Nghiên cứu sử dụng alginat phối hợp tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo vi nang chứa lactobacillus acidophilus

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1. Định nghĩa Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Theo nghĩa gốc, biotic hay biosis từ chữ life là đời sống, và pro là thân thiện, nên probiotic có thể hiểu theo nghĩa cái gì thân thiện với đời sống con người. Hiểu sát nghĩa hơn, đó là chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích 27, 40. Năm 1907, Elie Metchnikoff – người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Côdắc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908). Có thể nói Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic. Định nghĩa về probiotic phát triển theo thời gian. Lily và Stillwell đã mô tả probiotic như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác 41. Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 70 bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển vi sinh vật. Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ 41. Vì vậy, khái niệm “Probiotic” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột”. Định nghĩa chung này sau đó được làm chính xác hơn bởi Fuller vào năm 1989, theo ông “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” 35.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ LỆ QUYÊN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO

VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG

CHỨA Lactobacillus acidophilus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ LỆ QUYÊN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO

VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG

CHỨA Lactobacillus acidophilus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh – bộ môn Công

nghiệp Dược Trong thời gian thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự

quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình

Trước tiên, với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn

sâu sắc tới T.S Đàm Thanh Xuân - người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo

mọi điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi tôi hoàn thành khóa luận tốt

nghiệp

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn DS.Lê Ngọc Khánh và DS.Trần Văn Thái

đã nhiệt tình giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi thực hiện đề tài

Đồng thời, xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh

chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược trong suốt quá trình làm đề tài nghiên

cứu và thực nghiệm tại bộ môn

Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu nhà trường và toàn

thể thầy cô giảng viên Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện và truyền đạt cho tôi

những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè, những

người đã hết sức quan tâm và hỗ trợ tôi trong cuộc sống và học tập

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa

luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô,

bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Bùi Thị Lệ Quyên

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 2

1.1.1 Khái niệm về probiotic 2

1.1.2 Vai trò của probiotic 2

1.1.3 Các chủng probiotic phổ biến 3

1.1.4 Các thế hệ probiotic 3

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ Lactobacillus acidophilus 4

1.2.1 Đặc điểm hình thái 4

1.2.2 Tác dụng 4

1.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 5

1.3.1 Khái niệm đông khô 5

1.3.2 Ưu điểm của đông khô 5

1.3.3 Một số tá dược dùng bảo vệ trong đông khô 6

1.4 VI NANG HOÁ 6

1.4.1 Khái niệm 6

1.4.2 Đặc điểm 6

1.4.3 Phương pháp vi nang hoá bằng tách pha đông tụ 7

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 12

2.1.1 Chủng vi sinh vật 12

2.1.2 Hóa chất 12

2.1.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 12

2.1.4 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 12

2.1.5 Máy móc, dụng cụ 13

2.2.Nội dung nghiên cứu 14

2.2.1 Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp tinh bộtvới alginat 14

2.2.2 Khảo sát khả năng bảo vệ L acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong đường tiêu hoá 14

2.3.Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 14

2.3.2 Phương pháp nhân giống 14

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 15

2.3.4 Phương pháp tạo hạt vi nang chứa L.acidophilus 15

2.3.5 Phương pháp đông khô 16

2.3.6 Phương pháp xác định hàm ẩm 16

2.3.7 Phương pháp xác định đường kính hạt vi nang 16

2.3.8 Phương pháp xác định độ trương nở của hạt vi nang 17

2.3.9 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật trong hạt vi nang theo nguyên tắc pha loãng liên tục 18

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp tinh bột vớialginat 20

3.1.1 Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn đến thể chất hạt vi nang phối hợp tinh bột với alginat 20

3.1.2 So sánh khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy 22

3.2 Khảo sát khả năng bảo vệ L acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng 28

3.2.1 Khảo sát khả năng bao gói và giải phóng vi sinh vật của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong đường tiêu hóa mô phỏng 28

3.2.2 So sánh tác dụng bảo vệ L acidophilus của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng 31

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATCC (American Type Culture Collection)

ACE

CFU (Colony-Forming Units)

Cps (Cycles per second)

WHO (World health organization)

: Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ : Acetylcholinesterase

: Số đơn vị khuẩn lạc : Vòng/giây

: giờ : Vi khuẩn lactic

: Lactobacillus acidophilus : Lactobacillus gaseri : Lactobacillus rhamnosus : Bifidobacterium longum : Bifidobacterium bifidum

: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic : Môi trường

: Vi sinh vật : Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 2.1 Các hoá chất dùng trong nghiên cứu 12

2 Bảng 2.2 Các máy móc dùng trong nghiên cứu 13

3 Bảng 3.1 So sánh 2 phương pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm và Tyndall về

4 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tinh bột và sữa gầy đến thể chất hạt vi

5 Bảng 3.3 Độ trương nở của các loại hạt vi nang sau khi tiếp xúc

6 Bảng 3.4 Thời gian rã của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột

7

Bảng 3.5 Số lượng L acidophilus sống sót trong các hạt vi nang

phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy sau khi tiếp xúc với dịch dạ

dày mô phỏng

32

3 Hình 3.1 Hình ảnh hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và

4 Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện hàm ẩm và đường kính của hạt vi nang

phối hợp tinh bột và sữa gầy ngay sau đông khô 25

5 Hình 3.3 Hình ảnh phân tử tinh bột và sữa gầy phân tán trong

nước dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần 25

6

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn số lượng L acidophilus sống sót trong

các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy sau khi

tiếp xúc với dịch dạ dày mô phỏng

33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Probiotic là lợi khuẩn và là vấn đề được các nhà nghiên cứu quan tâm trong các thập kỉ gần đây.Ngày càng có thêm nhiều các bằng chứng khoa học về giá trị của probiotic trong việc hỗ trợ sức khỏe cho con người Các tác dụng có lợi của chế phẩm probiotic đặc biệt liên quan đến sự kích thích hệ thống miễn dịch, chống vi khuẩn cũng như đặc tính chống đột biến và chống ung thư, cải thiện tiêu hóa lactose, chuyển hóa protein, cholesterol hoặc calci [36] Tuy nhiên, trong quá trình

đi vào đường tiêu hóa, các lợi khuẩn phải chống chọi với các yếu tố bất lợi gặp phải trong dạ dày và đường ruột, chẳng hạn, môi trường acid của dịch vị, các enzym tiêu hóa và muối mật của ruột non làm suy giảm số lượng vi sinh vật Để cải thiện khả năng sống sót của probiotic, nhiều tác giả trên thế giới đã sử dụng các dạng bào chế như bao pellet, cốm, nhũ tương… và hoặc sử dụng các loại tá dược bảo vệ Một trong các hướng nghiên cứu đáng chú ý gần đây là sử dụng chất bảo vệ như sữa gầy, chitosan, tinh bột…để tạo vi nang

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài“Nghiên cứu

sử dụng alginat phối hợp tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo vi nang

chứa Lactobacillus acidophilus” với hai mục tiêu:

1.Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợptinh bột với alginat

2 Khảo sát khả năng bảo vệ L acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với

tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng

Chương 1.TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC

1.1.1 Khái niệm về probiotic

Probiotic là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, từ pro và biota, có nghĩa là

“dành cho sự sống”, dùng để chỉ những vi khuẩn sống có thể cạnh tranh với các tác nhân gây bệnh và giúp cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa [31]

Năm 2001 tổ chức y tế thế giới WHO định nghĩa: “Probiotic làvi sinh vật sống, khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn, sẽ mang lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [40]

1.1.2 Vai trò của probiotic

Kể từ những năm 1990, các nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh rằng liệu pháp probiotic có thể giúp điều trị một số căn bệnh tiêu hóa, làm chậm sự phát triển của bệnh dị ứng ở trẻ em, điều trị và ngăn ngừa nhiễm trùng âm đạo và tiết niệu ở phụ nữ… Có thể kể ra một số tác dụng như sau:

 Cải thiện chức năng miễn dịch:Probiotic là tác nhân quan trọng trong cải thiện

chức năng miễn dịch của cơ thể Probiotic có thể cải thiện chức năng miễn dịch bằng cách kích thích tăng số lượng tế bào sản xuất IgA, tăng tỷ lệ tế bào lympho

T và tế bào Killer tự nhiên [34], [37]

 Ngăn ngừa các vi khuẩn gây bệnh, lặp lại thế cân bằng vi khuẩn đường ruột:Probiotic có thể bảo vệ cơ thể, chống lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh

tranh chất dinh dưỡng và năng lượng Ngoài ra, trong quá trình trao đổi chất probiotic tạo ra các sản phẩm có tính kháng khuẩn như acid hữu cơ (acid lactic

và acid acetic), hydroperoxid, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, CO2, reuterin,

reutericyclin và bacteriocin…[34]

 Cải thiện tình trạng không dung nạp lactose:Vi khuẩn lactic tích cực chuyển

đổi lactose thành acid lactic Vì vậy, khi sử dụng các chế phẩm probiotic sẽ cải thiện được tình trạng không dung nạp lactose [42]

 Giảm cholesterol huyết thanh:Những nghiên cứu trên động vật đã chứng minh

tính hiệu quả của một số probiotic trong việc giảm lượng cholesterol huyết thanh

Một số thử nghiệm trên người cũng đã cho thấy sữa lên men với LAB làm giảm mức cholesterol [39]

 Huyết áp: Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tiêu thụ sữa chua lên men với

các chủng LAB khác nhau có thể dẫn đến giảm nhẹ huyết áp, điều này có thể giải thích do peptid tương tự yếu tố ức chế ACE sinh ra trong quá trình lên men[39]

 Tổng hợp vitamin nhóm B: Một số tác giả cho rằng thành phần vitamin B trong

các chế phẩm sữa lên men được sinh ra bởi vi sinh vật sinh acid lactic

1.1.3 Các chủng probiotic phổ biến

Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ

yếu thuộc chiLactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra Enterococcus và Streptococcus cũng được sử dụng nhưng ít hơn Những vi khuẩn này thường cư trú

trong ruột

Một số chủng tiêu biểu bao gồm:L acidophilus, L gasseri, L rhamnosus, B longum, B bifidum Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được xem là probiotic

1.1.4 Các thế hệ probiotic

Sản phẩm lên men tự nhiên: sữa chua, dưa chua, phô mai, kim chi… được dùng có lợi về mặt dinh dưỡng, nhưng chưa có tính hỗ trợ trị liệu một cách rõ ràng

Thế hệ thứ 1, probiotic không bao (non-coated): vi khuẩn được phân lập và

tăng số lượng để sử dụng, nhưng vẫn là vi khuẩn không bao nên khả năng sống sót khi qua dạ dày thấp và hiệu quả không được như mong muốn Các dòng sản phẩm như: Antibio, AbioGran, Biolac, Bio-Acimin, Bio-Baby…

Thế hệ thứ 2, dạng bao tan trong ruột (enteric – coated): vi khuẩn chứa trong

nang có lớp bảo vệ chỉ tan trong ruột, hầu hết probiotic được xử lý với một polyme acrylic acid Tác nhân bảo vệ này chỉ được cho phép sử dụng trong dược phẩm, không thích hợp trong thực phẩm bổ sung probiotic vì có thể gây tác dụng phụ [35]

Ví dụ: Primadophilus, Gr-8 Dophilus, …

Thế hệ thứ 3, dạng bao vi nang (micro-encapsulated): giúp vi khuẩn ổn định

trong quá trình bảo quản và chống chọi với môi trường dạ dày tốt hơn, nhưng lớp

bao không hòa tan hoàn toàn trong đường ruột, đặc biệt với những người có hệ ruột ngắn (trẻ em) hoặc những người ăn nhiều chất béo dẫn đến vi nang có xu hướng đi qua ruột và thải ra ngoài theo phân mà không hoặc tạo ít tác dụng có lợi Ví dụ: Lactomin

Thế hệ thứ 4, bao kép: probiotic được bao 2 lớp, hiệu quả cao và khắc phục

được nhược điểm phóng thích chậm ở ruột như cách bao của các thế hệ cũ Lớp bao polysaccharid giúp bảo đảm cho vi sinh vật sống tốt trong quá trình sản xuất và bảo quản, lớp bao protein có đặc tính đông vón trong môi trường acid giúp chống được tác động khi qua dịch dạ dày và muối mật để đến ruột Tại ruột, nhờ lớp protein có khả năng phân tán tốt trong pH trung tính hoặc hơi kiềm ở ruột, probiotic sẽ phóng thích tốt nhờ đó sản sinh nhanh chóng để phát huy tối đa tác dụng [35] Ví dụ: Kidlac, Lacclean Gold, Chewable 7.1, Yamyam

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ Lactobacillus acidophilus

Hình 1.1 Hình ảnhvi khuẩn Lactobacillus acidophilus

1.2.2 Tác dụng

 Có khả năng làm giảm số lượng các vi sinh vật có hại ở ruột non, có khả năng sinh lactase – một enzym quan trọng trong quá trình chuyển hóa sữa [21]

 Tổng hợp các vitamin, ngoài ra còn có khả năng sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn như Lactocidin, Bacteriocin

 Tạo môi trường acid là môi trường thuận lợi cho hệ vi sinh vật lên men đường ruột và đồng thời ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Gram âm [29]

 Chủng L acidophilus LA-5 có tác dụng lên hệ miễn dịch, làm lượng cytokine

tăng lên, tăng hoạt động thực bào và sản xuất kháng thể[26]

 Giảm nguy cơ bị ung thư, khối u [4], [11]

1.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ

1.3.1 Khái niệm đông khô

Đông khô là quá trình làm khô vật liệu ở nhiệt độ thấp, dưới các điều kiện cho phép, để loại trừ nước bằng cách thăng hoa, thay đổi trạng thái nước từ thể rắn sang thể hơi mà không qua thể lỏng [2], [23]

Quá trình đông khô thường chia thành ba giai đoạn: giai đoạn lạnh đông, giai đoạn thăng hoa, giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại

 Giai đoạn lạnh đông: Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc được làm lạnh đông riêng bên ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ điểm ba của ẩm

 Giai đoạn thăng hoa: Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng thời tiến hành hút chân không Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa, áp suất và nhiệt độ phải thấp hơn điểm ba Ẩm trong vật chuyển

từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua trạng thái lỏng

 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng thái lỏng Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa

1.3.2 Ưu điểm của đông khô

Do quá trình đông khô được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp

từ dạng rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp làm khô khác như: giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; giữ được hoạt tính

sinh học; bảo vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi; không làm biến chất albumin…; giữ nguyên được thể tích ban đầu của vật [2], [23]

1.3.3 Một số tá dược dùng bảo vệ trong đông khô

Do quá trình đông khô có ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi sinh vật nên người ta thường thêm chất bảo vệ vào sinh khối vi sinh vật trước khi đông khô

Tá dược là yếu tố quan trọng nhất trong việc làm tăng khả năng sống của vi sinh vật trong quá trình đông khô và làm giảm sự chết của vi sinh vật trong quá trình bảo quản Tá dược thường được sử dụng là sữa gầy, trehalose, glycerol, betain, adonitol, sucrose, glucose, lactose, acid amin (arginine, acid glutamic), peptid, protein, dịch chiết sinh học tự nhiên và polymer như dextran, polyethylene glycol [12], [27], [32]

1.4 VI NANG HOÁ

Hiện nay, phần lớn các nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm probiotic trên thị trường là dạng bột đông khô do khả năng duy trì số lượng VSV sống trong quá trình bảo quản dài Tuy nhiên, việc duy trì khả năng sống sót của VSV trong hệ thống tiêu hoá lại là một vấn đề lớn Một trong những hướng giải quyết được quan tâm hiện nay là cung cấp cho các VSV một hàng rào bảo vệ vật lý để chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường, trong đó phải kể đến kỹ thuậtvi nang hoá [41]

1.4.1 Khái niệm

Vi nang hoá là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay Phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polymer có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamide, polystyrene, polyacrylat, polyacrylamide, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylene glycol (PEG)… để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật trong các nang nhỏ[8], [10]

1.4.2 Đặc điểm

Vi nang hóa giúp ngăn cách nguyên liệu trong lõi với môi trường cho tới khi chúng được giải phóng, vì thế cải thiện khả năng ổn định, kéo dài tuổi thọ của nguyên liệu trong lõi và giải phóng ổn định, có kiểm soát Vi nang có thể có kích

thước từ dưới μm đến vài mm và có thể có các hình dạng khác nhau Vi nang là màng chắn bán thấm, hình cầu và mỏng, giúp tế bào vi khuẩn được giữ lại trong vi nang, chất dinh dưỡng và chất chuyển hóa có thể phân tán qua màng bán thấm dễ dàng Màng vi nang cung cấp một rào chắn để bảo vệ tế bào và làm giảm thiểu sự nhiễm khuẩn Lõi nguyên liệu bao gói được giải phóng theo nhiều cơ chế như: đứt gãy màng chắn, hòa tan màng chắn, tan chảy màng chắn và khuếch tán qua màng [41]

1.4.3 Phương pháp vi nang hoá bằng tách pha đông tụ

1.4.3.1 Nguyên tắc

Tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự hóa muối hoặc khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ vi nang Tác động vào dung dịch keo trong một dung môi thích hợpnhằm thay đổi độ tan của nó, kết quả là một lượng đáng kể keo được tách ra thành pha mới Như vậy hệ trở thành hai pha, một pha có nồng độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ Sau đó, các giọt đông

tụ dần kết dính lại với nhau hoặc hấp phụ trên bề mặt chất cần bao gói tạo thành lớp màng bao

1.4.3.2 Nguyên liệu Alginat

Cấu tạo, nguồn gốc: Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic

Acid alginic là một heteropolymer saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc uronic

là acid α-L-guluronic và acid β-D-mannuronic nối với nhau bằng liên kết

Độ nhớt: Natri alginat tan trong nước tạo dung dịch có độ nhớt dao động

trong khoảng từ 10 – 3500 cps Độ nhớt của dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh của phân tử alginat Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của ion kim loại[24]

Khả năng tạo gel: Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với

các ion kim loại hóa trị II, III, sự tạo gel được giải thích theo mô hình vỉ trứng Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại block M và block G tương ứng là các dải hẹp

và các dải gấp khúc Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng.Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều Với cấu trúc gel này, khi

sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng có kiểm soát [33]

Ưu điểm: Alginat không độc, tạo gel dễ dàng với Calci clorid, gel có độ ổn

định cao Vi khuẩn sống không bị ảnh hưởng trong suốt quá trình vi nang hoá Alginat có độ ổn định cao, độ xốp cao và có khả năng chống chịu các muối và chất

tạo phức

Nghiên cứu về hạt vi nang tạo bởi alginat: Vi nang alginat đã được sử

dụng trong nhiều nghiên cứu để bảo vệ tế bào, protein, vi khuẩn, các loại thuốc kém bền với dịch vị [33]…Trong đó, nghiên cứu của Eng-Shen Chang và cộng sự (2011) cho thấy vi nang tạo bởi alginat đơn thuần có cấu trúc là các lớp đồng tâm, khi thêm

tá dược độn thì chúng lấp vào các khoảng trống, hỗ trợ cấu trúc mạng gel và ngăn cấu trúc bị co ngót khi đông khô Ngoài ra, hình ảnh nhiễu xạ tia X còn cho thấy khi

tá dược thêm vào ở nồng độ thấp thì chúng phân bố không đồng đều Tại nồng độ 200g/l, tá dược độn chủ yếu tập trung trong lõi hơn là bề mặt vi nang, do sự hình thành gel diễn ra từ bề mặt vào trong nên không gian trống ở bề mặt ít hơn bên trong lõi vi nang Khi nồng độ tá dược độn lên đến 600g/l, chúng phân bố đồng đều

khắp vi nang [22]

Hình 1.2 (a1-3) hình ảnh chụp CT cắt lớp tia X và (b1-3) hình ảnh kính hiển vi

điện tử quét của hạt alginat đông khô ở các nồng độ tá dược độn khác nhau

Tính chất: Trong môi trường acid, tinh bột bị thuỷ phân thành sản phẩm hoà

tan Ở môi trường acid mạnh, sản phẩm thuỷ phân cuối cùng là glucose Trong môi trường kiềm, tinh bột bị ion hoá từng phần do sự hydrat hoá tốt hơn Tinh bột ở dạng hạt hoặc tinh bột chưa xử lý thì khó bị tấn công bởi những enzym thuỷ phân

Khi hoà tan tinh bột vào nước, do sự hấp thụ nước làm hạt tinh bột trương phồng lên, tăng thể tích Hiện tượng này gọi là hiện tượng trương nở của tinh bột Trên 55-70oC, các loại tinh bột trương lên do hấp thụ nước vào các nhóm hydroxyl phân cực, độ nhớt của dung dịch tăng mạnh Kéo dài thời gian xử lý nhiệt có thể gây nổ vỡ hạt tinh bột, thuỷ phân từng phần và hoà tan phần nào các phần tử cấu

thành của tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch [9]

Ưu điểm: Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, tương thích sinh học, phân

huỷ sinh học Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch [15] Tinh bột là

tá dược độn phổ biến, giá rẻ và có thể tiêu hoá được [22] Tinh bột thường được sử dụng để ổn định thực phẩm trong sản xuất sữa chua vì vậy tính tương hợp sinh học

và độc tính của nó với vi khuẩn đã được thử nghiệm rộng rãi [30]

Tình hình nghiên cứu:

Năm 2000, nghiên cứu của Khalida Sultanavà cộng sự đã chỉ ra vi nang hoá

Lactobacillus acidophilus và Bifidobacteriumspp trong Ca-alginat-tinh bột giúp

tăng gấp đôi số lượng tế bào sống sót so với dạng tế bào tự do khi bảo quản trong sữa chua sau 8 tuần, nhưng không cải thiện khả năng sống sót trong dịch dạ dày mô phỏng [28]

Năm 2013, Martin và cộng sự báo cáo tinh bột giúp nâng cao khả năng sống

sót củaLactobacillus fermentumtrong quá trình đông khô và bảo quản ở 4oC [30]

Năm 2014, Kabravi cùng cộng sự đã tiến hành so sánh khả năng sống sót của

Lactobacillus casei ở dạng tế bào tự do, dạng vi nang hoá trong alginat-tinh bột

không bao và có bao chitosan trong dịch dạ dày mô phỏng, kết quả cho thấy dạng vi nang hoá có tác dụng bảo vệ VSV rõ rệt (3,3 – 4,2 log), trong đó dạng bao chitosan cho tỉ lệ VSV sống sót cao gấp 10 lần dạng không bao [25]

Ở Việt Nam, tác giả Mai Hương (2014) đã báo cáo tinh bột có hiệu quả bảo

vệ L acidophilus trong quá trình vi nang hoá, đông khô và bảo quản [6]

 Sữa gầy

Sữa gầy là các sản phẩm sữa mà trong thành phần có chứa không quá 0,5% chất béo Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa gầy: 32% - 35,7% protein;

48,4%- 54,1% lactose

Tình hình nghiên cứu:

Năm 2000, Charteris và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của sữa gầy lên

khả năng chống chọi của Lactobacillus casei và Bifidobacterium infantis với điều

kiện khắc nghiệt của dịch dạ dày và dịch muối mật, và báo cáo rằng sữa gầy có khả năng nâng cao sức chống chọi của VSV với dịch dạ dày nhưng không có hiệu quả với dịch muối mật [17]

Arnaud Picot và cộng sự (2004) đã nghiên cứu vi nang hoá Bifidobaterium breve trong Ca-alginat phối hợp với sữa gầy, kết quả cho thấy, vi nang Ca-alginat-

sữa gầy đã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của VSV trong dịch dạ dày và dịch ruột mô phỏng (+ 2,7 log) so với khi tế bào ở dạng tự do, nhưng với chủng

Bifidobacterium longum không thấy có hiệu quả bảo vệ [16]

Năm 2005, Ainsley Reid và cộng sự báo cáo rằng vi nang hoá Lactobacillus rhamnosustrong nang Ca-alginat-sữa gầy cải thiện khả năng sống sót của VSV

trong dịch dạ dày sau 90 phút và trong muối mật sau 30, 60, 90 phút Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy, trong muối mật, dịch sữa gầy có tác dụng bảo vệ VSV tốt tương đương với vi nang Ca-alginat-sữa gầy [13]

Chương 2.NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

Glucose Trung Quốc Triamoni citrat Trung Quốc

Cao thịt Merck-Đức Natri citrat Trung Quốc

Cao nấm men Merck-Đức Alginat Ấn Độ

K2HPO4 Trung Quốc Calci clorid Trung Quốc

MgSO4.7H2O Trung Quốc Tinh bột sắn Việt Nam

MnSO4.4H2O Trung Quốc Thạch (Agar) Việt Nam

Natri clorid Trung Quốc Sữa gầy Trung Quốc

2.1.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Natri acetat

K2HPO4MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O Nước máy vừa đủ 1.000ml

5,0 g 2,0g 0,2g 0,05g

pH 6,8-7,0

 Môi trường MRS thạch (MT2)

MT2=MT1 + thạch (25g thạch/1.000ml môi trường)

2.1.4 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

- Dung dịch sữa gầy 20%: cân chính xác 20,00g sữa gầy, phân tán đều trong

Tủ cấy vô trùng Nhật (Sanyo) Nồi hấp tiệt khuẩn ALP-Nhật

Tủ ấm CO2 Nhật (Sanyo) Cân phân tích Đức (Satorious)

Thiết bị đông khô Đức Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd )

vòng vô khuẩn (sử dụng

đo kích thước hạt vi nang)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp tinh bộtvới alginat

 Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn đến thể chấthạtvi nang phối hợp tinh bột với alginat

 So sánh khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy

2.2.2 Khảo sát khả năng bảo vệ L acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng

 Khảo sát khả năng bao gói và giải phóng vi sinh vật của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong đường tiêu hóa mô phỏng

 So sánh tác dụng bảo vệ L acidophilus của hạt vi nang phối hợp alginat

với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn

2.3.1.1 Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được đựng trong bình nón, đậy kín bằng nút bông, sau đó tiệt trùng trong nồi hấp (Auto clave) ở 115o

C, 0,6atm trong 20 phút

2.3.1.2 Tiệt khuẩn bằng Tyndall

Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được đựng trong bình nón, đậy kín bằng nút bông, để ở 70oC – 80oC trong 1 giờ, ủ bình trong tủ 37oC trong 24h Lặp lại thao tác trên trong 3 ngày liên tục

2.3.2 Phương pháp nhân giống

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan hết các thành phần Hút 10ml môi trường MRS lỏng vào mỗi ống nghiệm sạch.Tiến hành tiệt khuẩn môi trường bằng nhiệt ẩm, sau đó để nguội xuống khoảng 37-40oC.Cấy giống vào ống nghiệm trên.Ủ các ống nghiệm đã

được cấy giống VSV trong tủ ấm 5% CO2 trong 24h ở 37±1oC

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan hết các thành phần Chuyển môi trường MRS lỏng vào bình nón có dung tích thích hợp Tiến hành tiệt khuẩn môi trường bằng phương pháp nhiệt ẩm, sau đó để nguội xuống khoảng 37-40oC Cấy giống vào các bình nón trên trong tủ cấy vô trùng (tỉ lệ cấy giống: 10% thể tích môi trường) Ủ trong tủ ấm 5% CO2 trong 24h ở nhiệt độ 37±1oC

2.3.4 Phương pháp tạo hạt vi nang chứa L.acidophilus

Phương pháp thu sinh khối

Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trường MRS ở điều kiện 37oC trong 24h trong tủ ấm 5% CO2 (phương pháp nêu trong mục 2.3.2).Dịch nuôi cấy được cho vào ống li tâm đã hấp tiệt trùng.Tiến hành li tâm các ống này với tốc độ

4000 vòng/phút trong 15 phút.Gạn bỏ phần dịch trong, thu sinh khối

Phương pháp tạo hạtvi nang phối hợp

 Tạo hỗn dịch vi nang

Hạt phối hợp tinh bột 10%:Phân tán đều sinh khối thu được trong 100ml

nước cất bằng máy lắc Hỗn dịch sinh khối trong nước cất đem phối hợp với 100ml dung dịch alginat 4% và 20g tinh bột bằng khuấy từ trong 15 phút thu được 200ml hỗn dịch sinh khối trong dung dịch alginat 2% và tinh bột 10%

Hạt phối hợp tinh bột 5% + sữa gầy 5%:Phân tán đều sinh khối thu được

trong 100ml sữa gầy 10% bằng máy lắc Hỗn dịch sinh khối trong nước cất đem phối hợp với 100ml dung dịch alginat 4% và 10g tinh bột bằng khuấy từ trong 15 phút thu được 200ml hỗn dịch sinh khối trong dung dịch alginat 2%, tinh bột 5% và sữa gầy 5%

Hạt phối hợp sữa gầy 10%:Phân tán đều sinh khối thu được trong 100ml sữa

gầy 20% bằng máy lắc Hỗn dịch sinh khối trong nước cất đem phối hợp với 100ml dung dịch alginat 4% bằng khuấy từ trong 15 phút thu được 200ml hỗn dịch sinh khối trong dung dịch alginat 2% và sữa gầy 10%

 Tạo hạt vi nang

Đùn nhỏ giọt hỗn dịch vi nang qua đầu kim truyền 25G vào dung dịch CaCl2

2% tạo thành các hạt hình cầu Để yên 30 phút cho hạt ổn định, sau đó vớt hạt, rửa hạt ba lần bằng dung dịch NaCl 0,9%

2.3.5 Phương pháp đông khô

 Tiền đông: các mẫu được làm đông lạnh trong tủ lạnh sâu ở -80o

C trong 24h cho đông rắn hoàn toàn

 Làm khô: các mẫu được làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô ở nhiệt độ khoảng -50oC; áp suất 0,055mbar trong 24h

 Kết thúc quá trình đông khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, chuyển các mẫu nguyên liệu vào bao polymer có khóa, để trong hộp nhựa PVC, đậy kín rồi bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4oC

2.3.6 Phương pháp xác định hàm ẩm

Tiến hành đo trên thiết bị đo hàm ẩm Ohaus

Làm nhỏ mẫu cần đo hàm ẩm trong túi polymer kín Cho lên mặt đĩa của thiết bị khoảng 1g mẫu, dàn đều mẫu ra mặt đĩa, đậy nắp, chạy máy.Chờ máy gia nhiệt trong khoảng 5 phút hoặc đến khi máy hiện kết quả.Đọc, ghi lại số liệu hàm

ẩm của mẫu hiển thị trên màn hình.Làm 3 lần, lấy kết quả trung bình

2.3.7 Phương pháp xác định đường kính hạt vi nang

Tiến hành đo trên máy đo kích thước vòng vô khuẩn

Đặt hạt vi nang trên mặt kính đo, điều chỉnh máy và đọc kết quả Tiến hành với các hạt vi nang ngẫu nhiên trong mẫu Đường kínhcủa loại hạt vi nang được tính theo công thức sau:

𝒅 = 𝒅𝒕𝒃± 𝑺𝑫 Trong đó:

𝑑 : Đường kínhcủa loại hạt vi nang

𝑑𝑡𝑏 : Đường kính trung bình của loại hạt vi nang được tính theo công thức: