Nghiên cứu xác định hàm lượng chất cấm dexamethason acetat trong mỹ thẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH HÀN CHÍ TÚ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT CẤM DEXAMETHASON ACETAT TRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

HÀN CHÍ TÚ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT CẤM DEXAMETHASON ACETAT TRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

HÀN CHÍ TÚ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT CẤM DEXAMETHASON ACETAT TRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS NGUYỄN KHẮC NGHĨA

NGHỆ AN - 2014

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành tại phòng thí nghiệm chuyên đề bộ môn Hóa phân tích - Khoa Hóa - Trường Đại học Vinh và Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm - Mỹ phẩm Nghệ An

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- PGS.TS Nguyễn Khắc Nghĩa đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho việc nghiên cứu và hoàn thành luận văn

- TS Nguyễn Trung Dũng và TS Mai Thị Thanh Huyền đã đóng góp nhiều ý kiến quí báu để hoàn thiện luận văn

- Phòng đào tạo Sau đại học, khoa Hóa học cùng các thầy cô giáo, các cán bộ phòng thí nghiệm khoa Hóa trường Đại học Vinh, cán bộ và kỹ thuật viên thuộc Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm - Mỹ phẩm Nghệ An đã giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cung cấp hóa chất, thiết bị và dung cụ dùng cho đề tài

Xin cảm ơn tất cả những người thân trong gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn

Nghệ An, tháng 10 năm 2014

Người thực hiện

Hàn Chí Tú

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC SƠ ĐỒ x

MỞ ĐẦU 1

I Lý do chọn đề tài 1

II Bố cục của luận văn 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về mỹ phẩm 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Phân loại mỹ phẩm 3

1.1.3 Thành phần của mỹ phẩm 4

1.1.4 Tác dụng của mỹ phẩm 4

1.1.5 Sự phát triển của nấm mốc, vi khuẩn trong mỹ phẩm 4

1.1.6 Các thành phần độc hại cho da có trong mỹ phẩm 5

1.2 Giới thiệu các đối tượng nghiên cứu 7

1.2.1 Kem rửa mặt ngăn ngừa mụn 7

1.2.2 Sữa rửa mặt nhờn da 8

1.2.3 Sữa tắm LUX 9

1.2.4 Kem dưỡng da - Lành mụn 10

1.2.5 Kem dưỡng da 11

1.3 Chất cấm dexamethason acetat 12

1.3.1 Công thức hóa học 12

1.3.2 Tác dụng dược tính của dexamethason 13

1.3.3 Các đặc tính lâm sàng 14

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 16

1.4.1 Nguyên lý 16

1.4.2 Phân loại 17

1.4.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo 18

1.4.4 Pha động trong sắc ký pha đảo 21

1.5 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 24

1.5.1 Thời gian lưu: Retenion time (Rt) 24

1.5.2 Hệ số dung lượng K’ 25

1.5.3 Độ chọn lọc (α) và độ phân giải (Rs) 25

1.5.4 Số đĩa lý thuyết N 26

1.5.5 Hệ số bất đối xứng T 27

1.6 Hệ thống thiết bị HPLC 27

1.6.1 Bình đựng dung môi 28

1.6.2 Bộ khử khí degasse 28

1.6.3 Bơm (pump) 29

1.6.4 Bộ phận tiêm mẫu (injection) 29

1.6.5 Cột sắc ký 29

1.6.6 Đầu dò (detector) 30

1.6.7 Bộ phận ghi tín hiệu 31

1.6.8 In kết quả 31

1.7 Các phương pháp định lượng 31

1.7.1 Phương pháp đường chuẩn 31

1.7.2 Phương pháp một mẫu chuẩn 31

1.7.3 Phương pháp thêm 32

1.7.4 Phương pháp thêm chuẩn 32

1.8 Đánh giá phương pháp phân tích 32

1.8.1 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và (LOQ) của phương pháp 32

1.8.2 Đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo 33

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 34

2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 34

2.1.1 Thiết bị 34

2.1.2 Dụng cụ 35

2.1.3 Hóa chất 35

2.2 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản mẫu và xử lý mẫu 35

2.2.1 Lấy mẫu 35

2.2.2 Các sơ đồ xử lý mẫu 36

2.3 Phương pháp phân tích 38

2.3.1 Khảo sát các điều kiện tối ưu 38

2.3.2 Xây dựng đường chuẩn 38

2.3.3 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 38

2.4 Xử lý số liệu thực nghiệm 39

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Khảo sát tìm điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích 41

3.1.1 Khảo sát vạch phổ hấp thụ 41

3.1.2 Khảo sát tỉ lệ pha động 42

3.1.3 Khảo sát tốc độ dòng 43

3.1.4 Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính 44

3.2 Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của dexamethason acetat 45

3.2.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 47

3.2.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 48

3.3 Đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo 48

3.4 Tổng kết các điều kiện áp dụng phân tích dexamethason acetat trong mẫu phân tích 49

3.5 Áp dụng kết quả nghiên cứu để phân tích một số mẫu mỹ phẩm 50

3.5.1 Xác định hàm lượng dexamethason acetat một số mẫu mỹ phẩm 50

3.5.2 Xác định độ lặp lại hàm lượng dexamethason acetat có

trong mẫu mỹ phẩm 51

3.6 Các sắc đồ của phép đo HPLC 53

3.6.1 Sắc đồ mẫu trắng 53

3.6.2 Các sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ khác nhau 53

3.6.3 Sắc đồ các mẫu mỹ phẩm 57

KẾT LUẬN 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography) LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

MeOH : Methanol

ACN : Acetonitril

HPLC-MS : Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò khối phổ SKPB : Sắc ký phân bố

SKPT : Sắc ký pha thường

SKPĐ : Sắc ký pha đảo

TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) KPH : Không phát hiện

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Nang lông bị bít tắc, viêm nhiễm khi sử dụng mỹ phẩm 6

Hình 1.2 Kem rửa mặt ngăn ngừa mụn Acnes 7

Hình 1.3 Sữa rửa mặt Z 8

Hình 1.4 Sữa tắm LUX 9

Hình 1.5 Kem dưỡng da - Lành mụn B2 10

Hình 1.6 Kem dưỡng da VITAL CARE VITAMIN E CREME 11

Hình 1.7 Hình ảnh cấu trúc không gian dexamethason acetat 12

Hình 1.8 Bề mặt silica đã thủy phân 18

Hình 1.9 Tạo nhánh trên bề mặt silica 19

Hình 1.10 Cấu trúc của cột ODS 19

Hình 1.11 Cấu trúc cột LC-DB 20

Hình 1.12 Cấu trúc cột có gốc isopropyl 20

Hình 1.13 Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC 23

Hình 1.14 Sơ đồ hệ thống HPLC 27

Hình 1.15 Đồ thị kỹ thuật đường chuẩn thêm chuẩn 32

Hình 2.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100 34

Hình 3.1 Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của dexamethason axetat 45

Hình 3.2 Đồ thị đường chuẩn của dexamethason acetat 46

Hình 3.3 Sắc đồ mẫu trắng 53

Hình 3.4 Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 0,5 ppm 53

Hình 3.5 Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 1,0 ppm 54

Hình 3.6 Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 2,0 ppm 54

Hình 3.7 Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 3,0 ppm 55

Hình 3.8 Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 5,0 ppm 55

Hình 3.9 Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 6,0 ppm 56

Hình 3.10 Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 6,5 ppm 56

Hình 3.11 Sắc đồ mẫu MP-KR05 - Kem rửa mặt ngăn ngừa mụn Acnes 57 Hình 3.12 Sắc đồ mẫu MP-SR01 - Sữa rửa mặt Z 57 Hình 3.13 Sắc đồ mẫu MP-ST04 - Sữa tắm LUX 58 Hình 3.14 Sắc đồ mẫu MP DK 02 - Kem dưỡng da - Lành mụn B2 58 Hình 3.15 Sắc đồ mẫu MP DK 03 - Kem dưỡng da vital care viitamin E

creme 59

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng 22

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát vạch đo phổ của dexamethason acetat 42

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động của dexamethason acetat 43

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tốc độ dòng 43

Bảng 3.4 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 44

Bảng 3.5 Số liệu xây dựng đường chuẩn 46

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo 48

Bảng 3.7 Các điều kiện đo dexamethason acetat phương pháp HPLC 49

Bảng 3.8 Lượng cân các mẫu mỹ phẩm 50

Bảng 3.9 Kết quả đo của mẫu phân tích 51

Bảng 3.10 Kết quả phân tích dexamethason acetate có trong mẫu KD2 52

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Trang

A Sơ đồ xử lý chất chuẩn 36

B Sơ đồ xử lý mẫu mỹ phẩm 37

MỞ ĐẦU

I Lý do chọn đề tài

Vào những năm gần đây Việt Nam phát triển rất nhanh về mặt kinh tế đời sống của người dân ngày càng được nâng cao yêu cầu làm đẹp được mọi người quan tâm, nhất là các chị em phụ nữ [9]

Đây cũng là yếu tố giúp cho ngành mỹ phẩm nước ta phát triển rất mạnh

về số lượng và chất lượng cũng như đa dạng về sản phẩm Nhưng chúng ta vẫn còn hạn chế về kiến thức làm đẹp và chăm sóc da một cách thiếu khoa học như sử dụng các loại mỹ phẩm, kem dưỡng da, kem bôi da không rõ nguồn gốc [14] Trong mỹ phẩm có chứa những thành phần nguy hại hoặc loại mỹ phẩm, kem dưỡng da không phù hợp với làn da của từng người thì việc làm đẹp sẽ trở nên vô cùng nguy hiểm, có tác dụng ngược lại với mong muốn làm đẹp của chúng ta Cùng với một số nhà sản xuất bất chấp sự an toàn của người tiêu dùng đã trộn một số thuốc vào trong các mỹ phẩm, đặc biệt là các chất thuộc nhóm glucocorticoid, những glucocorticoid rẻ tiền, dễ kiếm và thường được sử dụng để trộn trong mỹ phẩm Glucocorticoid là thuốc

có tác dụng chống viêm mạch, chống dị ứng, ức chế miễn dịch, và thuốc phải bán theo đơn

Các mỹ phẩm trộn glucocorticoid có nhiều tác dụng phụ không mong muốn như: teo da, xơ cứng bì, viêm da đỏ ửng, giản mao mạch, mụn trứng cá hoặc bội nhiễm nấm, vi khuẩn, vi rút, [22, 28]

Xuất phát từ những vấn đề trên, Ngày 2/9/2003, Việt Nam đã ký kết

"Hiệp định về Hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm"[1] Theo

đó đã có quy định nhóm glucocorticoid là chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài:“Nghiên cứu xác định hàm lượng chất cấm dexamethason acetat trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)”

Để thực hiện đề tài chúng tôi đề ra các nhiệm vụ sau:

1 Khảo sát tìm điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích

- Khảo sát vạch phổ hấp thụ

- Khảo sát tỉ lệ pha động

- Khảo sát tốc độ dòng

2 Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính

3 Khảo sát lập phương trình đường chuẩn của dexamethason acetat

4 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của dexamethason acetat

5 Đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo

6 Áp dụng kết quả nghiên cứu để phân tích một số mẫu mỹ phẩm

II Bố cục của luận văn

Luận văn gồm 63 trang với 11 bảng số liệu, 31 hình: Mở đầu 2 trang; Chương I: Tổng quan 31 trang; Chương II: Phương pháp nghiên cựu và thực nghiệm 7 trang; Chương II: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 19 trang; Kết luận 1 trang; Tài liệu tham khảo 3 trang gồm 28 tài liệu tham khảo

- Theo định nghĩa trên, mỹ phẩm đã không còn là một sản phẩm làm đẹp thông thường mà mang ý nghĩa của dược phẩm Đó cũng chính là lý do

mà các nhà sản xuất cũng như các bác sĩ da liễu luôn khuyên người tiêu dùng

sử dụng mỹ phẩm một cách đúng đắn và thận trọng [14]

1.1.2 Phân loại mỹ phẩm

Thông thường mỹ phẩm được chia làm ba loại [9, 13, 14, 19]:

+ Loại thứ nhất là mỹ phẩm bề ngoài: Các sản phẩm trang điểm bề mặt (sản phẩm make up, sơn móng tay, thuốc nhuộm tóc…) Các sản phẩm này chỉ tác động đến vẻ bề ngoài chứ không đi sâu vào sinh lý da

+ Loại thứ hai là mỹ phẩm dự phòng, bao gồm các sản phẩm chăm sóc

da, dưỡng da dành cho việc làm chậm lại các biến đổi sinh lý của da (lão hóa, khô da) và bảo vệ chống lại các tác nhân bên ngoài (ô nhiễm, ánh nắng, chất kích ứng): Kem chống nắng, sữa dưỡng ẩm, nước hoa hồng,…

+ Loại thứ ba là các sản phẩm sửa chữa được dùng khi người ta đã thất bại trong dự phòng Đối mặt với các tổn thương người ta phải chăm sóc, khắc phục chúng bằng các sản phẩm như là làm căng, làm ẩm, làm láng, tái sinh, giảm béo, chống rụng tóc,…Với chuyên khoa da liễu, các tổn thương thuộc về lĩnh vực của da như: vảy nến, chàm, mụn trứng cá,… Dược mỹ phẩm về da là một công cụ bổ sung hiệu quả cho các điều trị y khoa

Ngoài ra còn có thể phân loại mỹ phẩm theo các bộ phận mà nó cho tác dụng như sau:

+ Da: xà bông tắm, sữa tắm, phấn hồng, phấn nền, bột thơm, nước hoa, chất làm trắng, chất làm mềm, nước hoa, kem chống nắng, kem dưỡng da,… + Lông tóc: dầu gội, dầu xả, thuốc nhuộm tóc, thuốc duỗi tóc, thuốc uốn tóc, gel vuốt tóc, kem tẩy lông, kem cạo râu,…

+ Mắt: bút kẻ mắt, kẻ lông mày, kem chải mi, mi mắt giả

+ Môi: son môi, chất làm ẩm môi, chất làm bóng môi,…

+ Móng tay, chân: sơn, thuốc tẩy sơn,

- Tùy theo từng loại mỹ phẩm và mục đích sử dụng có những tác dụng sau:

- Lớp kem thoa lên da như là “tấm chăn” lọc tia mặt trời, làm giảm tác hại của tia UV đối với da Mỹ phẩm chứa các loại vitamin chống các tác nhân gây lão hoá, các lớp che chắn chống ô nhiễm từ môi trường

- Giúp làn da mịn màng, săn chắc, ngăn ngừa và hạn chế mụn phát triển

- Có tác dụng làm trắng da, nhất là sử dụng vào ban đêm vì đêm là thời điểm lý tưởng nhất để da hấp thụ các dưỡng chất làm trắng da do quá trình trao đổi chất của các tế bào diễn ra mạnh mẽ

- Mỹ phẩm cũng giúp loại bỏ những tế bào chết trên da và giữ ẩm cho da

- Mỹ phẩm tác động sâu vào bên trong da giúp kích thích, tái sinh tế bào

da, phục hồi làn da, tạo một làn da tươi khỏe [9, 12, 13]

1.1.5 Sự phát triển của nấm mốc, vi khuẩn trong mỹ phẩm

- Do các loại mỹ phẩm thường có độ ẩm và nhiệt độ rất thích hợp để nấm mốc, vi khuẩn sinh sôi nảy nở

- Ngoài nhiệt độ và độ ẩm, còn có những yếu tố khác cũng là điều kiện thuận lợi để nấm mốc, vi khuẩn phát triển như: độ pH, nguồn dinh dưỡng trong mỹ phẩm

- Nấm mốc có khả năng đồng hoá các loại hydrocacbon phức tạp giống như lignin, cellulose, tinh bột, gelatin, Có được khả năng này là do nấm là những sinh vật hoá dị dưỡng (chemoheterotroph), có hệ thống enzym ngoại bào rất phát triển Các enzym sau khi đã tiết ra môi trường xung quanh, chúng phân huỷ các hydrocacbon phức tạp thành các phân tử nhỏ, sau đó các phân

tử này được vận chuyển qua màng vào tế bào Đó là nguồn dinh dưỡng để nấm xây dựng các thành phần cần thiết cho tế bào

- Sự đơn giản về nguồn dinh dưỡng, khả năng chống chịu với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường, cùng với các phương thức sinh sản đa dạng của nấm đã giúp cho chúng phát triển rất nhanh với số lượng lớn

Tới thời điểm hiện nay (2010), có khoảng 2500 loài nấm đã được ghi nhận trên lãnh thổ Việt Nam, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là những loài nấm lớn (macro fungi) Hay gặp trên các bãi cỏ, trên những đống

lá mục, cũng có khi ký sinh trên cơ thể thực vật khác Nó thường bắt đầu sinh sôi và nảy nở ở những nơi thời tiết ẩm thấp [3, 14, 19]

1.1.6 Các thành phần độc hại cho da có trong mỹ phẩm

Mỹ phẩm được bào chế theo nhiều dạng, nhiều mùi, nhiều màu sắc

khác nhau theo những công thức, nguyên liệu cũng khác nhau Có nhiều

loại mỹ phẩm được tạo từ các thành phần nguyên liệu khác nhau nhưng

thường được trộn từ các loại mỹ phẩm Trung Quốc, thuốc tây, và các loại hóa chất dùng trong công nghiệp

Trong mỹ phẩm thường có những thành phần hóa học gây hại cho da

Theo điều tra, đa số các loại mỹ phẩm đều có chứa: nhiều hóa chất độc hại như thủy ngân, hydroquinone, glucocorticoid, acide salicylique, iode, hydrogen peroxyde,… Những chất này thường gây nên hiện tượng phồng rộp

da, nhiễm trùng da, tức ngực, nôn mửa, phổi bị ứ nước, thậm chí còn có thể dẫn đến suy thận, suy gan,…

Hình 1.1 Nang lông bị bít tắc, viêm nhiễm khi sử dụng mỹ phẩm

Đặc biệt, các chất thuộc nhóm glucocorticoid trong mỹ phẩm là mối đe

dọa cực kì nguy hiểm cho làn da và sức khỏe của bạn [3, 22, 28]

Các thành phần độc hại cho da có trong mỹ phẩm đã được quy định

theo "Hiệp định về Hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm" Các quốc gia của Hiệp hội các nước Đông Nam Á (ASEAN) ký ngày 2 tháng 9 năm 2003 đã tham gia hiệp định này ngoại trừ Đông Timor Hiệp định này ký ngày 2 tháng 9 năm 2003 và có hiệu lực vào ngày 1/1/2008 [1]

1.2 Giới thiệu các đối tượng nghiên cứu

1.2.1 Kem rửa mặt ngăn ngừa mụn

Hình 1.2 Kem rửa mặt ngăn ngừa mụn Acnes

Số thứ tự: 01

Kỹ hiệu mẫu: 14KSMP006

Mã số mẫu: KR05

Tên mẫu: Kem rửa mặt ngăn ngừa ngừa mụn Acnes

Thành phần: Water, Glycerin, Palmitic acid, Butylene Glycol, Polyethylene Glycol Monostearate, Myristic Acid, Potassium hydroxide, Lauric Acid, Clea Europaea Fruit oil, Lauric Acid Diethanolamide, Potassium, Lauroyl Glutamate, Isopropylmethylphenol, Dipotassium Glycymhizinate, Tocopheryl Acetate, Magnesium Ascorbyl, Phosphate, Saxifraga, Ethanol, Potassium Cloride, Sodium Hydroxide, Lauryl Hydroxy sultaine, Chromium Oxide, Cl

Tên mẫu: Sữa rửa mặt Z

Thành phần: Stearic Acid 10%, PEG 400, Vitamin E 0,1%, Tinh dầu nghệ 1%, Triethanolamide 1%, Glycerin 2%, Glycerin Stearate 3%, Methyl & Propyl Paraben 0,3%, Hương liệu 0,3%, Nước vừa đủ 100%

Tên mẫu: Sữa tắm LUX

Thành phần: Water, Myristic acid, Laury acid, Potassium Hydroxide, Sodium Laureth Sulfate, Myistic Acid, Cocamidopropyl, Betaine, Lauric acid, Potassium Chloride, Sodium Laureth Sulfate, Patr acid, Perfume, Glycol Distearate, Pru Avium(Sweet Cherryl), Seed Oil, Cocamidopropyl Beta , Hydroxypropyl, Methylcellulose, Cetearyl Alcohol, Cetearyl Glucoride, Paim Kenelamide MEA, Fragrance, Glycol Distearate, Sidium PCA, Phenoxyethanol, Tetrasodiom EDTA, Imidaazolidinyl Urea, Guar Hydroxypropul Trinonium Chloride Sodium Chloride, Citric Acid, Cl4700, Cl17200

Tên mẫu: Kem dưỡng da - Lành mụn B2

Thành phần: Water, Glycerin, Steartrimonium Cloride, Dicocodimonium Cloride, Cyanoccobalamim, Steartrimonium Bromide, Fragrance Butylene Glycol, Isopropyl Alcohol, Jasminuim Officinale Oil

Tên mẫu: KEM DƯỠNG DA VITAL CARE VITAMIN E CREME

Thành phần: Vitamin E, Vitamin A, Vitamin D, Water, Paraffinum liquidum, isopropyl Myristate, Caprylic Capric Triglycerides,, Tocopherol, Cetyl Alcohol, Niacinamide, Octyl Methoxy Cinnamate, Sorbitan, Stearate, Polyoxyethylene, Stearate, Phenoxyethanol, Fragrances

1.3 Chất cấm dexamethason acetat

1.3.1 Công thức hóa học

Cấu tạo

Cấu trúc không gian dexamethason acetat

Hình 1.7 Hình ảnh cấu trúc không gian dexamethason acetat

Dexamethasone acetat

Công thức phân tử: C24H31FO6

Khối lượng trung bình: 434.497711

Khối lượng Monoisotopic: 434,21048

Tên khoa học: 1,4-dien-21-yl acetat [22]

9-fluoro-11,17-dihydroxy-16-methyl-3,20-dioxopregna-Tính chất lý hóa

Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, đa hình Dễ tan trong ethanol 96% và aceton, khó tan trong methylen clorid, thực tế không tan trong nước

Dexamethasone acetat chứa từ 97,0 đến 103,0% C24H31FO6 ở dạng khan

1.3.2 Tác dụng dược lý của dexamethason

Dexamethason là dẫn xuất của glucocorticoid, do đó dexamethason có các đặc tính chất của glucocorticoid và đặc biệt nó có hoạt tính chống viêm mạnh, ức chế miễn dịch , nhất trong số các dẫn xuất của glucocorticoid Dexamethason mạnh hơn hydrocortison 30 lần, mạnh hơn prednisolon 7 lần

Về tác đụng chống viêm

Glucocorticoid tự nhiên (có sẵn trong cơ thể do tuyến thượng thận tiết ra) và glucocorticoid tổng hợp hữu cơ đều có hoạt tính chống viêm mạnh, có thể ức chế ở giai đoạn phiên mã của các yếu tố có vai trò quan trọng trong phản ứng viêm [22]

- Các glucocorticoid chống lại các biểu hiện của quá trình viêm dù do bất kỳ nguyên nhân gì (cơ học, hóa học, nhiễm khuẩn, tia xạ, miễn dịch), đó

là do glucocorticoid:

Làm giảm tác dụng hoặc ức chế các chất trung gian gây viêm như các cytokin (interleukin,TMF, GM-CSF) ecosanoid (prostaglandin, leukotrien) giảm phóng thích histamin từ tế bào

Làm giảm sự tập trung bạch cầu tại ổ viêm như neutrophil, đại thực bào

và giảm cả hoạt tính của bạch cầu này

- Glucocorticoid còn làm giảm chức năng của nguyên bào sợi, do đó làm giảm suất collagen và glycosaminglycan do đó giảm sự hình thành mô liên kết Điều này góp phần ức chế quá trình viêm mãn tính nhưng cũng làm chậm lành vết thương [25, 28]

Về tác dụng ức chế miễn dịch

- Glucocorticoid làm giảm sản sinh kháng thế (immunoglobulin)

- Glucocorticoid làm giảm các thành phần bổ thể trong máu

Nhờ các tác dụng trên mà glucocorticoid chữa được phản ứng quá mẫn, kháng viêm, nhưng điều đó làm mất đi đáp ứng viêm có tính bảo vệ, làm giảm khã năng đề kháng nên dễ nhiễm khuẩn, nhiễm nấm

Sự giảm tạo collagen được ứng dụng để trị sẹo lồi và ngăn cản sự phát triển của tổ chức sừng trong một số bệnh về da nhưng làm chậm tiến trình lành vết thương [28]

Chống chỉ định:

Mẫn cảm với dexanethason acetat

Nhiễm nấm da, bôi chỗ trầy xước, nhiễm virus tại chỗ hoặc nhiễm khuẩn lao, lậu chưa kiểm soát được bằng thuốc kháng khuẩn và khớp bị hủy hoại nặng

Thận trọng:

Người bị loãng xương, hoặc mới phẫu thuật ruột, loét dạ dày - tá tràng, đái tháo đường, tăng huyết áp, suy tim, suy thận, lao thì cần phải theo dõi chặt chẽ và điều trị tích cực các bệnh đó nếu cần phải dùng dexamethason

Tương tác thuốc:

- Các barbiturat, phenytoin, rifampicin, rifabutin, carbamazepin, ephedrin, aminoglutethimid có thể làm tăng thanh thải corticosteroid nên làm giảm tác dụng điều trị

- Corticosteroid đối kháng tác dụng của các tác nhân gây hạ đường huyết (kể cả Insulin), thuốc hạ huyết áp và thuốc lợi tiểu Corticosteroid làm

tăng tác dụng hạ kali huyết của acetazolamid, các thiazid lợi tiểu quai, carbenoxolon

- Sự thanh thải salicylat tăng khi dùng đồng thời với corticoid, vì vậy khi ngừng corticoid dể bị ngộ độc salicylat

- Các thuốc lợi tiểu làm giảm kali huyết (ví dụ thiazid, furosemid) và amphotericin B có thể làm tăng tác dụng giảm kali huyết của glucocorticoid

Tác dụng không mong muốn

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

1.4.1 Nguyên lý

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột

là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phát triển rất nhanh từ cuối những năm 1980 Việc sử dụng các chất nhồi có kích thước nhỏ (5-10 m) làm cho hiệu quả tách của phương pháp này tốt hơn so với phương pháp lỏng cổ điển

Có thể nói một cách đơn giản HPLC là một sắc ký cột (column chromatography) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký Với những tiến bộ kỹ thuật về cột, detector

đã chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao Loại này cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30 Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lượng vài mililit/phút qua cột tách Lượng mẫu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20 l

Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có khả năng tách các hợp chất đặc thù như:

- Các hợp chất cao phân tử và ion thuộc các đối tượng nghiên cứu y học, sinh học, …

- Các hợp chất tự nhiên không bền

- Các hợp chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ

Các hợp chất trên gồm có: nucleozit, nucleotit, axit amin, đường, polisacarit, sắc tố thực vật, axit hữu cơ, lipit không phân cực và phân cực, chất màu, dược phẩm, chất hoạt động bề mặt, vitamin, kháng sinh, …

Điều khác biệt giữa HPLC và GC là trong phương pháp HPLC, mẫu chỉ cần làm hoà tan mà không cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích được các chất mà không sợ gây ra sự phân hủy nhiệt trong quá trình phân tích [17, 21]

Sắc ký ion (ion chromatography)

Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography) Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (< 3000)

SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường (hay còn gọi là sắc ký pha thuận) - SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo - SKPĐ (reversed phase chromatography)

Trong sắc ký ion: Pha tĩnh là các chất hữu cơ mang các nhóm hoạt động khác nhau: cation để tách các kim loại kiềm và kiềm thổ, amonium, các amin-anion để tách các anion vô cơ, phosphate hữu cơ

Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ Dung môi sử dụng trong SKPĐ

là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng

mà lại rẻ tiền Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT [10,

15, 16, 17]

1.4.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography) Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng - lỏng vì một số nguyên nhân sau:

Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích

Do pha tĩnh của sắc ký lỏng - lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Vì vậy, ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này

Bề mặt các hạt silica - SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):

Hình 1.8 Bề mặt silica đã thủy phân

Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào

Hình 1.9 Tạo nhánh trên bề mặt silica

Thường chỉ khoảng 50% nhóm -OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4 µmol/m2 bề mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể Ngoài nhóm Cl người ta còn sử dụng -OCH3

Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh

Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất

Hình 1.10 Cấu trúc của cột ODS

Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm -OH chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường pH phân tích

Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C18) ra khỏi nền Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không còn tương tác tốt với pha tĩnh nữa

Trong môi trường bazơ (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể

bị hòa tan (SiO2 thành silicat), hệ quả là số đĩa lý thuyết N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi sắc ký rộng ra và thời gian lưu cũng có thể giảm Kết quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ chính xác

Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn)

để tương tác với nhóm -OH này (gọi là hiện tượng end-capping) Lúc này ta

sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính bazơ (cột LC-DB của hãng SUPELCO)

Hình 1.11 Cấu trúc cột LC-DB

Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm -OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của -Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm -OH, cản trở tương tác của nhóm -OH với chất cần phân tích

Hình 1.12 Cấu trúc cột có gốc isopropyl

Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (cột EPS - Expended Polar Selectivity)

Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase - PRP) cho phép phân tích trong môi trường pH từ 1 - 13 Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và bazơ mạnh [16, 17, 18]

1.4.4 Pha động trong sắc ký pha đảo

Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích từ đó ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu Quy trình đó phải đáp ứng đầy

đủ các tiêu chuẩn của pic đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

Hòa tan mẫu phân tích

Phù hợp với đầu dò

Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh

Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao

Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade)

Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất, đối với hỗn hợp các chất cần phân tích

Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:

Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có, không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học

Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng (đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột

Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column)

Pha động:

+ Phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gian phân tích mẫu

+ Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích

+ Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

+ Phải phù hợp với loại detector: Ví dụ: UV - Vis thì dung môi không được hấp thụ quang (Ví dụ: acid acetic ở bước sóng thấp < 220 nm) Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang

+ Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực

tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitril (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ

để giảm khả năng rửa giải

Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength) …

Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký [15, 24]

Bảng 1.1 Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng

Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α Khi sự thay đổi thành phần pha động không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α Đôi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh

Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính bazơ (nhận proton) của dung môi

Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột

Hình 1.13 Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC

Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối

ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước Với một hỗn

hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước Khi lựa chọn thì phải chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước có

độ rửa giải tương đồng

Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn

1.5 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ Từ các thông số của các pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lợi cho quá trình phân tích sắc ký [16, 17, 21]

1.5.1 Thời gian lưu: Retenion time (Rt)

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

Bản chất sắc ký của pha tĩnh

Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động Trong một phép phân tích nếu Rt nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu Rt quá lớn thì pic bị doãng và độ lặp lại của pic rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hóa chất, độ chính xác của phép phân tích kém Để thay đổi thời gian lưu ta dựa vào các yếu tố trên

1.5.2 Hệ số dung lượng K ’

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng

Thường được tính theo công thức sau:

1.5.3 Độ chọn lọc (α) và độ phân giải (Rs)

Để hoàn toàn phân tích hai cấu tử thì pic của chúng phải không được chồng lên nhau

Tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng phân tích là độ chọn lọc và độ phân giải

Độ chọn lọc α là tiêu chuẩn để đánh giá độ tách với hai đỉnh píc và được định nghĩa

giá dựa trên độ phân giải Rs (Resolution) là đại lượng được xét từ toàn bộ píc

Độ phân giải (Rs) được tính như sau: