Nghiên cứu sử dụng tinh bột và alginat làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu lactobacillus acidophilus đông khô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN VĂN THÁI NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT VÀ ALGINAT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU LACTOBACILLUS ACIDOPHILU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN VĂN THÁI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT VÀ ALGINAT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU

LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

ĐÔNG KHÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN VĂN THÁI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT VÀ ALGINAT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU

LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

ĐÔNG KHÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ

LỜI CẢM ƠN

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS Đàm

Thanh Xuân, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện và hoàn thiện luận văn

Đồng thời, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã cho tôi những lời khuyên quý báu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

và hoàn thiện luận văn

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, thư viện, cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ

và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi học tập tại Trường

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Hội đồng quản trị, Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Dược Phú Thọ đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập, làm việc, giúp tôi hoàn thành tốt hơn luận văn này

Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 31 tháng 08 năm 2015

Dược sĩ

Trần Văn Thái

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về Probiotic 2

1.1.1 Khái niệm Probiotic 2

1.1.2 Các vi sinh vật probiotic 2

1.1.3 Vai trò 3

1.1.4 Cơ chế tác dụng 5

1.2 Phương pháp đông khô 5

1.2.1 Khái niệm 5

1.2.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô 5

1.2.3 Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô 6

1.2.4 Ứng dụng của phương pháp đông khô 6

1.2.5 Một số tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật 7

1.3 Phương pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu Probiotic 11

1.3.1 Khái niệm, đặc điẻm vi nang hóa probiotic 11

1.3.2 Ưu nhược điểm của phương pháp vi nang hóa 13

1.3.3 Phương pháp tách pha đông tụ 14

1.3.4 Tá dược vi nang hóa 16

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU19 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 19

2.1.1 Nguyên vật liệu 19

2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 19

2.1.3 Thiết bị 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp nhân giống 21

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 21

2.3.3 Phương pháp vi nang hóa bằng alginat 22

2.3.4 Phương pháp đông khô 23

2.3.5 Phương pháp xác định hàm ẩm 23

2.3.6 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng liên tục .24

2.3.7 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật sống sót trong điều kiện môi trường pH dạ dày và pH ruột 25

2.3.8 Phương pháp tiệt khuẩn 26

2.3.9 Phương pháp xác định độ trương nở hạt vi nang 26

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28

3.1 Tạo nguyên liệu chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus với chất bảo vệ 28

3.1.1 Đánh giá cảm quan, thể chất của các nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus tạo thành đông khô khi kết hợp alginat và sữa gầy 28

3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi nang sau đông khô 30

3.1.3 So sánh khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy…… 33

3.1.4 Khảo sát tác dụng bảo vệ của tinh bột và alginat trong quá trình đông khô Lactobacillus acidophilus khi tạo dạng vi nang 37

3.1.5 Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic dạng vi nang 39

3.2 Đánh giá khả năng bảo vệ lactobacillus acidophilus của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong đường tiêu hóa mô phỏng .41

3.2.1 Khảo sát khả năng bao gói vi sinh vật của hạt vi nang trong môi trường acid pH dạ dày 41

3.2.2 Khảo sát khả năng giải phóng vi sinh vật của hạt vi nang trong môi trường pH ruột 42

3.2.3 So sánh tác dụng bảo vệ Lactobacillus acidophilus của hạt vi nang phối hợp

alginat với tinh bột và sữa gầy trong môi trường pH dạ dày .43

3.3 Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu L acidophilus đông khô trong thời gian

bảo quản và xây dựng công thức, tiêu chuẩn nguyên liệu tạo thành 45

3.4 Xây dựng công thức và tiêu chuẩn nguyên liệu tạo thành 46

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 48

4.1 Bàn luận về tạo nguyên liệu đông khô chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus với các chất bảo vệ 48

4.1.1 Tạo nguyên liệu lactobacillus acidophilus đông khô sử dụng alginat kết hợp

với sữa gầy .48

4.1.2 Tạo nguyên liệu lactobacillus acidophilus đông khô sử dụng alginat kết hợp

với tinh bột .49

4.1.3 Tạo nguyên liệu lactobacillus acidophilus đông khô sử dụng alginat kết hợp

với tinh bột và sữa gầy 52 4.1.4 Tác dụng bảo vệ của tinh bột và alginat trong quá trình đông khô

Lactobacillus acidophilus khi tạo dạng vi nang .54

4.1.5 Lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu đông khô Probiotic dạng vi nang 56

4.2 Bàn luận về khả năng bảo vệ Lactobacillus acidophilus của hạt vi nang phối

hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong đường tiêu hóa mô phỏng 58

4.3 Bàn luận về độ ổn định của nguyên liệu Lactobacillus acidophilus đông khô

trong thời gian bảo quản 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

(Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì) CFU, cfu

CMC

: Colony – Forming Units (Số đơn vị khuẩn lạc) : Carboxylmethyl cellulose

(Tổ chức Nông lương thế giới)

(Liên đoàn sữa quốc tế)

DANH MỤC CÁC BẢNG

5

Bảng 3.3 Đường kính hạt vi nang, hàm ẩm và thể chất của các

mẫu nguyên liệu chứa L acidophilus dạng vi nang với các nồng

độ tinh bột ngay sau đông khô

10 Bảng 3.8 Độ trương nở của các loại hạt vi nang sau khi tiếp xúc

11 Bảng 3.9 Thời gian rã của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh

12

Bảng 3.10 Số lượng L acidophilus sống sót trong hạt vi nang

phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy sau khi tiếp xúc với môi

trường pH dạ dày

44

3 Hình 3.2 Hình ảnh hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa

6

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn lượng vi sinh vật sống và hàm ẩm của

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thời gian gần đây, các sản phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotic đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng Probiotic ngày càng được bào chế dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như bột, cốm, viên nén, viên nang hay sử dụng trong các sản phẩm cho đường dùng khác như viên đặt, kem bôi da Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn probiotic trong các chế phẩm này còn thấp [49], [51] Nguyên nhân là do các vi sinh vật này rất nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện môi trường bảo quản như nhiệt

độ, độ ẩm, nồng độ oxy hòa tan và hàng rào sinh học của hệ tiêu hóa như pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật Do đó, trong quá trình bảo quản và sau khi vi khuẩn được đưa vào hệ tiêu hóa, số lượng vi khuẩn bị giảm đáng kể làm hạn chế tác dụng của chế phẩm [39], [42]

Để giải quyết vấn đề này, cần phải tìm ra những phương pháp gia tăng tỉ lệ sống sót và khả năng chống chịu của vi khuẩn probiotic trước các điều kiện bất lợi trong sản xuất, bảo quản và sử dụng Một trong các hướng nghiên cứu đáng chú ý trong thời gian gần đây là sử dụng tinh bột và alginat như một tác nhân bảo vệ nhằm gia tăng tỉ lệ sống sót của các vi khuẩn probiotic trong quá trình đông khô

Xuất phát từ các lí do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng

tinh bột và alginat làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu

Lactobacillus acidophilus đông khô” nhằm 2 mục tiêu sau:

1 Tạo nguyên liệu đông khô chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus với các chất

bảo vệ: sữa gầy, tinh bột và alginat

2 Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu tạo thành trong thời gian bảo quản; trong môi trường pH dạ dày, pH ruột và xây dựng công thức, tiêu chuẩn nguyên liệu probiotic

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về Probiotic

1.1.1 Khái niệm Probiotic

Probiotic là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho sự sống”, dùng để chỉ những vi khuẩn mang lại những tác động có lợi cho con người

và cho vật chủ [58]

Từ hàng nghìn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên men với mục đích tăng cường sức khỏe Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỉ XIX, nhà khoa học người Nga Elie Metchnikoff mới thực sự nghiên cứu vấn đề này trên cơ sở khoa học Thuật ngữ “Probiotic” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi Kollath Theo ông, Probiotic là “các yếu tố có nguồn gốc từ vi khuẩn, kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác”[27] Năm 1989, Fuller đã đưa ra một định nghĩa khác về Probiotic: “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” [48] Năm 2002, WHO và FAO đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về Probiotic ở thời điểm hiện tại như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ”[57], [58] Theo FAO, để có được hiệu quả thực sự thì VSV trong các chế phẩm probiotic cần phải đến được vị trí tác dụng trong đường tiêu hóa Do trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotic phải đối mặt với các điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng, các chế phẩm probiotic phải chứa ít nhất

106 – 107cfu/ml tế bào VSV sống cho đến ngày hết hạn sử dụng để đảm bảo tác dụng điều trị (FAO/WHO) [33], [52]

1.1.2 Các vi sinh vật probiotic

Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic là:

Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus Trong đó Lactobacillus và Bifidobacterium là hai loại vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất [52] Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, thuộc

nhóm vi khuẩn lactic Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn Gram (+), kích thước

từ 0,6 – 0,9 × 1,5 – 6,0µm, mọc đơn hoặc mọc đôi tạo thành chuỗi ngắn không sinh bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm tính Nhiệt độ phát triển: tối ưu 37oC, không phát triển trong khoảng 20oC – 22oC, tối đa trong khoảng 43oC – 48oC Tên gọi của loài có nghĩa là “ưa acid” cho thấy loài có thể phát triển trong môi trường acid, pH khoảng 5 - 6, thời gian 24 – 36h [2]

L acidophilus chiếm tỉ lệ chủ yếu trong số các vi sinh vật có ích cư trú ở đoạn

trên của ống tiêu hóa [32] Chúng có khả năng làm giảm số lượng các vi sinh vật hoặc nấm có hại ở ruột non; có khả năng sinh lactase – một enzym quan trọng trong

quá trình chuyển hóa sữa Trong quá trình tiêu hóa, L acidophilus còn tham gia sản sinh niacin, acid folic, pyridoxin Một vài nghiên cứu đã chứng minh L acidophilus

làm tăng cường chức năng của hệ tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch cơ thể, ngăn chặn bệnh tiêu chảy và làm giảm triệu chứng khó tiêu [32]

Với những đặc điểm trên, L acidophilus là lựa chọn hàng đầu để sản xuất các

chế phẩm probiotic

 Đặc điểm hạn chế của L acidophilus

Khả năng sống sót của L acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: pH, sự

acid hóa trong sản phẩm lên men, sản phẩm hydroperoxid, nồng độ oxy hòa tan (khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ bảo quản, độ

ổn định của dạng khô hoặc đông khô…[50], [51] Trong đó, nồng độ oxy hòa tan có

vai trò đáng kể trong việc hạn chế khả năng sống sót của L acidophilus Do đó, sau một thời gian bảo quản, số lượng L acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [28]

1.1.3 Vai trò

Probiotic có một số tác dụng chính như sau:

 Ứng dụng trị liệu trong một số bệnh đường tiêu hóa ở người:

- Ngăn chặn bệnh tiêu chảy:

Probiotic được chứng minh là có tác dụng trong 5 loại tiêu chảy: tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, do nhiễm khuẩn, do nhiễm virus, tiêu chảy ở người đi du lịch, tiêu chảy do không dung nạp lactose Hai tác nhân có hiệu quả với những bằng chứng rõ ràng trong việc phòng ngừa tiêu chảy do kháng sinh là vi khuẩn

Lactobacillus rhamnosus GG và nấm men S boulardii (S cerevisiae)[54] Các tác

nhân khác đang được nghiên cứu là Bacillus clausii, B longum, L acidophilus, L

bulgaricus, L plantarum, Enterococcus faecium, Clostridium butyricum [14], [54]

- Tác dụng lên Helicobacter pylori (H pylori)

Helicobacter pylori đóng vai trong chủ yếu trong nguyên nhân và bệnh sinh loét

dạ dày tá tràng Các nghiên cứu dùng kết hợp phương pháp điều trị bằng PPI và kháng sinh với chế phẩm probiotic đã làm giảm đáng kể tác dụng không mong muốn của kháng sinh đến hệ vi sinh vật đường tiêu hóa Do vậy, sử dụng probiotic

để phòng ngừa các bệnh lí liên quan đến viêm loét dạ dày tá tràng là một hướng điều trị được chú ý trong những năm gần đây [27], [32], [53]

Ngoài ra, probiotic còn có một số tác dụng khác như: “tăng cường khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzym khác”, “điều trị rối loạn tiêu hóa do dùng kháng sinh”[14], “viêm ruột mạn tính”, “bội nhiễm ở ruột non”, “điều trị ung thư ruột kết” [32]

 Tăng cường miễn dịch

Vi khuẩn lactic làm tăng cả 2 loại đáp ứng miễn dịch: miễn dịch đặc hiệu (tăng sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh tế bào lympho) và miễn dịch không đặc hiệu - miễn dịch tự nhiên (tăng cường chức năng của đại thực bào, tăng số lượng và tăng hoạt động của tế bào diệt tự nhiên) [9], [39], [45], [52]

 Hạ cholesterol máu

Vi khuẩn probiotic có thể lên men carbohydrat không thể tiêu hóa được và tạo các acid béo chuỗi ngắn trong ruột, những chất này ức chế sự tổng hợp cholesterol trong gan hoặc tái phân phối cholesterol từ huyết tương đến gan, vì vậy làm giảm lượng cholesterol trong máu Các chủng đơn lẻ có thể phân hủy muối mật và cản trở

sự hấp thu cholesterol từ đường ruột [27], [53]

 Chống lại tác nhân gây ung thư

Tác dụng chống khối u của probiotic có thể do một số cơ chế sau: gắn với tác nhân đột biến, sản xuất các chất chống đột biến, ức chế enzym tiền ung thư như nitroreductase và β-glucuronidase, tăng cường sản xuất β-glucosidase, chất giải phóng flavonoids, sản xuất các chất chống oxy hóa [27]

1.1.4 Cơ chế tác dụng

- Cạnh tranh năng lượng, vị trí bám

Probiotic khi phát triển trong đường tiêu hóa sẽ cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng với các vi khuẩn gây bệnh, từ đó hạn chế sự sinh trưởng và phát triển

của chúng Một số nghiên cứu in vitro cho thấy cả hai dạng vi khuẩn L acidophilus

còn sống hoặc đã chết do nhiệt đều có khả năng ức chế sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh [9], [58]

- Kích thích đáp ứng miễn dịch

Bằng việc bám dính vào niêm mạc ruột – nơi có nhiều tế bào lympho, probiotic kích thích cả miễn dịch tại chỗ và miễn dịch toàn bộ cơ thể Chúng làm tăng cả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu bằng cách kích thích các tế bào tham gia phản ứng miễn dịch (macrophase, lymphocytes) và tăng cường sản xuất các chất tham gia miễn dịch (cytokines, immunoglobulins, interferon) [52]

Ngoài ra một số cơ chế khác có thể kể đến như: “sản sinh ra các chất kháng khuẩn”, “tăng cường khả năng chống đỡ của niêm mạc ruột”, “tăng cường chức năng của hệ tiêu hóa” [9], [39]

1.2 Phương pháp đông khô

1.2.1 Khái niệm

Đông khô (sấy thăng hoa) là phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng cách thăng hoa, nghĩa là ẩm được chuyển thẳng từ pha rắn sang pha hơi mà không qua trạng thái lỏng Muốn vậy trước khi đông khô phải biến ẩm trong vật liệu thành thể rắn, nghĩa là phải tiến hành làm lạnh đông vật liệu Như vậy, đông khô được thực hiện ở môi trường có độ chân không cao và nhiệt độ rất thấp (thường là âm) Chế độ làm việc phải thấp hơn điểm ba của nước Ở áp suất nhất định, nhiệt độ thăng hoa của vật là không đổi, khi áp suất tăng thì nhiệt độ thăng hoa cũng tăng [43]

1.2.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô

 Giai đoạn lạnh đông

 Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc được làm lạnh đông riêng bên ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ điểm ba của ẩm [43]

 Giai đoạn thăng hoa

Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng thời tiến hành hút chân không Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa: áp suất và nhiệt độ phải thấp hơn điểm ba Ẩm trong vật chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua trạng thái lỏng [43]

 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại

Ở giai đoạn này, nhiệt độ của vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng thái lỏng Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết

bị sấy chân không bình thường Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa [43]

1.2.3 Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô

 Ưu điểm

Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp từ dạng rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy khác như: giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; giữ được hoạt tính sinh học; bảo

vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin…; giữ nguyên được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ nước để trở lại trạng thái ban đầu [43]

 Nhược điểm

- Giá thành thiết bị cao

- Vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao

- Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao

Do những ưu nhược điểm trên nên đông khô chỉ được áp dụng khi yêu cầu sản phẩm phải có chất lượng cao [43]

1.2.4 Ứng dụng của phương pháp đông khô

Đông khô được ứng dụng trong ngành dược: trong sản xuất các thuốc kháng sinh (penicillin, cephalexin ); làm khô các chế phẩm sinh học như albumin, vi sinh vật Ngoài ra, đông khô cũng được sử dụng như một phương pháp bảo quản trong các ngành công nghiệp thực phẩm, vi sinh, thú y để bảo quản một số sản phẩm khác [43]

1.2.5 Một số tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật

Đông khô là một trong những phương pháp phổ biến nhất để sản xuất lượng lớn

vi sinh vật với nồng độ cao [22] Tuy nhiên, trong quá trình này, vi khuẩn vẫn gặp phải nhiều điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong giai đoạn tiền đông Một số nghiên cứu cho rằng các biến đổi sinh học xảy ra trong quá trình chuyển nước thành băng

là nguyên nhân chính gây tổn thương cho tế bào Các tinh thể nước đá lớn hình thành bên ngoài tế bào gây ra một áp lực thẩm thấu lớn do làm tăng nồng độ chất tan bên ngoài tế bào làm tế bào bị mất nước, giảm khối lượng dẫn đến một số tình trạng như thay đổi cấu trúc màng tế bào, mất hoặc hợp nhất lớp màng kép hay phá hủy các cơ quan trong tế bào Tiếp theo là sự hình thành các tinh thể nước đá bên trong tế bào Cơ chế chính xác gây tác hại từ băng trong tế bào vẫn chưa rõ ràng, nhưng có thể do sự phá hủy vật lý của màng tế bào, sự hình thành bong bóng khí trong tế bào và phá vỡ bào quan [23] Một số nghiên cứu khác lại cho rằng nước kết tinh và nhiệt độ thấp làm biến tính protein và tổn thương màng vi khuẩn tế bào vi khuẩn, làm cho vi khuẩn giảm khả năng tồn tại, độ nhạy cao hơn với không khí và mất khả năng sinh sản [42] Để ngăn chặn hoặc giảm thiểu các tác dụng bất lợi này, nhiều chất đã được sử dụng như tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô [22] Các chất bảo vệ hay tá dược đông khô (Cryoprotectant – CPA) là các chất được thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của VSV trong quá trình làm khô [42] Một số tá dược được sử dụng trong đông khô:

- Sữa gầy: là sữa béo đã loại bỏ các acid béo, thành phần gồm lactose (chủ yếu), acid amin, các vitamin và khoáng chất

- Các loại đường: glucose, lactose, dextrin glucose,

- Các acid amin: arginin, acid glutamic,

- Peptid, protein, dịch chiết sinh học tự nhiên và polyme

1.2.5.1 Sữa gầy

Sữa gầy hay còn gọi là “skim milk” là các sản phẩm sữa mà trong thành phần

có chứa không quá 0,5% chất béo Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa gầy: 32% - 35,7% protein; 48,4% - 54,1% lactose

Sữa gầy có trong các chế phẩm đông khô probiotic vì nó có tác dụng bảo vệ tốt probiotic trong quá trình đông khô Theo nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước từ trước tới nay thì sữa gầy sử dụng ở nồng độ khoảng 10% cho tỉ lệ sống sót cao nhất Tác dụng bảo vệ này có thể do nó chứa tỉ lệ lớn protein và carbohydrat - những chất

có khả năng bảo vệ tế bào

Thành phần lactose có trong sữa gầy cũng như một số disaccharid khác có thể thấm qua thành tế bào, sau đó chúng hình thành liên kết hydro giữa đường - protein Các liên kết này giúp duy trì cấu trúc của protein màng khi nước bị loại đi Protein giúp hình thành trạng thái glass xung quanh và bên trong tế bào tạo ra một môi trường đủ nhớt bên trong và ngoài tế bào giúp ngăn cản sự biến đổi của tế bào ở mức thấp nhất [25]

Theo một nghiên cứu khác thì protein trong sữa gầy có thể tạo thành lớp áo bảo

vệ trên thành tế bào, đồng thời sữa gầy còn cung cấp những chất đệm tan trong nước (muối phosphat, muối citrat) giúp ổn định pH trong quá trình đông khô [42] Nguyên liệu đông khô với sữa gầy vừa tạo cấu trúc xốp giúp quá trình bù nước

dễ dàng, nhưng đồng thời cũng làm cho nguyên liệu đông khô hút ẩm khá nhanh nếu không được bảo quản tốt

1.2.5.2 Alginat

 Nguồn gốc, cấu trúc của alginat

Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic với các ion kim loại như

Ca2+, Ba2+, Mg2+, Na+ Alginat có nguồn gốc chủ yếu từ tảo nâu, rong mơ

Sargassum polycystum, S kjellmanianum,

Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M) [22], [35]

Acid α – L – Guluronic Acid β – D – Mannuronic

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của acid α - L - guluronic và β – D - mannuronic

Hai monome này gắn với nhau bằng liên kết 1 – 4 glycosid nhưng các liên kết này không phải ngẫu nhiên mà thành block: block homopolyguluronic (GGGG), block homopolymannuronic (MMMM), block liên hợp (MGMG)

Tùy theo nguồn gốc của alginat mà độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau Điều này làm cho tính chất của alginat biến đổi trong một dải rộng [22], [35]

 Một số tính chất của alginat

các amin phân tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước tạo dung dịch keo nhớt Các muối của acid alginic với các kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+ ) không tan trong nước (trừ muối Mg2+) Các muối alginat hòa tan được trong các dung môi

thân nước như alcol, aceton và hòa tan dễ dàng hơn khi đun nóng [35]

Độ nhớt: Natri alginat khi tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt dao

động trong khoảng từ 10 – 3500 cps Độ nhớt của dung dịch alginat ảnh hưởng bởi khối lượng phân tử trung bình, nồng độ alginat sử dụng, nhiệt độ pH và sự có mặt

của các ion kim loại có trong dung dịch

Sự gel hóa: Dung dịch natri alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion

kim loại hóa trị II, III Các gel này được hình thành ở các mức nhiệt độ nhỏ hơn

100oC, không tan chảy khi đun nóng Sự tạo gel được giải thích bằng mô hình cấu trúc phân tử của alginat - mô hình vỉ trứng: đoạn mạch của polymannuronic (MMMM) là các dải hẹp, đoạn mạch của acid polyguluronic (GGGG) có dạng gấp nếp như vỉ trứng Khi có mặt các ion hóa trị II, III ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra, các phân tử alginat sắp xếp lại song song với nhau, các phần gấp nếp của đoạn GGGG tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt quả trứng Các ion

Ca2+ khớp vào khoảng trống này liên kết với các nhóm chức carboxyl và các nguyên tử oxy ở mỗi đoạn song song để hình thành gel alginat [20], [35] Với tính chất này, alginat được sử dụng rất rộng rãi trong công nghệ cố định tế bào và vi nang hóa

1.2.5.3 Tinh bột

 Cấu tạo, nguồn gốc

Trong tự nhiên, tinh bột là hợp chất hữu cơ rất phổ biến và dồi dào, chỉ đứng sau cellulose Người ta thấy tinh bột có trong cây xanh, rễ, cành, hạt, củ và quả Walton

đã sưu tầm trên 300 nghiên cứu về tinh bột, tất cả đều cho thấy tinh bột của mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ Amylose (Am) và Amylopectin (Ap) [12] [36]

Cả hai cấu tử này đều được cấu tạo từ α-D glucose Các gốc glucose trong Am kết hợp với nhau qua liên kết α-1,4-glucosid tạo nên chuỗi dài khoảng 500-2.000 đơn vị glucose, phân tử lượng trung bình 10.000-300.000 Ap có cấu trúc phân nhánh, ngoài liên kết α-1,4-glucosid còn có các liên kết α-1,6-glucosid ở điểm phân nhánh [13] Cấu trúc phân tử gồm một nhánh trung tâm, từ các nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose, phân tử lượng Ap khoảng 5×105 - 1×106 Trong những nguyên liệu khác nhau thì hàm lượng Am và Ap cũng không giống nhau, nhưng thường tỉ lệ Am và Ap của các tinh bột bằng 1/4

Nước ta có nguồn nguyên liệu tinh bột rất đa dạng và phong phú Trong đó, sắn

là loại cây lương thực có sản lượng cao và tinh bột sắn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp dược phẩm, thực phẩm… Vì vậy, ta sử dụng tinh bột sắn làm nguyên liệu trong nghiên cứu này

 Tính chất

Trong môi trường acid, tinh bột bị thủy phân thành sản phẩm hòa tan Ở môi trường acid mạnh, sản phẩm thủy phân cuối cùng là glucose Trong môi trường kiềm, tinh bột bị ion hóa từng phần do sự hydrat hóa tốt hơn

Khi hòa tan tinh bột vào nước, do sự hấp thụ nước làm hạt tinh bột trương phồng lên, tăng thể tích Hiện tượng này gọi là hiện tượng trương nở của tinh bột Trên 55

- 70ºC, các hạt tinh bột trương lên do hấp thụ nước vào các nhóm hydroxyl phân cực, độ nhớt của dung dịch tăng mạnh Kéo dài thời gian xử lý nhiệt có thể gây nổ

vỡ hạt tinh bột, thủy phân từng phần và hòa tan phần nào các phần tử cấu thành của tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch Nhiệt độ để phá vỡ hạt, chuyển tinh bột từ trạng thái đầu có mức độ oxy hóa khác nhau thành dung dịch keo gọi là nhiệt hồ hóa [13] [36]

 Ưu điểm

Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, tương thích sinh học, phân hủy sinh học Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch [18] Tinh bột là tá dược độn phổ biến, giá rẻ và có thể tiêu hóa được [28] Tinh bột thường được sử dụng để ổn định thực phẩm trong sản xuất sữa chua vì vậy tính tương hợp sinh học và độc tính của nó với vi khuẩn đã được thử nghiệm rộng rãi [42]

 Ứng dụng

Tinh bột là một trong số tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô Cơ chế bảo vệ của tinh bột là làm giảm lượng nước liên kết trong mẫu [46] Trong quá trình vi nang hóa tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đông tụ hóa muối sử dụng alginat, tinh bột được phối hợp như tá dược độn rắn, góp phần cải thiện tính chất vật lý của hạt

vi nang sau đông khô và giúp tế bào ổn định hơn trong quá trình đông khô và bảo

quản [28] L acidophilus không có khả năng tiêu thụ tinh bột, vì vậy tinh bột có thể được lựa chọn trong vi nang hóa L acidophilus

Tinh bột là nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp keo dán vì những tính chất đặc trưng của nó như tạo hình, tạo dáng, tạo khung, tạo độ dẻo, độ dai, độ đàn hồi, độ xốp và có khả năng tạo gel, tạo màng cho nhiều sản phẩm

1.3 Phương pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu Probiotic

Có rất nhiều phương pháp tạo chế phẩm probiotic như tạo dạng bột đông khô, tạo cốm Các phương pháp này đã và đang được sử dụng phổ biến do đã được nghiên cứu lâu đời nên giá thành rẻ và dễ triển khai trên quy mô công nghiệp, tuy nhiên khả năng sống sót của vi khuẩn lại không cao Để cải thiện số lượng vi khuẩn

sống sót trong quá trình bảo quản và trong những điều kiện bất lợi về môi trường như pH thấp ở dạ dày, các enzym tiêu hóa , trên thị trường đã có các sản phẩm probiotic được bào chế dạng pellet, vi nang và được bao bảo vệ tới thế hệ 4 [4]

Bao 2 lớp ( Dual – Coated)

Hiện nay, hầu hết các nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm probiotic trên thị trường là dạng bột đông khô do khả năng duy trì số lượng VSV sống ngay cả trong quá trình bảo quản thời gian dài Ngoài ra, bột đông khô còn là dạng nguyên liệu tốt nhất để sản xuất chế phẩm probiotic dạng rắn như bột, cốm hoặc viên nén, viên nang

Nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng VSV sống sót trong các chế phẩm probiotic rất nghèo nàn Hơn thế, khả năng tồn tại của các vi khuẩn trong hệ thống tiêu hóa là một vấn đề lớn cần giải quyết Cung cấp cho các tế bào sống một rào cản vật lý để chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường là một trong những hướng tiếp cận được quan tâm hiện nay, trong đó phải kể đến công nghệ vi nang hóa [49]

1.3.1 Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic

a Khái niệm

Vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay Phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc có nguồn gốc nhân tạo

như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG)… để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào,

cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ [8]

b Đặc điểm

Vi nang có cấu tạo giống như một màng bán thấm hình cầu, mảnh và có lớp thành bảo vệ vững chắc Vi khuẩn được bao giải phóng theo các cơ chế: gãy vỡ màng, hòa tan màng và khuếch tán qua màng [39] Mỗi loại vật liệu bao vi nang và mỗi loại tế bào sống lại hoạt động ở các điều kiện khác nhau nên phải lựa chọn điều kiện để tạo thành vi nang như: pH, nhiệt độ, thời gian…

Vi nang hóa không làm tổn hại đến các tế bào sống mà còn bảo vệ tế bào Vi nang hóa cho phép cố định lượng lớn tế bào sống [58] Độ bền cơ học của lớp màng bao vi nang là một đặc điểm quan trọng Màng phải có độ bền tương đối để có thể bảo vệ được các tế bào sống, tuy nhiên nó lại không được quá vững chắc vì như thế

sẽ ảnh hưởng đến khả năng phóng thích tế bào khi cần thiết Kích thước hạt vi nang cũng là đặc điểm cần lưu ý Giữa kích thước hạt, độ bền vững của hạt và khả năng phóng thích tế bào có mối quan hệ với nhau Kích thước hạt càng lớn thì độ bền vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ tế bào sống càng cao, nhưng khả năng phóng thích tế bào càng khó Ngược lại, kích thước hạt càng nhỏ thì độ bền càng thấp, khả năng bảo vệ tế bào sẽ thấp đi nhưng khả năng phóng thích tế bào sẽ dễ dàng hơn Ngoài ra còn có một số đặc điểm khác cần chú ý như: sự mài mòn của các hạt vi nang do sự va chạm và ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn của hạt… [8], [39]

1.3.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa

a Ưu điểm

Vi nang hóa có khả năng tạo ra mật độ vi sinh vật lớn do có thể cố định lượng lớn tế bào sống Hạt vi nang như tấm áo choàng giúp tế bào cách ly với môi trường xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn thất số lượng tế bào, bằng cách này các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường khắc nghiệt như

pH thấp, muối mật, sốc nhiệt Ngoài ra, vi nang hóa cũng giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt các

chất ức chế trong môi trường lên men Do đó, vi nang hóa làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại và tăng thời gian bảo quản chủng, giống [17] [58]

Màng bao vi nang giống như một rào chắn hạn chế giải phóng tế bào, giảm thiểu sự nhiễm bẩn, bảo vệ tế bào chống lại tác nhân gây hại, từ đó đảm bảo cho quá trình lên men không bị tạp nhiễm, hư hại Lớp màng bao có thể được thiết kế để bảo

vệ và giải phóng vi khuẩn ở những điều kiện môi trường khác nhau cho phép kiểm soát giải phóng vi khuẩn [17] [58]

Vi nang hóa có thể tạo ra các gradien nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm, nồng

độ oxy hòa tan, pH môi trường lên men… từ đó có thể tạo ra các môi trường khác nhau cho tế bào trong các lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau Vi nang hóa cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, cho phép sử dụng tế bào ở một pha riêng biệt đối với môi trường lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh [8] [58]

Trong các ngành sản xuất, đặc biệt là ngành sản xuất các sản phẩm liên quan đến probiotic, thì việc vi nang hóa tế bào có ý nghĩa rất quan trọng, giúp tăng độ ổn định, thời gian bảo quản, kiểm soát giải phóng và cải thiện về mặt cảm quan cho sản phẩm Trong các ngành thực phẩm sản xuất các sản phẩm lên men như bia, rượu… thì kỹ thuật vi nang hóa là một trong những lựa chọn để cố định tế bào vi sinh vật sử dụng trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng vi sinh vật tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn [17] [39]

b Nhược điểm

Mặc dù có nhiều ưu điểm đáng chú ý, song vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng

có một số nhược điểm Trong quá trình trao đổi chất, tế bào vi sinh vật sản sinh ra nhiều enzym trong đó có những enzym có thể cho xúc tác các phản ứng không mong muốn làm tổn hại đến lớp vật liệu vi nang và cả chính tế bào Để giải quyết vấn đề này phải chọn lựa giống vi sinh vật thích hợp không tạo ra các enzym không mong muốn mà vẫn đảm bảo hoạt tính của các enzym mong muốn [8] [58]

Đa số các vật liệu vi nang như gelatin, thạch… đều là các nguồn dinh dưỡng

mà vi sinh vật có thể tiêu hóa được Điều này khá quan trọng vì như thế vi sinh vật được vi gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm

cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm xuống đáng

kể Có bằng chứng cho thấy một số chủng vi khuẩn có khả năng tiêu hóa, sử dụng chính vật liệu vi nang Vì vậy, mỗi chủng vi sinh vật ta phải nghiên cứu vật liệu vi nang phù hợp nhất cho đối tượng vi sinh vật đó

1.3.3 Phương pháp tách pha đông tụ

a Nguyên tắc

Tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự hóa muối hoặc khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ tạo vi nang Từ dung dịch keo trong một dung môi thích hợp, tiến hành các tác động nhằm thay đổi độ tan của nó, kết quả là một lượng đáng

kể keo được tách ra thành pha mới Như vậy hệ trở thành hai pha, một pha có nồng

độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ (coacervat) Sau đó, các hạt coacervat dần kết dính lại với nhau hoặc hấp thụ trên bề mặt chất cần bao gói tạo thành lớp màng bao [3] [16]

b Phân loại

Nếu chỉ sử dụng một loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông

tụ đơn giản, nếu sử dụng nhiều loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ phức hợp [3] [16]

Tách pha đông tụ đơn giản là quá trình loại nước của các chất keo thân nước dùng trong hệ, do đó làm giảm độ tan của chất keo Phương pháp này thường chỉ sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose) Quá trình làm giảm độ tan của chất keo có thể bằng các cách sau: thêm vào một dung môi có thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, isopropanol…), thêm vào một muối vô cơ hay thay đổi nhiệt độ [55]

Tách pha đông tụ phức hợp là quá trình tương tác giữa phân tử tích điện âm và tích điện dương của hai hoặc nhiều hợp chất cao phân tử, có thể do sự thay đổi nồng

độ các chất tan cao phân tử hoặc thay đổi pH Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện càng dễ tạo thành hạt đông tụ [3] [16] [55] Tách pha còn có thể được thực hiện do thêm vào một polyme khác không tương đồng, do thêm vào một

dung môi thứ hai, do sự hóa muối (đông tụ thông thường), hoặc do tương tác giữa các polyme… [3]

Tách pha do sự hóa muối (đông tụ thông thường)

Tách pha do sự hóa muối được thực hiện theo nguyên tắc sau: khi thêm dung dịch đậm đặc hoặc muối điện ly mạnh (muối vô cơ) vào hệ chế tạo vi nang sẽ tạo thành hai pha, kết quả là một pha trong đó sẽ trở nên bão hòa các tiểu phân keo

Kỹ thuật đông tụ hóa muối hay còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định gel, ion hóa tạo gel (ionic gelation method, ionotropic gelation techniques) để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel) Phương pháp này thường hay sử dụng các polyme

có nguồn gốc tự nhiên, có tính tương thích sinh học cao như alginat, chitosan, gôm gellan… Trong phương pháp này, các polyanion như alginat kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới không gian ba chiều bao gói lấy dược chất hoặc có thể kết hợp tạo phức với các polyanion khác trên bề mặt của hạt gel alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao hơn và ngăn thấm tốt hơn Hydrogel được bào chế bằng hai kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật nhỏ giọt và kỹ thuật phun đông tụ [47]

1.3.4 Tá dược vi nang hóa

Tá dược phổ biến nhất dùng để vi nang hóa vi sinh vật là alginat

Ưu điểm: Alginat không độc, tạo gel dễ dàng với Calci clorid, gel có độ ổn định

cao Vi khuẩn sống không bị ảnh hưởng trong suốt quá trình bất động nhờ tính thuận nghịch của gel: hòa tan lại trong môi trường có chứa ion Calci hoặc pH hơi kiềm sẽ giúp giải phóng các tế bào bên trong Alginat có độ ổn định cao, độ xốp cao

và có khả năng chống chịu các muối và chất tạo phức

Nhược điểm: Khi có mặt acid lactic, các yếu tố tạo phức như lactat có thể làm

giảm độ bền của gel Calci alginat và làm cho tế bào thoát ra ngoài

Các chất tạo gel khác gồm: chitosan, CMC, gelatin, pectin, gôm carrageenan-locust đậu, gellan và agar

kappa-1.3.5 Một số nghiên cứu sử dụng alginat làm tá dược vi nang hóa

Các công trình tiên phong trong lĩnh vực cố định tế bào được thực hiện bởi Chibata (1979) sử dụng tế bào VSV cố định cho sản xuất liên tục acid L- aspartic [51] Năm 1978, Sten Ohlsan, Per Olof Larsson và Klaus Mosbach cố định tế bào vi

sinh Arthrobacter simplex bằng gel calci alginat Từ đó đến nay, đã có rất nhiều

công trình nghiên cứu sử dụng alginat làm tá dược vi nang hóa tế bào vi khuẩn

 Trên thế giới

Năm 1989, những nghiên cứu của A V Rao và cộng sự đã chứng minh vi nang

hóa làm tăng khả năng sống sót của Bifidobacterium pseudolongum trong môi

trường dạ dày, ruột [21]

Từ 1990 - 1998, đã có thêm nhiều nghiên cứu về các lợi ích của quá trình vi nang hóa tế bào bằng alginat như: bảo vệ các tế bào bên trong các hạt vi nang khỏi các chủng phages [41]; bảo vệ tế bào vi khuẩn trong quá trình đông khô và bảo quản lạnh [37], [40], [56]; tăng độ ổn định trong quá trình bảo quản [34], [38]

Những năm gần đây, vi nang hóa trở thành một lĩnh vực đang được quan tâm nghiên cứu rất nhiều Các nghiên cứu chủ yếu nhằm tìm ra những lợi ích của vi nang hóa tế bào [22], [53]; cải thiện các kĩ thuật vi nang hóa [24], [26], [29], [57] hay cải thiện đặc tính của vi nang [28], [50]

Năm 2004, V Chandramouli và cộng sự tiến hành nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình vi nang hóa nhằm tăng hiệu quả của vi nang trong việc bảo vệ các vi khuẩn trong điều kiện mô phỏng dạ dày [29]

Năm 2008, theo báo cáo của Se-Jin Kima và cộng sự, vi nang hóa làm tăng tỉ lệ

sống sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình xử lí nhiệt, tăng khả năng tồn

tại trong môi trường pH dạ dày; không ảnh hưởng đến khả năng bám dính vào ruột

và các dòng tế bào biểu mô của con người, không làm giảm tác dụng giảm cholesterol của chủng này [53]

Năm 2012, T P Ivanovska và cộng sự đã tiến hành vi nang hóa vi khuẩn

Lactobacillus casei trong vi hạt chitosan-Ca-alginat bằng phương pháp sấy phun,

kết quả tạo ra các vi hạt có kích thước nhỏ và ổn định hơn trong môi trường dạ ruột so với khi chỉ sử dụng alginat để vi nang hóa [57]

Năm 2014, Sha Cai đã tiến hành nghiên cứu cải tiến phương pháp vi nang hóa

nang đồng đều hơn về kích thước và số lượng vi khuẩn trong vi nang tương tự như khi sử dụng CaCO3 [26]

 Việt Nam

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, sử dụng alginat làm tá dược vi nang hóa cũng đang được quan tâm và nghiên cứu Nhiều nghiên cứu chứng minh vi nang hóa bằng alginat có tác dụng bảo vệ vi khuẩn probiotic trong môi trường dạ dày – ruột tốt hơn so với dạng tự do [1], [10] Theo nghiên cứu của tác giả Quách Thu Trang (2010), Hà Thị Thanh Huyền (2014) sử dụng alginat 2% hóa rắn trong dung dịch CaCl2 2% cho vi nang dạng cầu ổn định và sử dụng tá dược độn là sữa gầy 10% có tác dụng nâng cao tỉ lệ sống sót của vi sinh vật trong quá trình đông khô và trong quá trình bảo quản [7], [11]

Một số chế phẩm probiotic dạng vi nang trên thị trường

- Lactomin plus

Thành phần: Mỗi gói 3g chứa:

Hỗn hợp vi khuẩn lactic dạng vi nang gồm: Lactobacillus acidophilus,

Tá dược: bột Vegetable cream, fructo-oligosaccharid, bột hương yaourt

Nhà sản xuất: Novarex / Me-Auspharm JV

- Pro-X10

Thành phần: Vi nang probiotic chứa: 8.109CFU (Bifidobacterium breve,

Bifidobacterium lactis, L acidophilus, L plantarum, L rhamnosus);

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 (Viện kiểm

nghiệm thuốc trung ương)

 Nguyên liệu :

Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

 MRS lỏng (MT1)

 Môi trường MRS đặc (MT2)

MT2 = MT1 + thạch agar (22g/1000ml môi trường)

2.1.3 Thiết bị

Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Bình nón, đĩa petri, ống nghiệm, đầu

côn, pipet, cốc có mỏ, ống ly tâm…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Lựa chọn nồng độ alginat và tinh bột để tạo nguyên liệu

a, Tạo nguyên liệu gồm sữa gầy và các chất bảo vệ: sử dụng phối hợp tinh bột và

alginat làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu Lactobacilus acidophilus

đông khô

 Alginat từ 1 – 3% lựa chọn nồng độ thích hợp (Dạng bột và vi nang)

 Alginat + Tinh bột từ 2 – 20% (Dạng bột và vi nang)

b, Lựa chọn công thức tối ưu nhất, tạo nguyên liệu dạng vi nang, đánh giá chất lượng nguyên liệu sau đông khô:

- Cảm quan: thể chất, hình dạng, màu sắc, kích thước…

- Độ ẩm sau đông khô

- Độ rã

- Số lượng VSV (Tỷ lệ sống sót sau đông khô)

- Khả năng bảo vệ vi sinh vật trong môi trường acid và giải phóng vi sinh vật trong môi trường ruột

So sánh với nguyên liệu Ấn độ dạng bột

2.2.2 Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản

và trong môi trường giả dịch dạ dày và dịch ruột.

Các tiêu chí theo thời gian bảo quản (4°C, bảo quản bằng 2 lớp bao nilon)

 Số lượng VSV

 Hàm ẩm

 Độ rã

 Khả năng bảo vệ vi sinh vật trong môi trường giả dịch dạ dày và giải phóng

vi sinh vật trong môi trường giả dịch ruột

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nhân giống

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan hết các thành phần Phân chia môi trường vào các ống nghiệm sạch bằng phễu thủy tinh, mỗi ống nghiệm 10ml MRS lỏng Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước) Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 114oC/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Sau khi tiệt khuẩn để nguội xuống khoảng 37 ÷ 40oC Cấy giống vào ống nghiệm trên Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống VSV trong

tủ ấm 5% CO2 trong 24h ở 37±1oC

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (theo công thức đã nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan các thành phần trong công thức trong cốc có

mỏ Chuyển môi trường MRS lỏng vào bình nón có dung tích thích hợp Đậy kín miệng bình bằng nút bông Hấp tiệt khuẩn ở 114oC/20 phút trong nồi hấp tự động Lấy ra, để nguội xuống khoảng 37÷ 40oC Cấy giống vào các bình nón trên trong tủ cấy vô trùng (tỉ lệ cấy giống: 10% thể tích môi trường) Ủ trong tủ ấm 5% CO2

trong 24h ở nhiệt độ 37±1oC

2.3.3 Phương pháp vi nang hóa bằng alginat sử dụng kỹ thuật tách pha đông tụ

Chuẩn bị hỗn dịch gel chứa vi khuẩn: Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trường MRS lỏng ở 37±1°C trong 24 giờ trong tủ ấm 5% CO2 (phương pháp nêu trong mục 2.3.2) Dịch nuôi cấy được cho vào ống li tâm đã được hấp tiệt trùng, đem li tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút Bỏ dịch, thu sinh khối

Sinh khối thu được đem phân tán đều trong 100ml dung dịch sữa gầy 20% bằng máy lắc (Vortex) và khuấy từ Hỗn dịch sinh khối trong sữa gầy đem phối hợp với 100ml dung dịch alginat nồng độ từ 2-6% bằng khuấy từ trong 15 phút (dung dịch Natri alginat đã được hấp tiệt trùng ở 114°C trong 20 phút, để nguội)

Tạo hạt vi nang phối hợp

 Tạo hỗn dịch vi nang

Hạt phối hợp tinh bột 10%: Phân tán đều sinh khối thu được trong 100 ml

nước cất bằng máy lắc Hỗn dịch sinh khối trong nước cất đem phối hợp với 100 ml dung dịch alginat 4% và 20 g tinh bột bằng khuấy từ trong 15 phút thu được 200 ml hỗn dịch sinh khối trong dung dịch alginat 2% và tinh bột 10%

Hạt phối hợp tinh bột 5% + sữa gầy 5%: Phân tán đều sinh khối thu được

trong 100 ml sữa gầy 10% bằng máy lắc Hỗn dịch sinh khối trong nước cất đem phối hợp với 100 ml dung dịch alginat 4% và 10 g tinh bột bằng khuấy từ trong 15 phút thu được 200 ml hỗn dịch sinh khối trong dung dịch alginat 2%, tinh bột 5% và sữa gầy 5%

Hạt phối hợp sữa gầy 10%: Phân tán đều sinh khối thu được trong 100 ml sữa

gầy 20% bằng máy lắc Hỗn dịch sinh khối trong nước cất đem phối hợp với 100 ml dung dịch alginat 4% bằng khuấy từ trong 15 phút thu được 200 ml hỗn dịch sinh khối trong dung dịch alginat 2% và sữa gầy 10%

 Tạo hạt vi nang

Chuẩn bị dung dịch hóa rắn: Pha dung dịch Calci clorid 2% (kl/tt), hấp tiệt trùng ở 114°C trong 20 phút, để nguội

Tiến hành tạo vi nang: Hỗn dịch gel chứa vi sinh vật được nhỏ qua một kim tiêm, xuống dung dịch Calci clorid 2% (kl/tt) tạo thành các hạt hình cầu Để yên 30 phút cho hạt ổn định, sau đó vớt lấy hạt, rửa hạt ba lần bằng dung dịch NaCl 0,9%

- Các mẫu tạo nguyên liệu dạng bột:

Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trường MRS lỏng ở 37°C trong

24 giờ trong tủ ấm 5% CO2 (phương pháp nêu trong mục 2.3.2) Dịch nuôi cấy được cho vào ống li tâm đã được hấp tiệt trùng, đem li tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút Các ống li tâm được lấy khỏi máy, loại phần dịch Phần sinh khối còn lại được thêm dung dịch tá dược độn đã tiệt khuẩn và để nguội Phân tán đều sinh khối trong dung dịch tá dược độn bằng máy lắc Đổ hỗn dịch thu được vào các đĩa petri (đã làm sạch và hấp tiệt khuẩn), đậy kín, sau đó đem đi tiền đông ở -80°C cho đông rắn hoàn toàn rồi tiến hành làm khô trong máy đông khô

 Tiến hành:

Các mẫu được làm đông lạnh trong tủ lạnh sâu -80°C trong 24 giờ, sau đó được làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô ở điều kiện khoảng -54°C, 0,055mbar trong 24 giờ

Kết thúc quá trình làm khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, cân khối lượng hạt khô

và tiến hành đếm số lượng tế bào được gói trong 1g hạt Mẫu được bảo quản trong túi polyme đựng trong lọ nhựa PE, đậy kín, để trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4°C

2.3.5 Phương pháp xác định hàm ẩm

Tiến hành đo trên thiết bị đo hàm ẩm Ohaus

Làm nhỏ mẫu cần đo hàm ẩm Cho lên mặt đĩa của thiết bị khoảng 1g mẫu, dàn đều mẫu ra mặt đĩa, đậy nắp, chạy máy Chờ máy gia nhiệt trong khoảng 5 phút hoặc đến khi máy hiện kết quả Đọc, ghi lại số liệu hàm ẩm của mẫu hiển thị trên màn hình

2.3.6 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng liên tục

 Chuẩn bị

Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trường MRS đặc (nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp Đậy kín bằng nút bông Hấp tiệt khuẩn ở

114oC/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Lấy bình đựng môi trường ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trường lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín

Chuẩn bị các ống nghiệm sạch mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lí, đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 114oC /20 phút, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 37 ÷ 40oC

 Xác định số lượng VSV trong 1ml dịch nuôi cấy

Hút chính xác 1ml hỗn dịch sinh khối pha vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều Hút chính xác 1ml dịch đã được đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ 2 (chứa 9ml nước muối sinh lí), lắc đều Cứ tiếp tục pha loãng như vậy cho tới nồng độ pha loãng cuối cùng (trong thí nghiệm này là 10-7, 10-8, 10-9) Cấy trải lên mỗi đĩa petri 0,5ml dịch trong các ống pha loãng ở trên (làm trên 3 nồng độ cuối, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa)

 Đối với mẫu nguyên liệu dạng bột

Làm nhỏ nguyên liệu, cân chính xác khoảng 1g mẫu, sau đó pha vào bình nón chứa 100ml nước cất đã được hấp tiệt khuẩn ở 114oC/20 phút Phân tán đều mẫu trong nước bằng khuấy từ, sau đó hút chính xác 1ml dịch từ bình nón pha vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí, rồi tiếp tục pha loãng, cấy như đối với mẫu là chất lỏng ở trên

 Đối với mẫu nguyên liệu dạng hạt từ alginat

Tiến hành phá hạt: Cân chính xác 1g hạt nguyên liệu, cho vào bình nón chứa 100ml dung dịch natri citrat 2% đã được hấp tiệt trùng ở 114oC; 0,6 atm trong 20 phút Hòa tan bằng máy khuấy từ liên tục cho đến khi các hạt tan hoàn toàn thành dung dịch đồng nhất Hút chính xác 1,0ml dung dịch từ bình nón pha loãng vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí, rồi tiếp tục pha loãng và cấy như các mẫu trên Các đĩa petri được ủ trong tủ ấm 5% CO2, nhiệt độ 37oC trong 48h Xác định số lượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch

Tiến hành xác định số lượng VSV trên các mẫu:

- 1ml dịch nuôi cấy sau 24h

- Mẫu nguyên liệu dạng bột sau đông khô

- Mẫu nguyên liệu dạng hạt sau đông khô và trong thời gian bảo quản

Số lượng VSV có trong 1g nguyên liệu hoặc 1ml dịch nuôi cấy ban đầu được tính theo công thức:

Trong đó:

m: Khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng VSV

X: Số VSV có trong 1g hoặc 1ml mẫu

An: Số khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri có cấy các nồng độ pha loãng n

2.3.7 Phương pháp xác định số lượng VSV sống sót trong điều kiện môi trường

pH dạ dày và pH ruột

Cân chính xác khoảng 1,0g mẫu cần thử, cho vào bình nón chứa 100,0ml dịch dạ dày giả (dung dịch HCl) có pH khác nhau (từ pH 1,0 đến pH 3,0) hoặc dịch ruột giả (đệm borat hoặc phosphat hoặc NaOH) pH 6,8 đã được hấp tiệt khuẩn ở 114°C/20 phút Khuấy từ với tốc độ 50 vòng/phút Ủ hỗn dịch trên trong tủ ấm ở 37°C Lấy mẫu tại các thời điểm 0h, 1h, 2h, tiến hành pha loãng liên tục như các bước đã nêu ở trên đến nồng độ pha loãng 10-7, cấy trải dịch trong 3 nồng độ pha loãng cuối cùng lên mặt thạch MRS, mỗi đĩa 0,5ml, dàn đều dịch trên bề mặt thạch bằng que trang đã được tiệt khuẩn

Ủ các đĩa này trong tủ CO2 5%, ở nhiệt độ 37°C Sau 24h, xác định số lượng VSV trên các đĩa Song song làm 1 mẫu chứng trong cùng điều kiện với mẫu thử Mẫu chứng là mẫu không cho VSV tiếp xúc với dịch dạ dày và dịch ruột mô phỏng

2.3.8 Phương pháp tiệt khuẩn

2.3.8.1 Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được đựng trong bình nón, đậy kín bằng nút bông, sau đó tiệt trùng trong nồi hấp ở 114oC, 0,6 atm trong 20 phút

2.3.8.2 Tiệt khuẩn bằng Tyndall

Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được đựng trong bình nón, đậy kín bằng nút bông, để ở 70oC – 80oC trong 1 giờ, ủ bình trong tủ 37oC trong 24h Lặp lại thao tác trên trong 3 ngày liên tục

2.3.9 Phương pháp xác định độ trương nở của hạt vi nang

Hạt vi nang được ngâm trương nở trong dung dịch cần khảo sát Sau các khoảng thời gian nhất định, vớt hạt, nhẹ nhàng thấm giữa 2 tờ giấy lọc Tiến hành

đo đường kính 15 hạt ngẫu nhiên trong mẫu

Thể tích hạt vi nang được tính theo công thức:

: Độ trương nở của hạt vi nang (mm3)

Δ : Độ tăng thể tích trung bình của hạt vi nang được tính theo công thức:

Với:

: Độ trương nở trung bình của các hạt vi nang ở lần thí nghiệm thứ i, được tính theo công thức:

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Tạo nguyên liệu chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus với các chất bảo

vệ

Tiến hành tạo nguyên liệu đông khô chứa L acidophilus với chất bảo vệ alginat

với sữa gầy, tinh bột và đánh giá các chỉ tiêu về cảm quan, thể chất và số lượng vi sinh vật của các mẫu nguyên liệu đông khô tạo thành, từ đó lựa chọn được mẫu nguyên liệu có thể chất ổn định và có khả năng bảo vệ tốt vi khuẩn trong quá trình đông khô Trên cơ sở đó, tiếp tục khảo sát lượng sinh khối đầu vào của nguyên liệu

để thu được nguyên liệu có số lượng vi sinh vật đạt từ 109 - 1010cfu/g

3.1.1 Đánh giá cảm quan, thể chất của các nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus acidophilus tạo thành khi kết hợp alginat và sữa gầy

 Mục tiêu

Khảo sát thể chất của một số nguyên liệu đông khô khi sử dụng tá dược bảo vệ alginat với các dạng nguyên liệu khác nhau (dạng bột và dạng hạt)

 Tiến hành

Tiến hành lên men chủng Lactobacillus acidophilus trong bình nón chứa 100ml

môi trường MRS lỏng (theo phương pháp nêu ở mục 2.3.2) Tạo các dạng nguyên liệu (dạng bột và hạt) với các tá dược bảo vệ là alginat và sữa gầy (theo phương pháp nêu ở mục 2.3.3 và 2.3.4), như sau:

Bảng 3.1 Các mẫu nguyên liệu khảo sát thể chất

Các dung dịch tá dược thêm vào được hấp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm ở 114oC trong 20 phút

 Kết quả

Thể chất của các mẫu nguyên liệu đông khô tạo thành:

Bảng 3.2 Thể chất của một số mẫu nguyên liệu đông khô

chứa Lactobacillus acidophillus

Tá dược

bảo vệ

Dạng nguyên liệu

Cảm quan, thể chất

Thể chất đồng nhất, trắng Mẫu nguyên liệu tạo thành một lớp mỏng dính vào đĩa, hút ẩm nhanh, rất khó lấy ra khỏi đĩa

Sữa gầy

Thể chất đồng nhất, màu trắng vàng, khô, xốp, dễ làm tơi, dễ lấy ra khỏi đĩa Sau 30 phút bị hút ẩm, không xốp, dính vào đĩa

Alginat

Thể chất đồng nhất, màu hơi vàng, nhẹ, xốp, kết thành mảng, khó làm nhỏ, dễ lấy ra khỏi đĩa trước khi mẫu bị hút ẩm Sau 30 phút, mẫu hút ẩm mạnh, dính bết, không lấy ra khỏi đĩa được

Alginat

Thể chất đồng nhất, nhẹ, xốp, hạt méo mó, bề mặt xù xì Hút ẩm nhanh ngay khi lấy ra khỏi máy đông khô, các hạt dính vào nhau, khó lấy ra khỏi đĩa

ra khỏi đĩa Sau 30 phút, các hạt dính vào nhau

 Nhận xét

Việc sử dụng alginat và alginat phối hợp với sữa gầy giúp cho thể chất các mẫu nguyên liệu được cải thiện, tuy nhiên với các nồng độ phối trộn khác nhau thì mức

độ thể chất nguyên liệu tạo thành cũng khác nhau:

 Khi không sử dụng tá dược độn, mẫu nguyên liệu đông khô L acidophilus

dạng bột tạo thành một lớp mỏng bám vào đĩa petri, rất khó để lấy được toàn

bộ nguyên liệu Đồng thời, các mẫu này cũng rất dễ hút ẩm khi để ngoài môi trường

 Khi sử dụng tá dược bảo vệ là alginat 2% và alginat ở các nồng độ khác nhau phối hợp với sữa gầy cho các nguyên liệu dạng hạt, các hạt thu được đều có thể chất xốp, đồng nhất và dễ lấy ra khỏi đĩa hơn so với nguyên liệu dạng bột Trước đông khô, các hạt đều có hình dạng là hình cầu Nhưng sau khi đông khô các hạt bị mất dạng hình cầu ban đầu, bề mặt nhăn nhúm, xù xì

Vì vậy, tiến hành tạo nguyên liệu dạng hạt với nồng độ alginat 2% và sữa gầy 10% là thích hợp nhất do quá trình tạo hạt dễ dàng và nguyên liệu thu được có cảm quan, thể chất tốt hơn so với các dạng nguyên liệu khác

3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi nang sau đông khô

Các dung dịch và tá dược thêm vào đều được tiệt khuẩn bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 114ºC trong 20 phút

Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4) Kết thúc quá trình, lấy mẫu ra khỏi đĩa petri, bảo quản trong túi nilon ở 4ºC Tiến hành

đo đường kính, hàm ẩm (phương pháp nêu trong mục 2.3.5) và so sánh thể chất của các mẫu ngay sau đông khô Mỗi thí nghiệm, tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình

 Kết quả

Đường kính hạt vi nang, hàm ẩm và thể chất của các mẫu sau đông khô được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3: Đường kính hạt vi nang, hàm ẩm và thể chất của các mẫu nguyên liệu

chứa Lactobacillus acidophilus dạng vi nang với các nồng độ tinh bột ngay sau

Hàm ẩm sau đông khô (%)