Nghiên cứu và định lượng axit kaurenoic trong một số cây thực vật thuộc chi na (annona) ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, có rất nhiều phương pháp và công cụ để nghiên cứu các thành phần hóa học có mặt trong thảo dược, để đánh giá và quản lý chất

TÔ MINH HIỆP

NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊNH LƯỢNG AXIT KAURENOIC TRONG MỘT SỐ CÂY THỰC VẬT THUỘC CHI NA

(ANNONA) Ở VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Vinh – 2014

TÔ MINH HIỆP

NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊNH LƯỢNG AXIT KAURENOIC TRONG MỘT SỐ CÂY THỰC VẬT THUỘC CHI NA

(ANNONA) Ở VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: HOÁ PHÂN TÍCH

Mã số: 60.44.0118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS TRẦN ĐÌNH THẮNG

Vinh – 2014

Ở VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO"

Đề tài luận văn này được hoàn thành với sự hướng dẫn khoa học và chỉ bảo tận tình của PGS.TS Trần Đình Thắng – Phó Trưởng khoa – Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh Thầy đã dành nhiều thời gian hướng dẫn và giải đáp thắc mắc của tôi trong suốt quá trình làm luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị ở phòng thực hành thí nghiệm Hóa phân tích tại Trường Đại Học Vinh đã tận tình giúp đở tôi trong quá trình tôi phân tích mẫu vật và làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các quý cơ quan đã tạo điệu kiện giúp đỡ về mọi mặt để luận văn này hoàn thành đúng kế hoạch

Tôi xin cảm ơn các Thầy Cô khoa Hóa, Phòng Đào tạo sau Đại Học Trường Đại Học Vinh và Trường Đại Học Đồng Tháp, các Thầy Cô tham gia giảng dạy Cao học khóa 20, lớp Hóa phân tích năm học 2012 – 2014 lời cảm

ơn sâu sắc công ơn dạy dỗ trong suốt quá trình giáo dục, đào tạo của nhà trường Đồng thời Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Cao học Hóa phân tích Khóa 20 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Tuy nhiên do sự hiểu biết của bản thân và khuôn khổ của luận văn thạc

sĩ, nên chắc trong quá trình nghiên cứu không tránh khỏi những thiếu sót, Tôi rất mong được sự đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô và độc giả quan tâm đến luận văn này, chân thành cám ơn !

Nghệ An, ngày 26 tháng 10 năm 2014

Tác giả

Tô Minh Hiệp

MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA

LỜI CÁM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỬ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Đối tượng – Phạm vi nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Họ Na (Annonaceae) 4

1.2 Chi Annona 5

1.2.1 Các hợp chất lignan 6

1.2.2 Các hợp chất acetogenin 7

1.2.3 Các hợp chất flavonoit 11

1.2.4 Các hợp chất diterpenoit kauran 12

1.3 Axit kaurenoic 16

1.3.1 Các thông số vật lý 16

1.3.2 Công thức cấu tạo 16

1.3.3 Ứng dụng 17

1.4 Phương pháp sắc ký fingerprint và những ứng dụng của sắc ký fingerprint trong đánh giá chất liệu và dược phẩm [ 1] 17

1.4.1 Giới thiệu về phương pháp fingerprint 17

1.4.2 Những ứng dụng của sắc ký fingerprint trong đánh giá chất lượng dược liệu 19

1.4.3 Cách thức xây dựng và thực hiện phương pháp sắc ký fingerprint 20

1.5 Hệ thống phân tích HPLC 30

1.5.1 Nguyên lý 30

1.5.2 Phân loại 31

1.5.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo 32

1.5.4 Pha động trong sắc ký pha đảo 33

1.5.5 Các bộ phận của hệ thống HPLC 36

1.5.6 Phương pháp tiến hành sắc ký 37

1.5.6.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 37

1.5.6.2 Chuẩn bị dung môi pha động 37

1.5.6.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC 38

1.5.6.4 Cách đo HPLC 38

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 39

2.1 Phương pháp lấy mẫu 39

2.1.1 Thu mẫu 39

2.1.2 Phân lập chất chuẩn axit kaurenoic 40

2.2 Phương pháp phân tích 41

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 41

2.3.1 Thiết bị 42

2.3.2 Dụng cụ 42

2.3.3 Hóa chất 42

2.4 Kỹ thuật thực nghiệm 42

2.4.1 Chuẩn bị hóa chất phân tích 42

2.4.2 Xây dựng đường chuẩn 43

2.4.3 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu 43

2.4.4 Tiến hành phân tích trên máy HPLC/UV 45

2.4.5 Tối ưu hóa phương pháp 45

2.5 Khảo sát đánh giá phương pháp 47

2.5.1 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định

(LOQ) của phương pháp 47

2.5.2 Khảo sát độ lặp 47

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 Phân lập hợp chất kaurenoic 48

3.2 Xác định axit kaurenoic 48

3.3 Định lượng axit kaurenoic 56

3.3.1.Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của axit kaurenoic 56

3.3.2.Phương pháp xử lý kết quả nồng độ Axit kaurenoic 58

3.3.3.Đánh giá phương pháp xác định Axit kaurenoic 58

3.3.4.Sắc đồ Axit kaurenoic 62

KẾT LUẬN 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng)

EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron)ESI-MS: Electron Spray Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng phun

mù electron)

1

H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

13

C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy

DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation

HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation

COSY: Correlation Spectroscopy

s: singlet

br s: singlet tï

t: triplet

d: dublet

dd: dublet của duplet

dt: dublet của triplet

m: multiplet

TMS: Tetramethylsilan

DMSO: DiMethylSulfoxide

Bảng 1.2: Các hợp chất diterpenoit kauran 12

Bảng 1.3: Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng 35

Bảng 3.1: Số liệu phổ 13 C và phổ DEPT của hợp chất axit kaurenoic 49

Bảng 3.2: Diện tích peak của Axit kaurenoic trong Na tương ứng với

từng nồng độ chuẩn

56

Bảng 3.3: Giá trị LOD và LOQ của Axit kaurenoic 57

Bảng 3.4: Kết quả phân tích hàm lượng Axit kaurenoic trong Na 58

Bảng 3.5: Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các

mẫu na

59

Hình 1.2: Công thức cấu tạo các hợp chất acetogenin 9

Hình 1.3: Công thức cấu tạo các hợp chất flavonoit 12

Hình 1.4: Công thức cấu tạo: 16, ent-kaur-15-en-17,19-diol 16

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của axit kaurenoic 17

Hình 1.6: Sơ đồ lựa chọn hệ dung môi trong quá trình chiết mẫu 23

Hình 1.7: Tóm tắt phương pháp sắc ký fingerprint 29

Hình 1.8: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25 o

Hình 2.4: Quy trình chiết tách cao từ lá na 40

Hình 2.5: Quy trình phân lập các chất từ cao etyl axetat của lá na 41

Hình 3.1: Phổ UV-Vis của hợp chất axit kaurenoic 50

Hình 3.2: Phổ IR của hợp chất axit kaurenoic 50

Hình 3.3: Phổ EI-MS của hợp chất axit kaurenoic 51

Hình 3.4: Phổ 1

H-NMR của hợp chất axit kaurenoic 51

Hình 3.5: Phổ 13 C-NMR của hợp chất axit kaurenoic 52

Hình 3.6: Phổ DEPT của hợp chất axit kaurenoic 52

Hình 3.7: Phổ DEPT dãn của hợp chất axit kaurenoic 53

Hình 3.8: Phổ HMBC của hợp chất axit kaurenoic 54

Hình 3.9: Phổ HSQC của hợp chất axit kaurenoic 55

Hình 3.10: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích peak

thu được và nồng độ các chuẩn Axit kaurenoic

57

Hình 3.11: Sắc đồ chuẩn Axit kaurenoic 25 ppm 9.928 min 62

Hình 3.12: Sắc đồ chuẩn Axit kaurenoic 50 ppm 9.941 min 63

Hình 3.13: Sắc đồ chuẩn Axit kaurenoic 100 ppm 9.936 min 63

Hình 3.14: Sắc đồ chuẩn Axit kaurenoic 500 ppm 10.039 min 64

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Thảo dược có mặt ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là các khu vực nhiệt đới Thảo dược đóng vai trò quan trọng trong các liệu pháp chữa bệnh bằng y học cổ truyền tại các nước phương Đông Nguồn tài nguyên thiên nhiên này không những mang nguồn lợi về kinh tế cho cộng đồng dân cư sinh sống tại những nơi có thảo dược mà còn đóng góp vào các liệu pháp chữa bệnh cho cộng đồng ở những khu vực khác Từ xa xưa con người đã biết sử dụng những thảo dược thiên nhiên nhằm mục đích bồi bổ sức khỏe, làm chậm lại quá trình lão hóa, kéo dài tuổi thọ

Việt Nam được ghi nhận là một trong những trung tâm đa dạng sinh học của thế giới Các hợp chất thiên nhiên luôn đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống con người trong việc sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, hương liệu, mỹ phẩm…

Ở các vùng nhiệt đới, tất cả các bộ phận của các cây họ Na được sử dụng trong các liệu pháp thiên nhiên, như là: vỏ cây, lá, rễ, quả, và hạt của quả Những tính chất và ứng dụng khác nhau phụ thuộc vào các bộ phận khác nhau của cây Nói chung, quả và nước ép từ quả có thể tẩy giun và ký sinh trùng, để hạ sốt, chẳng hạn: lactagogue (tăng sữa mẹ sau khi sinh con), asstringent chữa tiêu chảy và bệnh lỵ Bột nghiền từ hạt được sử dụng như một loại thuốc tẩy giun sán và chống lại sinh vật ký sinh bên trong cơ thể và môi trường xung quanh, ví dụ: chí-rận, và giun sán Vỏ cây, lá và rễ cây được xem là thuốc an thần, chống co thắt, hạ huyết áp, bổ thần kinh, và nước trà chữa các hiệu ứng rối loạn khác nhau trong cơ thể

Ở dãy Andes ở Peru, nước trà của lá cây họ Na được sử dụng để chữa viêm niêm mạc và bột nghiền được sử dụng để tiêu diệt ký sinh trùng Ở vùng

Amazon-Peru, vỏ cây, rễ, và lá được sử dụng để chữa bệnh tiểu đường, là một loại thuốc an thần và chống co thắt Các bộ tộc bản xứ ở Guyana sử dụng nước trà từ lá và đôi khi là vỏ cây như là một thuốc an thần và thuốc bổ tim Vùng Amazon của Brazil, nước trà từ lá cây họ Na được sử dụng để giải quyết các bệnh về gan, và tinh dầu từ lá và quả chưa chín được trộn với dầu ô liu và được thoa bên ngoài để chữa chứng đau dây thần kinh, thấp khớp, và viêm khớp Ở Jamaica, Haiti và Tây Ấn, từ quả hoặc nước ép từ quả được đúng chữa bệnh sốt, ký sinh trùng và tiêu chảy, vỏ cây hoặc lá được sử dụng như là thuốc chống co thắt, thuốc an thần, bồi bổ thần kinh theo điều kiện về tim mạch, ho, cảm cúm, sinh con khó, hen suyễn, suy nhược, cao huyết áp, và

ký sinh trùng [9, 10]

Axit kaurenoic được tìm thấy ở các cây khác thuộc họ Na

(Annonaceae) đã được ghi nhận với các hoạt tính: kháng ung bướu, kháng ký sinh trùng, diệt sâu bọ, kháng động vật nguyên sinh, ngán ăn, diệt giun sán, và kháng khuẩn [11] Do đó việc xác định và định lượng hợp chất này trong các cây họ Na rất cần thiết

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, có rất nhiều phương pháp và công cụ để nghiên cứu các thành phần hóa học có mặt trong thảo dược, để đánh giá và quản lý chất lượng thảo dược Ví dụ như phương pháp phân lập hợp chất theo định hướng hoạt tính sinh học và xác định cấu trúc hóa học, phương pháp này có thể phát hiện và phân lập một số hợp chất có hoạt tính trong thảo dược Tuy nhiên trong thảo dược tồn tại rất nhiều hợp chất, nhiều hợp chất chỉ tồn tại với hàm lượng rất thấp, đôi khi không bền, dạng đồng phân, dạng dễ bị phân hủy ngay khi bị phân lập Do đó việc sử dụng phương pháp phân lập thông thường gặp rất nhiều khó khăn trong việc đánh giá và kiểm soát thành phần của thảo dược Trong điều kiện

đó một phương pháp đang được phát triển và ứng dụng đó là phương pháp sắc

ký, phương pháp này kết hợp với các phương pháp phân lập, xác định cấu trúc

và hoạt tính đang được ứng dụng nhiều trong việc đánh giá, kiểm soát chất lượng dược liệu [4]

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu và định

lượng axit kaurenoic trong một số cây thực vật thuộc chi Na (Annona)

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” làm luận văn tốt nghiệp

thạc sỹ

2 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu các phương pháp định lượng axit kaurenoic

- Nghiên cứu quy trình tách, chiết axit kaurenoic trong các mẫu cây thuộc chi Na thu được trong quá trình lấy mẫu thực tế

- Nghiên cứu quy trình định lượng axit kaurenoic bằng phương pháp HPLC

3 Đối tượng – phạm vi nghiên cứu

Định lượng axit kaurenoic trong một số loài thuộc chi Na (Annona): Na (Annona squamosa ), Na Xiêm (Annona muricata), Bình Bát (Annona

reticulata)

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Họ Na (Annonaceae)

Họ Na (Annonaceae) còn được gọi là họ Mãng cầu, là một họ thực vật

đến 2.500 loài trong 120 - 130 chi, đây là họ lớn nhất của Bộ Mộc Lan

(Magnoliales) Chi điển hình của họ này là Annona (Na hay Mãng cầu ta; mãng cầu xiêm hay mãng cầu gai) Họ này sinh trưởng chủ yếu ở vùng nhiệt đới, và chỉ có một ít loài sinh sống ở vùng ôn đới Khoảng 900 loài ở Trung

và Nam Mỹ, 450 loài ở châu Phi, và các loài khác ở châu Á

Các loài thuộc họ Annonaceae có lá đơn, mọc so le (mọc cách), có cuống lá và mép lá nhẵn Lá mọc thành hai hàng dọc theo thân cây Vết sẹo nơi đính lá thường nhìn thấy rõ các mạch dẫn Cành thường ở dạng zíc zắc Chúng không có các lá bẹ Hoa đối xứng xuyên tâm (hoa đều) và thường là

lưỡng tính Ở phần lớn các loài thì 3 đài hoa nối với nhau ở gốc hoa Có 6

như nhiều nhụy hoa, mỗi nhụy có bầu nhụy dạng một ngăn chứa một hoặc nhiều tiểu noãn Hoa đôi khi mọc trực tiếp trên các cành lớn hoặc trên thân cây Quả là nang, bế quả hay đa quả [1]

Quả lớn, có nhiều thịt, quả của một số loài là ăn được, bao gồm các loài của chi Annona (na Nam Mỹ, mãng cầu xiêm) hay chi Asimina (đu đủ Mỹ - không nhầm với quả đu đủ thật với danh pháp khoa học (Carica papaya) hoặc

chi Rollinia

Bên cạnh đó, một số loài như hoàng lan (Cananga odorata) còn chứa

tinh dầu thơm và được sử dụng trong sản xuất nước hoa hay đồ gia vị Các loài cây thân gỗ còn dùng làm củi đốt

Vỏ cây, lá và rễ của một số loài được sử dụng trong y học dân tộc Bên cạnh đó, các nghiên cứu dược lý đã tìm thấy khả năng kháng nấm, kháng

phần hóa học của lá, rễ và vỏ cây, quả, vỏ của quả…

Một số loài được trồng làm cây cảnh, đặc biệt là Polyalthia longifolia pendula

Những năm gần đây họ Na được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu

Đặc biệt, nhóm nghiên cứu của Yang-Chang Wu (Đài Loan) đã tìm được hơn 100 hoạt tính sinh học của các chất tách ra từ cây họ Na (Annonaceae) Trong đó có nhiều chất có độc tính, hoạt tính kháng vi trùng,

ức chế sự tái tạo tế bào HIV, chống đông tụ tiểu cầu

Nhóm nghiên cứu của De-Quan Yu (Trung Quốc) [18] đã nghiên cứu

và tách được các chất có khả năng chống u bướu từ thực vật họ Na: có khoảng 50 acetogenin, 12 styrylpyron và 25 polyoxygenat cyclohexen mới

được tách ra từ 5 loài Uvaria, 4 loài Goniothalamus và 1 loài Annona Bước

đầu kiểm tra hoạt tính sinh học, phần lớn các chất mới tách ra có các hoạt tính chống u, bướu quan trọng

1.2 Chi Annona

Chi Annona L có 125 loài, phân bố tập trung ở các vùng nhiệt đới châu

Mỹ và châu Phi Ở Việt Nam, có 4 loài, trong đó có 3 loài là cây trồng, gồm:

Na (Annona squamosa L.), Mãng cầu xiêm (A Muricata L.), Bình bát (A

Reticulata L.)

Từ Chi Annona các nhà khoa học đã phân lập được nhiều loại hợp chất khác nhau như: cacbohydrat, chất béo, amino acid, protein, polyphenol, tinh dầu, tecpen, các hợp chất thơm, cyclopeptit, flavonoit, ent-kauran ditecpenoit, lignan

1.2.1 Các hợp chất lignan

Có 9 chất lignan (38-47) của chi Annona đƣợc Yang và cộng sự; Wu

và cộng sự công bố Các lignan đƣợc tìm thấy ở loài A montana, A

cherimola và gồm: Syringaresinol (38), epi-syringaresinol (39),

(+)-diasyringaresinol (40) và liriodendrin (41) thu đƣợc từ loài A cherimola, syringaresinol (42) đƣợc tách từ loài A montana và yangambin (43), magnolin (44), eudesmin (45), membrin (46) đƣợc tách từ R mucosa Trong

6

O

O

H H

OR OMe

OMe

H H

OH OMe

CH3O

O H

OMe

OH OMe

OMe O

O

H H

OMe

O

O

H H

Một dãy các hợp chất acetogenin đã đƣợc tách từ chi Annona, trong đó

có 24 chất mới Phần lớn các acetogenin gồm một hoặc hai vòng tetrahydrofuran, một α, β-unsaturated-γ-lacton hoặc epoxit trong mạch chính với các nhóm chức nhƣ –OH, =O, C=C và diol kề nhau trong mạch dài

O (CH2)9

OH

O OH Me

OH

O O

Me

O OH

O OH Me

2 )10

O O

R 1

Me

erythro trans threotrans threo

49, R1=H

54, R1 =OH

O OH

O OH Me

2 )10

O O

Me trans trans

50

threo threo threo

O OH

O OH Me

2 )8

O O

Me

51

erythro transthreo trans threo

O OH

O OH

Me Me

O OH

(CH2)5

OH

(CH2)10

O O

Me Me

trans erythro

trans

56

Hình 1.2:Công thức cấu tạo các hợp chất acetogenin

isorhamnetin-3-O-rhamnosit (110), tanarixetin-3-O- rhamnosit (111) thu

4

8 7

Bộ khung cơ bản của các hợp chất diterpenoit kauran gồm 20 cacbon

Một số hợp chất đƣợc tách ra gồm 19 cacbon và đƣợc gọi tên nor-kauran diterpenoit Trong nghiên cứu của Wu và cộng sự đã tách đƣợc 37 hợp chất

kauran từ 4 loài, khác nhau bao gồm: A cherimola, A glabra, A squamosa

và R mucosa và 7 chất trong số chúng là chất mới phát hiện Cấu trúc và sự

tìm thấy của các hợp chất đƣợc nêu ra ở bảng 1.1

COOCH3 H CHO A glabra

10 annoglabasin C * COOCH3 OAc COOH A glabra

11 annoglabasin D * COOCH3 OAc CHO A glabra

12 annoglabasin F * COOCH3 OAc OH A glabra

OAc COOCH3 CHO A glabra

28 axit 16β,17- OAc CH2OAc COOH A glabra

11

12 13 14

1,24 (3H, s, H-18), 0,95 (3H, s, H-20) Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 

(ppm): C-20 (15,6), C-11 (18,4), C-2 (19,1), C-6 (21,8), C-18 (29,0), C-12 (33,1), C-3 (37,8), C-10 (39,7), C-14 (39,7), C-7 (41,3),C-13 (43,8), C-4 (43,9), C-1 (40,7), C-8 (44,2), C-15 (49,0), C-9 (55,2), C-5 (57,1), C-17

(103,0), C-16 (155,8), C-19 (184,9)

1.3.2 Công thức cấu tạo

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của axit kaurenoic

Danh pháp IUPAC : Axit ent-kaur-16-en-19-oic:

Axit kaurenoic được tìm thấy ở các cây khác thuộc họ Na

(Annonaceae) đã được ghi nhận với các hoạt tính: kháng ung bướu, kháng

ký sinh trùng, diệt s âu bọ, kháng động vật nguyên sinh, ngán ăn, diệt giun

sán, và kháng khuẩn [11]

1.4 Phương pháp sắc ký fingerprint và những ứng dụng của sắc ký fingerprint trong đánh giá chất liệu dược phẩm [1]

1.4.1 Giới thiệu về phương pháp fingerprint

Ban đầu fingerprint “Dấu vân tay” được người Trung Quốc sử dụng trong xác thực các văn bản hành chính, các hợp đồng mua bán và trong các giấy tờ thỏa thuận giữa hai bên Năm 1823 giáo sư Johannes đã xuất bản một tài liệu mô tả về fingerprint, trong tài liệu này fingerprint được mô tả như những vòng uốn cong hoặc xoắn ốc, sắp xếp theo các lớp xuất hiện trên bàn tay, chân của mỗi người Cho đến năm 1858, khi người Anh cai trị các nước

thuộc địa, người ta bắt đầu chú ý đến fingerprint trong việc nhận dạng và xác thực cá nhân vì những nét riêng biệt mang tính duy nhất của fingerprint Những ứng dụng mạnh mẽ nhất của fingerprint trong khoa học thực sự bắt đầu từ những năm cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX, một bác sỹ người Xcotlen

đã tiến hành các nghiên cứu, quan sát kỹ lưỡng các mẫu fingerprint và nhận thấy rằng các mẫu fingerprint trên các ngón tay của mỗi cá nhân có những điểm khác biệt, không trùng lặp, những điểm khác biệt này có thể được sử dụng để nhận dạng mỗi cá nhân Chính những phát hiện này đã dẫn đến những phát kiến để so sánh nhận dạng và ứng dụng fingerprint Ứng dụng đơn giản và áp dụng rộng rãi nhất của fingerprint được thực hiện trong ngành an ninh để điều tra, nhận dạng và quản lý, từ những nghiên cứu trong lĩnh vực an ninh, các kỹ thuật fingerprint lần lượt được ứng dụng sang các ngành khoa học khác Trước hết phải kể đến ứng dụng của kỹ thuật fingerprint trong ngành công nghệ thông tin, dựa trên nền tảng của kỹ thuật fingerprint truyền thống, người ta đã xây dựng kỹ thuật fingerprint trong công nghệ mã hóa và bảo vệ, truyền và nhận thông tin Tiếp đó trong ngành ngân hàng, kỹ thuật fingerprint được ứng dụng trong việc thiết kế các hệ thống bảo mật, hệ thống rút tiền và chuyển nhận tài khoản Trong ngành vật liệu, fingerprint được ứng dụng để phân biệt các vật liệu Cuối cùng kỹ thuật fingerprint còn được áp dụng vào việc đánh giá chất lượng dược liệu và nhận dạng độc tố trong y học thông qua phương pháp sắc ký fingerprint

Theo định nghĩa, một sắc ký fingerprint của một mẫu thảo dược là một sắc ký đồ (hoặc một điện tâm đồ) có dược tính và tính chất hóa học điển hình của một dịch chiết mẫu thảo dược đó Mẫu sắc ký đồ này phải đảm bảo các yêu cầu về sự xuất hiện “rõ ràng” hay “mờ nhạt”, sự “giống” hay “khác nhau” của các yếu tố hóa học có mặt trong dược liệu Dựa vào những đặc tính nêu trên, phương pháp sắc ký fingerprint được sử dụng trong việc đánh giá và

kiểm soát chất lượng thảo dược Khó khăn của việc kiểm soát chất lượng dược liệu từ thiên nhiên chủ yếu là do sự phức tạp của các thành phần hóa học, trong đó có rất nhiều sự tương tác qua lại dẫn đến khó có thể xác định chính xác được thành phần nào có hoạt tính Chính vì vậy, nếu đánh giá chất lượng dược liệu mà chỉ dựa vào một số lượng hạn chế các hợp chất có hoạt tính hoặc đọc tố thì rất khó xác định được chất lượng tự nhiên của sản phẩm một cách trọn vẹn Sự ra đời của phương pháp sắc ký fingerprint đã phần nào khắc phục được những hạn chế nêu trên qua đó sẽ giúp cho việc xác định định tính và định lượng chất lượng các thảo dược nhanh chóng và độ chính xác đáng tin cậy Kể từ vài năm trở lại đây, kỹ thuật phân tích sắc ký fingerprint

đã được sử dụng nhiều để xác định và đánh giá chất lượng dược liệu của Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản Năm 2000, Cục Quản lý dược của Trung Quốc đã quyết định phát triển kỹ thuật sắc ký fingerprint của dược liệu

cổ truyền (TMC) như một tiêu chuẩn để đánh giá và quản lý chất lượng của dược phẩm Trong tương lai ko xa, kỹ thuật phân tích sắc ký fingerprint sẽ trở thành một kỹ thuật mang tính tiêu chuẩn cho việc đánh giá chất lượng dược liệu và các sản phẩm thiên nhiên khác có nguồn gốc từ dược liệu, trong đó bao gồm việc đánh giá những nguyên liệu tinh và nguyên liệu thô dùng làm nguyên liệu đầu vào cho công nghiệp hóa dược

1.4.2 Những ứng dụng của sắc ký fingerprint trong đánh giá chất lượng dược liệu

Phương pháp sắc ký fingerprint dựa trên thiết bị HPLC đã được ứng dụng để xây dựng phương pháp xác định nhanh và đơn giản thảo dược có tên

là Isatis indigotica Fort, trong dược liệu cổ điển của Trung Quốc Phương

pháp này được xây dựng trên thiết bị HPLC với cột sắc ký pha đảo C18, hệ dung môi được lựa chọn là nước và methanol (94:4, v/v), tốc độ dòng là 1.0 ml/phút và bước sóng 260nm Sắc ký fingerprint thu được từ hệ thống HPLC-

ELSD để đánh giá và kiểm soát chất lượng loại thuốc tiêm QingKailing đã giúp cho các nhà quản lý dược Trung Quốc kiểm soát rất hiệu quả chất lượng

của loại thuốc tiêm này Sự kết hợp của loài thảo dược Flos carthami dùng trong y học cổ truyền Trung Quốc với loài thảo dược Stigma crosi tạo thành

một bài thuốc rất nổi tiếng, do mục đích thương mại trên thị trường đã xuất

hiện một loại thảo dược rẻ tiền Flos hemerocallis dùng thay thế thảo dược

Flos carthami trong các đơn thuốc Các nhà khoa học Trung Quốc đã phát

triển một phương pháp sắc ký fingerprint dựa trên thiết bị điện di để phân biệt

sự khác nhau giữa ba loài thảo dược kể trên, qua đó đã kiểm soát được thành phần của bài thuốc và giúp quản lý được chất lượng của bài thuốc trên Đánh giá chất lượng dược liệu liên quan trực tiếp đến việc nghiên cứu thành phần của dược liệu, các thành phần này có thể thay đổi theo khu vực phân bố, điều kiện địa lý và mùa vụ thu hoạch Năm 2004, M.Gu và cộng sự đã đánh giá

chất lượng của các loài thảo dược có tên tiếng Việt là Huyết sâm (Salvia

miltiorrhiza) ở các khu vực sinh sống khác nhau và khảo sát sự thay đổi thành

phần của loài thảo dược này theo điều kiện khí hậu, khu vực sinh sống bằng phương pháp sắc ký fingerprint dựa trên hệ thống HPLC, các kết quả nghiên cứu dựa trên sắc ký đồ và tín hiệu UV cho thấy khu vực sinh sống và thời tiết

có tác động rất lớn đến thành phần hóa học của loài Huyết sâm này Bằng cách sử dụng hệ thống LC-MC một số thành phần xuất hiện trên sắc ký fingerprint của loài Huyết sâm cũng đã được nghiên cứu và xác định thông qua việc so sánh các giá trị thu được trên sắc ký lỏng cao áp kết nối với khối phổ

1.4.3 Cách thức xây dựng và thực hiện phương pháp sắc ký fingerprint

Xây dựng fingerprint: Mẫu fingerprint được tạo ra tùy thuộc vào đối

tượng nghiên cứu Mỗi ngành khoa học có tiêu chuẩn đặc trưng riêng cho

mẫu fingerprint Trong đề tài của tôi đề cập đến các tiêu chí để tạo mẫu sắc ký

fingerprint phục vụ cho việc đánh giá dược liệu trong y học cổ truyền

So sánh với tây dược việc đánh giá và quản lý chất lượng không phải là vấn đề đáng quan tâm nhiều vì chất lượng của nguyên liệu đầu vào đã được chuẩn hóa Đối với thảo dược và các sản phẩm từ thảo dược thì ngược lại, nguyên liệu đầu vào có thể từ một loài thực vật hoặc nhiều loài thực vật, các loài này có thành phần thay đổi theo môi trường sống, mùa thu hoạch, hình thức bảo quản, hình thức xử lý mẫu Một số được thu thập không chính xác với nguyên nhân là có sự nhầm lẫn do có sự giống nhau về hình thái học của cây trong vùng nơi thu mẫu, một số phát sinh từ sự nhận dạng sai hoặc những sai sót từ các mẫu thực vật nhập khẩu Một số khó khăn còn nảy sinh từ việc gọi tên các loài thực vật theo các ngôn ngữ địa phương ngay trong cùng một quốc gia hoặc rộng hơn trong một khu vực, các quốc gia Do đó, bước đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong quy trình tạo mẫu sắc ký fingerprint đó là việc chuẩn hóa quá trình thu thập mẫu và xác định tên phân loại dược liệu

Quá trình thu thập mẫu (Collecting samples): Nhằm giúp cho việc chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào, trong cuốn “Hướng dẫn cho phương pháp

nghiên cứu, thử nghiệm y học cổ truyền” của Tổ chức Y tế thế giới WHO,

người ta chia thảo dược thành các nhóm như sau:

Thảo mộc: Thảo mộc bao gồm những chất liệu thô của thực vật ví dụ như các lá, hoa, quả, gốc, thân, rễ, cành, vỏ

Chất liệu của thảo mộc: Chất liệu từ thảo mộc bao gồm các thành phần hóa học của thảo mộc, các loài nước ép tươi, chất gôm, tinh dầu, nhựa và những thành phần xuất phát từ thảo mộc

Thảo mộc đã xử lý: Đây là nguyên liệu đầu vào cho các sản phẩm thảo dược có thể bao gồm các mảnh hoặc bột từ chất liệu của thảo mộc, cao chiết

thô Các nguyên liệu này tạo ra bằng các phương pháp chiết, phân đoạn, ly tâm, hoặc bằng các quá trình vật lý và sinh học khác

Các sản phẩm từ thảo mộc: Các sản phẩm từ thảo mộc bao gồm một hoặc nhiều phần của thảo mộc đã xử lý từ nhiều nguồn khác nhau Các sản phẩm này có thể chứa các tá dược nhằm hỗ trợ thêm cho các thành phần có tác dụng.Tuy nhiên, nếu sản phẩm mà có các thành phần thêm vào có nguồn gốc từ tổng hợp nhân tạo hoặc là các hợp chất được phân lập từ thảo mộc thì sản phẩm đó không được công nhận là sản phẩm từ thảo mộc Một vài thảo dược độc tính rất cao do đó khi thu thập cũng như khi sử dụng cần phải có hướng sử dụng với liều lượng thích hợp Việc ghi nhãn trên các sản phẩm từ thảo dược không chính xác cũng gây ra nhiều khó khăn trong việc đánh giá và quản lý chất lượng dược liệu Quá trình thu thập mẫu cần tiến hành theo tiêu chuẩn thu thập mẫu của các nhà thực vật học, ví dụ như: Ghi nhãn tên thảo dược, tiêu bản, chụp ảnh thảo dược, nơi thu thập mẫu và thời gian thu thập mẫu,…

Quá trình xác định tên khoa học của mẫu thu thập được: Việc định loài

và xác định tên khoa học chính xác của dược liệu đóng vai trò vô cùng quan trọng, việc này sẽ tránh được sự nhầm lẫn về nguồn gốc thực vật Bước đầu tiên trong việc đánh giá tính an toàn và hiệu quả của thảo dược là việc xác nhận tên thảo dược Các thông tin yêu cầu cần thiết là tên Latin, tên đồng nghĩa, tiếp đó là tên theo bản xứ của thảo mộc, những phần của thảo mộc được sử dụng như: gốc, rễ và lá hoặc các phần khác cũng cần được xác định

rõ Bước tiếp theo là ghi rõ các thông tin chỉ dẫn về điều kiện thu thập và môi trường nuôi dưỡng hoặc môi trường sinh sống của thảo mộc Trong cuốn hướng dẫn về quản lý chất lượng thảo dược của Tổ chức Y tế thế giới WHO

đã chỉ rõ các tiêu chí cần thiết

Quá trình chiết xuất mẫu (Etracting methods): Phương pháp chiết mẫu

và chuẩn bị mẫu góp phần quan trọng trong việc tạo ra các sắc ký fingerprint tốt từ thảo dược

Để có được những bản sắc ký fingerprint tốt, trên bản sắc ký đó hiển thị các thành phần chủ yếu của thảo dược phụ thuộc vào nhiều yếu tố Ví dụ như: Dung môi chiết, điều kiện tiến hành chiết mẫu, tỷ lệ hệ dung môi chiết mẫu, nhiệt độ tiến hành chiết mẫu, thiết bị sử dụng để chiết mẫu, điều kiện vận hành thiết bị chiết mẫu Quá trình chuẩn bị mẫu tốt sẽ làm giảm khả năng ảnh hưởng của nhiều thành phần đến kết quả phân tích Tùy theo từng thiết bị phân tích được lựa chọn (HPLC, CE, GC-MS, LC-MS) để tiến hành xây dựng các bước chuẩn bị mẫu khác nhau cho phù hợp với các thiết bị phân tích nêu trên Có nhiều mẫu phải tiến hành chiết theo phương pháp chiết lỏng-lỏng

(Liquid-Liquid extraction), có mẫu cần phải chiết theo phương pháp chiết pha rắn kết hợp với pha lỏng hoặc nguyên chiết pha rắn (Solid phase extraction)

Hình 1.6 : Sơ đồ lựa chọn hệ dung môi trong quá trình chiết mẫu

Để đưa ra được một phương pháp thảo dược tốt, người ta thường tiến hành thử chiết mẫu theo sơ đồ hình 1.6

Khảo sát hoạt tính sinh học của mẫu (Pharmacological activity): Công

việc này được thực hiện theo mục đích tiến hành đánh giá chất lượng dược

Mẫu thảo dược Mẫu thử

Lựa chọn dung môi Kết quả chiết

Xây dựng phương pháp

chiết

Chiết mẫu thử

Đánh giá kết quả

liệu của từng phòng nghiên cứu Các hoạt tính sinh học thường được xem xét như: hoạt tính kháng sinh, hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính ức chế sự phát triển xương… việc kiểm soát chất lượng cũng bao gồm cả việc xác định hoạt tính tự nhiên vốn có cũng như cả độc tính của chúng Việc xác định rõ ràng hoạt tính hoặc độc tính của thảo dược sẽ làm cho các sản phẩm có giá trị cao hơn trong những ứng dụng dược phẩm và thực phẩm Trong rất nhiều trường hợp, các loại thuốc trong y học cổ truyền được tạo ra từ một hoặc rất nhiều loại thảo dược Trong các loại thảo dược đó,

có loài có độc tính rất cao, có loài không thể hiện hoạt tính Ngay cả với những loài có độc tính khi sử dụng các loài đó với các liệu pháp phù hợp thì thành phần độc tính trong thảo dược không những không gây độc mà còn đóng vai trò tốt trong liệu pháp chữa bệnh Chính vì vậy, việc đánh giá và lựa chọn được liều lượng phù hợp cho các thành phần đó cũng là một trong những tiêu chí trong quản lý chất lượng dược liệu

Lựa chọn thiết bị phân tích (Measurement íntruments): Trong các

phương pháp đánh giá chất lượng dược liệu, các phương tiện phân tích đóng vai trò quan trọng Bởi vì việc lựa chọn và sử dụng các phương tiện phân tích phù hợp với đối tượng nghiên cứu sẽ mang lại hiệu quả cao trong quá trình đánh giá chất lượng dược liệu

Sau đây là một số thiết bị và công cụ nghiên cứu đang được sử dụng trong việc đánh giá chất lượng dược liệu:

Sắc ký lớp mỏng (TLC): Trước khi có sự ra đời của các thiết bị phân

tích hiện đại như sắc ký khí GC và sắc ký lỏng cao áp HPLC, sắc ký lớp mỏng được sử dụng nhiều trong phân tích thảo dược Sắc ký lớp mỏng có rất nhiều tiện lợi trong việc xây dựng sắc ký fingerprint của thảo dược, phương pháp thực hiện đơn giản, không yêu cầu tiêu chuẩn kỹ thuật cao, linh hoạt, tốc

độ phân tích nhanh, độ nhạy đáng tin cậy và việc chuẩn bị mẫu đơn giản, dễ

thực hiện trong mọi điều kiện Tuy nhiên, một vấn đề gặp phải khi sử dụng sắc ký lớp mỏng TLC để đánh giá dược liệu đó là trong mẫu thảo dược thường có nhiều thành phần, các thành phần này có mức độ phức tạp cao, dễ phân hủy và bay hơi, có nhiều thành phần chồng chéo và ở lượng rất nhỏ thì phương pháp sắc ký lớp mỏng gặp nhiều khó khăn Hơn thế, dữ liệu của sắc

ký lớp mỏng là dữ liệu một chiều không thỏa mãn được yêu cầu của phân tích

dữ liệu trong điều kiện hiện nay Thêm vào đó, việc chuyển dữ liệu để có thể ứng dụng các phương pháp hóa thống kê để tiến hành xử lý số liệu gặp nhiều khó khăn, đôi khi không thể thực hiện được việc chuyển đổi để xử lý số liệu thu được

Sắc ký khí (GC): Trong thảo dược cũng tồn tại nhiều thành phần, trong

đó có thành phần rất dễ bay hơi Các thành phần rất dễ bay hơi này có những đặc tính riêng biệt của từng loài thảo dược, chính những tính riêng biệt này tạo ưu thế cho việc xây dựng sắc ký fingerprint của các thảo dược theo phương pháp sắc ký khí Một ví dụ điển hình của việc áp dụng sắc ký fingerprint trên sắc ký khí là phân tích các dạng dầu béo trên hệ sắc ký khí Kết quả phân tích này cũng cho ra một dạng thích hợp sắc ký fingerprint, dạng fingerprint này có thể được sử dụng để nhận dạng thảo dược Thành phần và các mối liên hệ của các hợp chất hữu cơ có trong dầu béo chứa đựng những thành phần đặc biệt của thảo dược và một phần tạp chất trong dầu béo

có thể được xác định Phân tích bằng GC cũng thu được sự chính xác và độ nhạy cao cho các thành phần hóa học dễ bay hơi Tuy nhiên, phương pháp phân tích này cũng gặp khó khăn khi các mẫu thảo dược ở dạng phân cực và không phải là thành phần dễ bay hơi

Sắc ký lỏng cao áp (HPLC): phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

là một công cụ phân tích khá nổi tiếng, công cụ này được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm Lợi thế của việc sử dụng công cụ HPLC trong việc

phân tích các thảo dược bởi vì các thiết bị này rất dễ sử dụng và không bị hạn chế bởi các thành phần bay hơi hay không bay hơi cũng như độ bền, độ phân cực của mẫu nghiên cứu Thông thường hệ HPLC thường được sử dụng để phân tích hầu hết các hợp chất có mặt trong thảo dược Các hợp chất có khả

năng hấp thụ quang (chromophic) thì dùng đầu dò UV-Vis hoặc đầu dò hấp

phụ quang Fluorescene detector, đối với các hợp chất không có khả năng hấp

thụ quang (non-chromophoric) thì dùng đầu dò tán xạ ánh sáng ELSD (evaporative light scattering detector) Các kỹ thuật này rất thích hợp cho

việc xây dựng các sắc ký fingerprint và xử ký, chuyển đổi dữ liệu theo các phương pháp thống kê đa biến, kết quả thu được tin cậy và đạt chuẩn mực

Phương pháp sắc ký điện di (CE): Sắc ký điện di hứa hẹn một tiềm

năng trong việc tách và phân tích các thành phần hoạt tính trong thảo dược Một ưu điểm của phương pháp này là chỉ cần một lượng rất nhỏ mẫu hoặc chất chuẩn, đồng thời phương pháp này đạt tốc độ phân tích rất nhanh và cho khả năng phân tách tốt Phương pháp xây dựng sắc ký fingerprint trên nền tảng của thiết bị này cũng mang lại kết quả cao bởi vì phần lớn các ứng dụng của sắc ký điện di tương tự như các ứng dụng trong HPLC Một phần không tiện lợi của phương pháp này là kết quả phân tích vẫn bị ảnh hưởng nhiều bởi một số thành phần nhân tạo hoặc là do việc lựa chọn các dung dịch đệm gây

ra

Các phương pháp phân tích trên thiết bị kết hợp: Trong khi các kết quả

phân tích bằng các phương pháp sắc ký thông thường bị hạn chế hoặc không thể thực hiện do nhiều yếu tố tự nhiên hoặc nhân tạo mang lại thì kỹ thuật sắc

ký kết hợp như: HPLC-MS, HPLC-NMR, CE-MS, GC-MS… mang lại hiệu quả cao trong kỹ thuật phân tích Trong nhiều năm gần đây, việc kết hợp giữa

hệ thống sắc ký trực tiếp với các hệ khối phổ đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm bởi các ứng dụng trong việc xác định và khẳng định sự có

mặt của các hợp chất đã biết cũng như một số hợp chất chưa biết cấu trúc trong thảo dược Hơn thế, dữ liệu phân tích thu được từ hệ thống kết hợp này

là dữ liệu hai chiều, dữ liệu này khác hẳn các dữ liệu một chiều thu nhận từ các hệ thống đơn lẻ, dữ liệu hai chiều có thể cung cấp nhiều thông tin hơn, đồng thời dữ liệu hai chiều này cũng được sử dụng nhiều trong phân tích dữ

liệu đa chiều bằng phương pháp hóa thống kê (Chemometric)

Hệ kết hợp sắc ký khí và khối phổ GC-MS: Hệ khối phổ là hệ có độ nhạy cao, được sử dụng để phân tích khối lượng Thông tin mang lại là khối lượng phân tử cũng như các thông tin có liên quan đến cấu trúc của phân tử Khi kết hợp giữa sắc ký khí và khối phổ sẽ đạt được những tiện lợi rất cao trong xây dựng sắc ký fingerprint GC-MS đã được ứng dụng rộng rãi trong việc phân tích tinh dầu có mặt trong thảo dược Với GC-MS người ta có thể xây dựng không chỉ bản sắc ký fingerprint của tinh dầu với khả năng tách tốt

mà còn có những thông tin liên quan đến định tính và định lượng các thành phần có mặt trên bản sắc ký fingerprint, những thông tin này rất hữu ích trong các nghiên cứu đánh giá mối tương quan giữa thành phần hóa học và hoạt tính của thảo dược

Hệ sắc ký lỏng kết nối đầu dò DAD hoặc ELSD, hệ sắc ký lỏng kết nối khối phổ (HPLC-MS) và hệ sắc ký lỏng kết nối thiết bị NMR (HPLC-NMR): HPLC-DAD đã trở nên rất quen thuộc trong các phòng thí nghiệm trên thế giới Với những thông tin thu nhận được từ đầu dò DAD hoặc ELSD, việc phân tích định lượng hoặc định tính các thành phần có khả năng hấp thụ quang hoặc không có khả năng hấp thụ quang từ thảo dược trở nên dễ dàng hơn trước đây Đặc biệt, với sự kết hợp với sắc ký lỏng và khối phổ, hoặc NMR…đã mở ra những hướng đi mới trong phân tích Hơn thế, kết hợp các

kỹ thuật HPLC-DAD-MS mang lại khả năng phân tích cao, thông tin nhiều chiều (thông tin từ đầu dò DAD hoặc ELSD và thông tin từ MS hoặc NMR)

Những thông tin từ DAD hoặc ELSD và MS hoặc NMR có thể cung cấp trực tiếp dữ liệu về UV-Vis hoặc MS cho từng giá trị peak riêng lẻ trong một sắc

ký đồ Với sự trợ giúp của hệ thống kết hợp này, các peak trên sắc đồ có thể được so sánh trực tiếp với số liệu trong các thư viện online ACD hoặc CAMAG, với các hợp chất chuẩn để xác định chính xác cấu trúc, thành phần của hợp chất

Hệ kết hợp giữa sắc ký điện di và các detector khác CE-DAD, CE-MS

và CE-NMR…cũng mang lại các ưu điểm tương tự như với các hệ thống kết hợp trên

Các điều kiện phân tích mẫu (Measurement conditions): Việc tìm điều

kiện tối ưu cho các thông số cho quá trình tạo sắc ký fingerprint là nhiệm vụ quan trọng Tuy nhiên, xác định được thông số có ảnh hưởng đến thí nghiệm

là một nhiệm vụ khó khăn, nhất là đối với các hệ thống như:TLC, sắc ký khí, sắc ký khí kết nối khối phổ, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ…Trong hệ thống này có rất nhiều thông số có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm, thay đổi giá trị của một thông số đồng nghĩa với việc tiến hành lại thí nghiệm với thông số đã thay đổi Mỗi hệ thống có một thông số

kỹ thuật riêng, việc lựa chọn và thay đổi các thông số kỹ thuật sẽ làm thay đổi

cả quá trình tạo fingerprint Đối với hệ thống kết hợp, ví dụ như sắc ký lỏng kết nối khối phổ là hệ thống có rất nhiều thông số Thông thường, người ta không tiến hành việc tìm điều kiện tối ưu đồng thời cho cả hệ thống sắc ký lỏng cao áp và khối phổ Bởi vì tổ hợp của các thông số của sắc ký lỏng và khối phổ sẽ làm cho số thí nghiệm gia tăng và rất khó khăn trong việc tìm điều kiện tối ưu nhất Thay vào việc tìm kiếm đồng thời, người ta tiến hành tìm điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc lý lỏng cao áp trước, sau đó sẽ áp dụng điều kiện tối ưu của hệ thống sắc ký lỏng cao áp vào để tìm kiếm điều kiện tối

ưu cho khối phổ

gian thu mẫu, tên khoa

học… Các thông tin của sản phẩm: Thành phần,

công dụng…

Chiết mẫu Khảo sát hoạt tính

Lựa chọn công

cụ tạo fingerprint

Bước lựa chọn

Thiết bị phân tích

TLC TLC TLC TLC

GC TLC TLC TLC

HPL

CC TLC TLC TLC

CE TLC TLC TLC GC-MS HPLC- DAD/MS HPLC/MS/NM

R CE-DAD/MS

Bước đánh giá

Chemometri

cs

PLS PLS PCA HCA

UVE-1.5 Hệ thống phân tích HPLC

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

1.5.1 Nguyên lý

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phát triển rất nhanh từ cuối những năm 1960 Việc sử dụng các chất nhồi có kích thước nhỏ (5-10m) làm cho hiệu quả tách của phương pháp này tốt hơn so với phương pháp lỏng cổ điển

Có thể nói một cách đơn giản HPLC là một sắc ký cột (column chromatography) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký Với những tiến bộ kỷ thuật về cột, detector đã chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh

và hiệu suất cao Loại này cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lương vài mililit/phút qua cột tách Lượng mẫu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20l

Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh,