông rắn hoàn toàn

 Phương pháp đông khô

- Tiền đông: Các mẫu được làm đông lạnh trong tủ lạnh sâu ở -80oC trong

24h cho đông rắn hoàn toàn

- Làm khô: Các mẫu được làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô

ở nhiệt độ khoảng -50oC; áp suất 0,055mbar trong 24h

Kết thúc quá trình đông khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, xác định số lượng vi sinh vật sống sót và hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu hoặc chuyển các mẫu nguyên liệu vào bao polyme có khóa, để trong hộp nhựa, đậy kín rồi bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4o

C

2.3.4 Phương pháp xác định hàm ẩm

Tiến hành đo trên thiết bị đo hàm ẩm Ohaus

Làm nhỏ mẫu cần đo hàm ẩm Cho lên mặt đĩa của thiết bị khoảng 1g mẫu, dàn đều mẫu ra mặt đĩa, đậy nắp, chạy máy Chờ máy gia nhiệt trong khoảng 5 phút

hoặc đến khi máy hiện kết quả Đọc, ghi lại số liệu hàm ẩm của mẫu hiển thị trên màn hình

2.3.5 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng

liên tục

 Chuẩn bị

Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trường MRS đặc (nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp Đậy kín bằng nút bông Hấp tiệt khuẩn ở

115oC/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Lấy bình đựng môi trường ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trường lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín

Chuẩn bị các ống nghiệm sạch mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lí, đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 115o

C /20 phút, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 37 ÷ 40oC

 Xác định số lượng VSV trong 1ml dịch nuôi cấy

Hút chính xác 1ml hỗn dịch sinh khối pha vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều Hút chính xác 1ml dịch đã được đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ 2 (chứa 9ml nước muối sinh lí), lắc đều Cứ tiếp tục pha loãng như vậy cho tới nồng độ pha loãng cuối cùng (trong thí nghiệm này là 10-7

, 10-8, 10-9) Cấy trải lên mỗi đĩa petri 0,5ml dịch trong các ống pha loãng ở trên (làm trên 3 nồng độ cuối, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa)

 Đối với mẫu nguyên liệu dạng bột

Làm nhỏ nguyên liệu, cân chính xác khoảng 1g mẫu, sau đó pha vào bình nón chứa 100ml nước cất đã được hấp tiệt khuẩn ở 115oC/20 phút Phân tán đều mẫu trong nước bằng khuấy từ, sau đó hút chính xác 1ml dịch từ bình nón pha vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí, rồi tiếp tục pha loãng, cấy như đối với mẫu là chất lỏng ở trên

 Đối với mẫu nguyên liệu dạng hạt từ alginat