Nghiên cứu, xác định hàm lượng vitamin D trong nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Từ những kết quả nghiên cứu về vitamin D nói chung và vitamin D2 trongnấm nói riêng cũng như trên điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, với mongmuốn xây dựng một phương pháp phân tích

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

VÕ QUỐC OAI

1 NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN

D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Mai Thị Thanh Huyền

Đặc biệt tác giả gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới

TS Mai Thị Thanh Huyền đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ

với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong suốt quá trình triểnkhai, nghiên cứu và hoàn thành đề tài

Tác giả rất mong nhận được sự đóng góp, phê bình củaquý thầy cô, các nhà khoa học, đọc giả và các bạn đồng nghiệp

MỤC LỤC

Hệ thống các kí hiệu viết tắt 4

1.1 Vitamin D 7

1.1.1 Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi 7 1.1.2 Vai trò của vitamin D đối với cơ thể 8 1.1.3 Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể 10 1.2 Các phương pháp xác định vitamin D 12

1.2.1 Phương pháp thử nghiệm sinh học [28], [34] 12 1.2.2 Phương pháp quang phổ 13 1.2.3 Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch 14 1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 17 1.3 Tổng quan nghiên cứu xác định vitamin D trong nấm 20

1.4 Đánh giá, lựa chọn phương pháp 25

1.5 Sơ lược về lý thuyết HPLC 26

1.5.1 Giới thiệu 26 1.5.2 Cơ chế của quá trình tách trong HPLC 28 1.5.3 Nguyên lý hoạt động của hệ thống HPLC 28 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 30 2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 30

2.1.1 Hóa chất 30 2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 30 2.2 Thu thập và bảo quản mẫu 31

2.3 Xử lý mẫu 32

2.4 Chuẩn bị dung dịch vitamin D2 cho phép đo HPLC 33

2.5 Lựa chọn và cài đặt, vận hành thiết bị HPLC 34

2.6 Chuẩn bị máy trước khi tiến hành phân tích 34

2.7 Khảo sát phổ hấp thụ tia UV của vitamin D2 trong dung dịch 35

2.7.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần pha động 35

2.7.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ 35

2.8 Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng vitamin D trong dung dịch 352.9 Phương pháp khảo sát đánh giá 352.9.1 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn định lượng của phương pháp 352.9.2 Khảo sát độ lặp lại 36

2.9.3 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) củaphương pháp 37

2.9.4 Xác định hiệu suất thu hồi 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Khảo sát phương pháp đo 383.1.1 Khảo sát phổ hấp thụ tia UV của vitamin D2 trong dung dịch 38

3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần pha động 38

3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ dòng 40

3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ 41

3.1.5 Kết quả khảo sát phương pháp đo 42

3.2 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin D2 423.3 Khảo sát độ lặp lại của máy 483.4 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp 503.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 50

3.4.2 Giới hạn định lượng(LOQ) 50

3.5 Xác định độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) của phépphân tích vitamin D2 trên mẫu nấm 513.6 Xác định hiệu xuất thu hồi 52

3.7 Kết quả phân tích một số mẫu nấm 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

Hệ thống các kí hiệu viết tắt

25(OH)D : 25-hydroxyl vitamin D

25(OH)D2 : 25-hydroxyl vitamin D2

25(OH)D3 : 25-hydroxyl vitamin D3

BHT : butylate hydroxytoluen

BSTFA :N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide

DM : Chất khô (dry matter)

ECLIA : Phân tích miễn dịch quang hóa

(electro chemiluminescence immunoassay )

EtOH : Etanol

FTIR : Phép phân tích Fourier hồng ngoại (Fouriertransform infrared)

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IT : Bẫy ion ( Ion trap)

IS :Chất nội chuẩn (internal standard)

LC : Sắc kí lỏng (Liquid chromatography)

MeOH : Metanol

MS : Phổ khối (Mass spectrometry)

MTBE : Methyl-tert-butyl ether

PFP : Pentafluorophenyl-propyl

RIA : phân tích miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay)SPE : chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

UPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao

UV : Tia tử ngoại

DAD : Đầu dò mảng diot

RMSE : Độ lệch khởi động (root mean square error).

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài.

Vitamin D hay còn gọi là vitamin mặt trời là một loại vitamin khá đặc biệt

so với những loại khác Vitamin D có vai trò quan trọng với đời sống của conngười, như nó đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hoàn thiện, duy trì sựổn định của xương, răng, nó tham gia vào điều hòa chức năng của một số gen,ngoài ra còn tham gia một số chức năng như: bài tiết của insulin, hormon cậngiáp, hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới Một số nghiên cứumới cho thấy thiếu vitamin D, thai phụ có thể sinh con nhẹ cân, cùng sự tăngtrưởng chậm của trẻ chào đời đủ tháng [14],[22] Tình trạng thiếu vitamin Dtrên thế giới cũng như các nước nhiệt đới rất nghiêm trọng [24] Theo một sốnghiên cứu tình hình thiếu vitamin D trên thế giới là 40-50%, ở Thái lan vàMalayxia 50%, Nhật và Hàn Quốc 80-90%, nước bắc Âu và bắc Mỹ khoảng50-70% và 63% ở phụ nữ châu Á Ở Việt Nam, theo một số nghiên cứu mớinhất về tình trạng thiếu dinh dưỡng của học sinh tiểu học thì hơn 50% học sinhtiểu học thiếu hụt vitamin D

Để nhận đủ vitamin D thì ngoài việc cho cơ thể tiếp xúc với ánh nắng cólợi cho cơ thể thường xuyên thì cần thiết phải bổ sung thêm nguồn vitamin D

từ nguồn thực phẩm ăn uống hàng ngày Nấm là là một trong những nguồnthực phẩm giàu vitamin D2 và dinh dưỡng có vai trò quan trọng trong xây dựngkhẩu phần vitamin D2 hàng ngày Tuy nhiên nguồn nấm trên thị trường rất đadạng về chủng loại và nguồn gốc, nhiều loại nấm không rõ nguồn gốc, khôngđảm bảo chất lượng tràn lan trên thị trường Hơn nữa những đánh giá về giá trịdinh dưỡng chung cũng như hàm lượng vitamin D của các loại nấm trên địabàn Nghệ An, Hà Tĩnh đang còn hạn chế

Vì vậy việc phân tích hàm lượng vitamin D2 trong nấm là cần thiết, vừa đểxây dựng một quy trình định lượng chúng trong nấm, vừa để góp phần đánh giáhàm lượng vitamin D2 có trong nấm góp phần xây dựng bảng thành phần dinhdưỡng thực phẩm địa phương

Có nhiều phương pháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin D trong thựcphẩm, trong đó phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép phân tích với

độ nhạy và độ chọn lọc cao

Từ những kết quả nghiên cứu về vitamin D nói chung và vitamin D2 trongnấm nói riêng cũng như trên điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, với mongmuốn xây dựng một phương pháp phân tích phù hợp và quy trình xử lý mẫuhiệu quả trên đối tượng nấm để phân tích vitamin D tôi đã chọn đề tài

“ NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)”.

2 Mục đích nghiên cứu.

Xây dựng quy trình phân tích vitamin D2 bằng phương pháp sắc ký lỏnghiệu năng cao HPLC, từ đó xác định hàm lượng của chúng trong một số mẫunấm

3 Mục tiêu nghiên cứu

+ Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội tụ,

độ nhạy cao, xác định được LOD và LOQ của phương pháp

+ Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin D2 trongmột số loại nấm trước và sau khi chiếu xạ bằng tia UV

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các mẫu nấm được thu thập ở các chợ trên địa bàn thành phố Vinh, HàTĩnh và một số loại nấm tự nhiên ở vườn quốc gia Pù Mát

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

2 Vitamin D.

2.1 Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi

Vitamin là nhóm chất cần thiết cho hoạt động sống của bất kỳ cơ thể nào

và chúng có khả năng ở nồng độ thấp hoàn thành chức năng xúc tác ở cơ thểsinh vật Vitamin D được xếp trong nhóm vitamin hòa tan trong dầu béo cùngvới vitamin A, vitamin E, vitamin K Vitamin D được phát hiện năm 1922được phân lập năm 1932 tìm ra cấu trúc năm 1936 đến năm 1959 được tổnghợp nhân tạo [11]

Thuật ngữ vitamin D dùng để chỉ một nhóm các hợp chất sterol có cấutrúc tương tự nhau, có hoạt tính phòng ngừa hoặc điều trị còi xương nhờ làmtăng khả năng hấp thu canxi và photphat ở đường ruột Các hợp chất đó baogồm: vitamin D2 (ergocalciferol), vitamin D3 (cholecalciferol), và các vitamin

D4, D5, D6, D7 Cấu trúc của các dạng vitamin được trình bày trong hình 1.1.Đối với người các hợp chất quan trọng nhất trong nhóm vitamin D làvitamin D3 và vitamin D2 được đưa vào cơ thể qua đường tiêu hóa và các biệnpháp y tế khác Cơ thể cũng có thể tổng hợp vitamin D ở da từ cholesterol, khi

da được tiếp xúc với tia UV (có trong ánh nắng mặt trời) vì thế nó còn đượcmệnh danh là "vitamin ánh nắng" [18]

Mặc dù vitamin D thường được gọi là một vitamin, nhưng theo nghĩa hẹpthì nó không phải là một vitamin thiết yếu trong chế độ ăn, bởi vì hầu hết độngvật có vú trong tự nhiên đều có thể tự tổng hợp đủ cho cơ thể khi tiếp xúc hợp

lý với tia nắng mặt trời

Hình 1.1 Khái quát về cấu trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D

2.2 Vai trò của vitamin D đối với cơ thể

Vitamin D đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của xương Vitamin

D có vai trò quan trọng với sự hấp thụ canxi ở ruột mà canxi rất cần thiết chohoạt động của tim, cơ bắp và thần kinh, là thành phần chủ yếu cấu tạo nênxương và răng, đồng thời cũng không thể thiếu để tham gia vào quá trình đôngmáu Trẻ em khi thiếu canxi sẽ chậm lớn, lùn, còi xương, xương biến dạng,răng không đều, răng dị hình, chất lượng răng kém và bị sâu [15], [21] Ngườilớn thiếu vitamin D có thể dẫn đến bệnh loãng xương [21]

Một lượng nhỏ vitamin D mỗi ngày làm giảm nguy cơ mắc bệnh cao huyết áp, vitamin D giúp làm tăng khả năng miễn dịch, ngừa một số bệnh ung thư phổ biến, làm chậm quá trình phát triển ung thư đặc biệt là ung thư gan, ung thư đại trực tràng [10], [12], [19].

Thiếu vitamin D trong thai kì có thể sinh con nhẹ cân, đặc biệt nếu thiếuvitamin D trong 3 tháng đầu thai kì, con sinh ra bị hạn chế tăng trưởng gấp đôi,

sự thiếu vitamin D trong thai kì gây ra những tổn thương não không thể phụchồi [30] Trẻ em nếu không được cung cấp đủ vitamin D sẽ ảnh hưởng đến sựphát triển của xương, do chất xương và sụn không được vôi hóa đầy đủ, sụnphát triển không bình thường, làm xương biến dạng [30] Các triệu chứng chobiết trẻ thiếu vitamin D: Thần kinh bị kích thích (quấy khóc, ngủ không yêngiấc, hay giật mình, nhất là trẻ dưới 3 tháng), hay đổ mồ hôi trộm cả lúc trờilạnh, co giật khi sốt cao, có thể có cơn khó thở với tiếng thở rít Nặng hơn nữa,trẻ sẽ yếu cơ và có sự biến đổi ở xương đầu, lồng ngực, tay, chân, cơ - dâychằng và cột sống Nếu thiếu vitamin D trẻ em sẽ bị còi xương; trẻ bị còixương sẽ ảnh hưởng đến phát triển chiều cao và tầm vóc của trẻ sau này [10],[12], [15], [21]

Vitamin D cũng có ảnh hưởng đến nồng độ serotonin trong não, gây ảnhhưởng đến tâm trạng con người Serotonin còn có tên gọi là hoóc môn hạnhphúc, suy giảm serotonin khiến tâm trạng buồn chán hoặc dễ cáu giận, khôngthể kiểm soát được cơn bốc đồng, do đó thiếu vitamin D kéo dài dễ dẫn tớitrầm cảm[40] Do ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, chúng ta dễ bị thiếu hụtvitamin quan trọng này, dù có ăn chế độ lành mạnh và tập thể dục đều đặn[11] , [12]

Thiếu vitamin D là bệnh đặc hữu dành cho người lớn Một số lượng lớncác trẻ em và thanh thiếu niên khỏe mạnh cũng thiếu hụt vitamin D [20], [36].Một nghiên cứu dựa trên dân số của 2.972 phụ nữ độ tuổi sinh đẻ Mỹ tìm thấy42% phụ nữ Mỹ gốc Phi ở Mỹ có mức 25(OH)D < 15 ng/ml và 12% có mức

<10ng/ml (1 ng/ml tương đương với 2,5 nmol/l) [30]

Theo các nghiên cứu cho thấy hàm lượng lý tưởng 25(OH)D trong máucần thiết để ngăn ngừa bệnh còi xương và loãng xương là 15 ng/ml,mức cầnthiết để tối ưu hóa sự hấp thu canxi ở ruột là 34 ng/ml Gần đây đã phát hiện rarằng hàm lượng trung bình 29-38 ng/ml có thể ảnh hưởng đến việc giảm đáng

kể tỷ lệ mắc bệnh ung thư nội tạng và trên 33ng/ml sẽ giảm 50% nguy cơ ungthư đại tràng và ở mức độ 52 ng/ml làm giảm 50% nguy cơ ung thư vú [11],[12]

2.3 Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể

Cơ thể người có thể nhận được vitamin D trong 3 cách: qua da, chế độ ănuống và bổ sung bằng thuốc

Có lẽ vì vitamin D mang nghĩa của từ 'vitamin', hầu hết mọi người hiểusai về nó cũng giống như các vitamin khác, có nghĩa là, họ có thể có đượclượng đầy đủ bằng cách ăn một chế độ ăn uống tốt Tuy nhiên, hầu hết chế độ

ăn uống tự nhiên con người có chứa ít vitamin D, trừ khi những chế độ ăn giàunguồn gốc hoang dã, cá béo Một lượng nhỏ vitamin D có trong thực phẩmtăng cường, bổ sung như sữa, nước cam và các loại ngũ cốc tại Mỹ, và bơ thựcvật ở châu Âu, nhưng các nguồn cung như vậy thường là những nguồn đónggóp nhỏ cho nguồn vitamin D cơ thể Theo truyền thống, nguồn vitamin D conngười bắt đầu từ da, không phải bắt nguồn từ miệng [23], [30]

Sự tổng hợp vitamin D của da xảy rất nhanh chóng và mạnh mẽ, quá trìnhtổng hợp diễn ra dễ dàng chỉ sau một vài phút được tiếp xúc với ánh nắng mặttrời Tiếp xúc với ánh nắng mặt trời chứ không phải chế độ ăn uống là nguồncung cấp chính vitamin D cho cơ thể cho dự trữ và tuần hoàn, có thể xem đây

là một chức năng của phần bề mặt da hở [24] Nguồn cung cấp vitamin D qua

da giúp cung cấp 80-85% nhu cầu vitamin D của cơ thể Dưới tác dụng của tiacực tím các tiền chất vitamin D có ở tuyến bã và lớp Malpighi của biểu bì sẽđược chuyển thành vitamin D Nếu được phơi nắng đầy đủ, sau 3 giờ, 1cm2 da

có thể sản xuất ra 18UI vitamin D3 [11], [16], [18], [23], [24]

Ví dụ khi người có làn da được tắm nắng vào mùa hè ( toàn thân, liều tốithiểu UVB), mỗi cơ thể sản xuất ~ 20.000 IU vitamin D trong <30 phút [25]

Để đạt được điều này tương đương với con người sẽ phải uống 200 ly sữa (100IU/8 oz thủy tinh) hoặc dùng 50 viên vitamin tổng hợp tiêu chuẩn (400IU/viên) trong một lần

Nguồn cung cấp tự nhiên vitamin D khác là qua thức ăn vitamin D cótrong nguồn thực phẩm từ động vật (D3 )và thực vật (D2), có nhiều trong cácthực phẩm như dầu gan cá thu, dầu dừa, lòng đỏ trứng, sữa động vật [24]

Dữ liệu về thành phần thực phẩm hiện nay cho thấy nấm là một nguồncung cấp vitamin D tốt ngoài các nguồn từ động vật như trứng, sữa, thịt, cá Vitanmin D được bảo toàn tốt trong quá trình nấu ăn [29]

Các báo cáo về nấm của một số nước trên thế giới cho thấy hàm lượngvitamin D trong nấm tự nhiên ở trong khoảng 2 – 40 µg/100g, có thể đáp ứng

đủ nhu cầu vitamin D trong một ngày của cơ thể người và thay thế nguồnvitamin D từ các sản phẩm từ động vật, đặc biệt đối với người ăn chay [39].Khi bổ sung vitamin D cho cơ thể cũng nên phối hợp bổ sung canxi cho

cơ thể để tăng hiệu quả sử dụng với cơ thể [10], [12], [31]

Lượng vitamin D cơ thể cần mỗi ngày phụ thuộc vào tuổi của mỗi người.Trung bình lượng khuyến cáo hàng ngày từ tổ chức Food and Nutrition Boardcho các lứa tuổi khác nhau được liệt kê dưới đây đơn vị quốc tế (IU) bảng 1.1.

Bảng 1.1 Nhu cầu vitamin D mỗi ngày của các lứa tuổi [17]

Stt Lứa tuổi Liều lượng (IU)

Khuyến cáo-tối đa

Liều lượng (µg) Khuyến cáo-tối đa

3 Các phương pháp xác định vitamin D

3.1 Phương pháp thử nghiệm sinh học [28], [34]

Phương pháp chính thức đầu tiên để xác định vitamin D là phương phápthử nghiệm sinh học, trong đó hoạt tính sinh học của vitamin D được xác địnhbằng khả năng của nó ngăn ngừa hoặc cải thiện các triệu chứng thiếu hụtvitamin D trong cơ thể

Bằng cách đo khả năng hoạt động chống còi xương, ví dụ như thử nghiệmtrên loài chuột (kiểm tra điểm vôi hóa hoặc kiểm tra chữa bệnh còi xương) đã

từ lâu được sử dụng để xác định vitamin D trong thực phẩm hoặc các dượcphẩm

Chuột còi xương được cho ăn bằng thức ăn có chứa một lượng khác nhaucủa vitamin D đã được thiết lập theo các định mức tiêu chuẩn Sau bảy ngày,xương của những con chuột được xử lý bằng dung dịch nitrat bạc Lượng canximới được chuyển vào xương được biểu hiện thành vết tối trên ảnh chụp Thangtiêu chuẩn được thiết lập bằng cách xây dựng mối liên hệ giữa các vùng tối trênxương với lượng vitamin D trong chế độ ăn uống (cho gà con mới sinh thức ănbổ sung có chứa hàm lượng khác nhau của vitamin D) Hàm lượng vitamin Dtrong mẫu sau đó được xác định bằng cách so sánh với khu vực mờ tối của chấtchuẩn, từ đó xác định tỷ lệ tro xương sau ba tuần với mỗi chế độ ăn uống.Các thử nghiệm sinh học hấp thu canxi ở ruột khác bao gồm trên cơ thể vàtrong ống nghiệm cũng đã được nghiên cứu bằng cách điều tra khả năng củacác hợp chất thử nghiệm để kích thích sự hấp thu canxi ở ruột non Trong cácthử nghiệm, 45Ca2 + được sử dụng để gián tiếp định lượng hàm lượng vitamin D

Các sinh trắc nghiệm có thể phát hiện vitamin D ở nồng độ rất thấp Vídụ, kiểm tra trên dòng chuột có thể phát hiện hàm lượng thấp tới 12 ng vitamin

D Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp là không phân biệt giữa các dạngkhác nhau của vitamin D, đòi hỏi thời gian chuẩn bị lâu dài, độ tin cậy thấp sovới các phương pháp khác

3.2 Phương pháp quang phổ.

Phổ hồng ngoại đã được sử dụng để phân tích định lượng của vitamin D.Trong các pha rắn, vitamin D2 có thể được phân biệt với vitamin D3 dựa vàođỉnh phổ vitamin D2 tại 907 cm-1 [34]

Phổ FTIR đặc trưng của tinh thể vitamin D2 và D3 cũng đã được mô tả.Không có phương pháp luận được đưa ra trong quá trình định lượng vitamin Dbằng cách sử dụng phổ dao động Lý do có thể là do giới hạn phát hiện củaphương pháp này liên quan đến nồng độ vitamin D thường thấp trong thựcphẩm Vitamin D có thể được định lượng bằng cách đo sự hấp thụ tia cực tímtối đa ở 264 nm Hạn chế của phương pháp này là các hợp chất hấp thụ tia cựctím khác trong mẫu đo sẽ can thiệp vào kết quả định lượng vitamin D [34]

3.3 Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch

Phương pháp miễn dịch phóng xạ RIA (Radioimunoassay) do Yalow vàBerson (giải Nobel) đề xuất 1960 Phương pháp này có thể phát hiện vật chấthiện ở nồng độ < 0,001 μg/ml [44].g/ml [44]

Năm 2013 Wendy L Arneson và công sự đã đề cập đến các phương pháphiện tại được dùng rộng rãi để đánh giá hàm lượng vitamin D trong lâm sàngbằng cách đo lượng 25(OH)D và các dạng chuyển hóa hydroxyl vitamin Dkhác trong huyết thanh người [44] Trong bài báo này tác giả có đánh giá vềcác phương pháp thường dùng phổ biến nhất để định lượng vitamin D đó làphương pháp RIA, phương pháp LC-MS/MS và phương pháp HPLC Tác giả

đã mô tả khá đầy đủ về quy trình thực hiện phương pháp xét nghiệm miễn dịch

và nêu ra một số phương pháp xét nghiệm miễn dịch để định lượng vitamin Dđược FDA chấp thuận hiện có gồm phương pháp xét nghiệm miễn dịch quanghóa học (ECLIA), phương pháp RIA Quy trình thực hiện như sau: Bước thứnhất, 25(OH)D được tách ra từ dạng liên kết với protein và gắn vào kháng thểpha rắn đặc biệt, sau đó thêm vitamin D-isoluminol đánh dấu, thành phầnkhông liên kết được lấy ra bằng cách rửa sau đó thêm thuốc thử để xảy ra phảnứng quang hóa Tín hiệu ánh sáng được phát hiện có sự tỉ lệ nghịch với nồng

độ 25(OH)D

Phòng thí nghiệm Abbott cung cấp một cách hoàn thiện phương pháp trênnền tảng phân tích miễn dịch tự động xác định hàm lượng 25(OH)D – phươngpháp miễn dịch quang hoá học vi phân tử (CMIA) Phương pháp này đượcFDA chấp thuận năm 2011

Công ty Immuno Diagnostics cung cấp một phương pháp tự động phântích miễn dịch CMIA, IDS-ISYS, để định lượng hàm lượng tổng 25(OH)D vàdạng hydroxyl chuyển hóa khác của vitamin D trong huyết thanh hoặc huyếttương người Báo cáo cho thấy có mối quan hệ đặc biệt giữa 25(OH)D3 và D2

và độ nhạy của phương pháp là 5,5 ng/ml

Phương pháp quang hóa (ECL) được cấp bằng sáng chế bởi F

Hoffman-La Roche AG (Basel, Switzerland) được chào hàng thương mại phân tíchvitamin D Test có sẵn để sử dụng cho tất cả các nền tảng phân tích mô đunRoche cobas, nó đã được hiệu đính bởi FDA trong tháng 7/2012

Phương pháp miễn dịch enzyme cũng được sử dụng để phân tích vitamin

D Vitamin D cho liên kết với protein đồng nhất, từ đó đo lường hàm lượngthực tổng cộng 25(OH)D Các tổ hợp liên kết protein - vitamin D có thể nhậndiện vitamin D2 và D3 và cũng xác nhận hàm lượng tổng cộng 25-hydroxy Dmột cách chính xác

Một phương pháp xét nghiệm miễn dịch có sẵn trên nền tảng ADVIACentaur phát triển bởi nhà khoa học người Đức Siemens A.G Trong phươngpháp này, tổng số Vitamin D được phân tích bằng một phân tích miễn dịchcạnh tranh đồng nhất, trong đó các đơn vị bức xạ được phát hiện bằng một thiết

bị đầu cuối

Một công trình nghiên cứu của Lena Jafri và nhóm cộng sự [45] đã đánhgiá hiệu suất của các phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) với HPLC vàphương pháp miễn dịch quang hóa học (ECLIA) cho việc định lượng 25(OH)Dtrên đối tượng huyết thanh người Trong nghiên cứu này, đối với phương phápRIA: sử dụng một ống đếp phóng xạ gama đa năng Genesys được sử dụng đểghi lại sự phát xạ của các phân tử, phân tích 25(OH)D được thực hiện bằngcách sử dụng kit thương mại 25(OH)D 125I RIA Giới hạn phát hiện dưới củathử nghiệm là 1,5 ng/ml, giới hạn phát hiện trên là 100 ng/mL và CV củaphương pháp là 11% Đối với phương pháp HPLC sử dụng hệ thống HPLCPerkin Elmer series 200 để phân tích các 25(OH)D huyết thanh, với cột 5 μg/ml [44].mC-18 (4,6 ×150 mm, Supelco) và một đầu dò mảng diode 0,5 ml mẫu huyếtthanh được thêm vào 25 μg/ml [44].l etanol sau khi votex và ủ trong vòng mười phút ởnhiệt độ phòng thì thêm tiếp 500 μg/ml [44].L metanol, isopropanol (90:10, v/v) và tiếptục votex mười lăm giây Dịch thu được sau đó bổ sung 1,5 mL n-hexane vàtiếp tục votex trong sáu mươi giây và ly tâm trong ba phút Lớp hexane đượccho bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ Các mẫu được pha trong 100 mlmetanol và đem phân tích sử dụng cột C-18 (4,6 ×150 mm, supelco) tại tốc độdòng chảy 1,75 ml/phút với pha động Metanol-nước (85:15, v/v) bằng đầu dò

UV ở 265 nm Giới hạn phát hiện là 3 ng/ml trong khi khoảng tuyến tính tiêuchuẩn là 25-100 ng/ml Thời gian lưu cho 25(OH)D là 4,1 phút Với phươngpháp ECLIA sử dụng máy phân tích xét nghiệm miễn dịch Roche (RocheModular E170), bộ kit thương mại dựa trên phương pháp ECLIA từ Roche Giới hạn phát hiện dưới của thử nghiệm là 4,0 ng/ml, giới hạn phát hiện trên là

100 ng/mL và độ chính xác của thử nghiệm là CV = 9,9% Hàm lượng trungbình 25(OH)D với HPLC so với RIA là 50,1 nmol/L ( khoảng tuyến tính là17,7-199,4 nmol/L) và 51,1nmol/L (12,5-187,2nmol/L), trong khi nồng độ25(OH)D trung bình với RIA so với ECLIA là 32,4 nmol/L (9,98-199,7 nmol/

L) và 29,9 nmol/L (4,9-214,6 nmol/L) Dữ liệu so sánh cho HPLC so với RIAcho thấy RIA = -1,13 +1,01 (HPLC) (RMSE = 11,2 nmol/L) và cho RIA so vớiECLIA tiết lộ, ECLIA = 3,21 +0,9 (RIA) (RMSE = 9.6 nmol/L) Kết quả chothấy có mối tương quan có thể chấp nhận được giữa HPLC và RIA cũng nhưRIA và ECLIA trong định lượng 25(OH)D [45].

3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng rộng rãi

để xác định các vitamin tan trong chất béo từ giữa những năm 1970 và đã đượcthông qua như là phương pháp chính thức nhờ khả năng phát hiện, tính chọnlọc cao [16].Thiết bị sử dụng để phân tích vitamin D trong thực phẩm là máysắc ký lỏng cao áp sử dung hệ thống tách sắc ký ghép nối các đầu dò UV, đầu

dò mảng đi ốt (DAD) và đầu dò khối phổ (MS)

Hiệp hội hóa học phân tích tiêu chuẩn (AOAC) đã xác nhận các phươngpháp hóa học sau để phân tích vitamin D trong thực phẩm

Phương pháp AOAC 980.26: vitamin D trong các chế phẩm vitamin tổnghợp

Phương pháp AOAC 981.17: vitamin D trong sữa tăng cường và sữa bột.Phương pháp AOAC 982.29: vitamin D trong thực phẩm, các loại bột hỗnhợp và thức ăn chăn nuôi

Phương pháp AOAC 992.26: vitamin D3 trong sữa công thức pha sẵndành cho trẻ em

Phương pháp AOAC 995.05: vitamin D trong sữa công thức cho trẻ sơsinh và các sản phẩm đường ruột (cho ăn bằng ống).

Phương pháp AOAC 2002.05: Cholecalciferol (vitamin D3 ) trong thựcphẩm được lựa chọn (sữa tăng cường, sữa công thức cho trẻ sơ sinh, cháo, bơthực vật, dầu ăn và dầu cá)

Các phương pháp trên về nguyên tắc đều tương tự nhau, mỗi phương phápđều thông qua 4 giai đoạn chính:

+ Xà phòng hóa mẫu

+ Chiết mẫu để tách các vitamin D ra khỏi các nền mẫu thực phẩm

+ Làm sạch, tách các vitamin D khỏi các thành phần khác trong thựcphẩm

+ Định lượng bằng HPLC với đầu dò UV

Các phương pháp trên khác nhau bởi việc lựa chọn chất nội chuẩn, dungmôi chiết ( heptan, hexane, pentane hoặc ether dầu hỏa ), các phương pháplàm sạch (các cột nhôm, cyano, cột pha đảo hoặc silica, pha rắn ), sự lựa chọncủa cột phân tích (Partisil, pha đảo hoặc silic) và bước sóng UV để phát hiện(254 hoặc 265 nm.)

Phương pháp HPLC đầu tiên được giới thiệu để xác định vitamin D làphương pháp ngoại chuẩn [42], sau đó được giới thiệu phương pháp nội chuẩn[26] Tuy nhiên những nghiên cứu này chỉ xác định được vitamin D3 vàvitamin D2 mà không bao gồm dạng chuyển hóa 25(OH)D Một phương phápHPLC để xác định 25(OH)D trong thịt được mô tả bởi Koshy and VanDerSlik(1977), tuy nhiên, không đồng thời xác định D3 [33] Một phương pháp HPLChai chiều đã được sử dụng để xác định đồng thời vitamin D3 và 25(OH)D3 [27].Tuy nhiên phương pháp cho thấy giới hạn phát hiện khá cao, khoảng 0,2-1,0mg/100g

Tác giả Anders Staffas và cộng sự đã nghiên cứu xác định vitamin D 3

trong sữa bột, sữa công thức, dầu ăn, margarine và dầu cá bằng phương phápHPLC [13] Phương pháp phân tích dựa trên phương pháp đề xuất của AOAC2002.05 Mẫu phân tích được thêm chất nội chuẩn là vitamin D2 sau đó xàphòng hóa bằng KOH, etanol có bổ sung thêm chất chống oxi hóa butylatedhydroxytoluene (BHT) chiết mẫu thu được bằng cyclohexan và n-heptan (1:1)

và làm sạch bằng cột silica Dịch chiết được đem đo mẫu ở máy HPLC đầu dò

UV ở bước sóng 265 nm, cột cho phân tích định lượng LC-C18, 250x 4,6 mm,

dp = 5μg/ml [44].m (Vydac 201 TP 54, hoặc tương đương) với cột bảo vệ C18, 4.0x 4,0

mm, dp = 5 μg/ml [44].m (LiChroCART 4-4, hoặc tương đương) Pha động 1: 0.5%isopropanol và 2% methyl-tert-butyl ether (MTBE) trong cyclohexane:n-heptan; trộn 5ml isopropanol và 20 mL MTBE với 1L cyclohexane:n-heptan (1+1); pha động 2 : isopropanol+n-heptan (20+80) Pha loãng 200 ml isopropanolthành 1 lít với n-heptan; Pha động 3: Metanol+axetonitril (20 + 80) Pha loãng200ml metanol thành 1 lít với acetonitrile Hàm lượng vitamin D3 trong cácmẫu nghiên cứu từ 0,4 – 12 µg/100g Độ thu hồi từ các mẫu thêm chuẩnvitamin D3 thay đổi 93-102% Giá trị độ lặp lại độ lệch chuẩn tương đối (RSD)cho kết quả chấp nhận thay đổi từ 2,2% (dầu cá) và 7,4% (dầu ăn), trong khi táilặp độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giá trị thay đổi từ 6,8% (bơ thực vật) và24% (dầu ăn)[13]

Jette Jakobsen và cộng sự đã xác định hàm lượng tổng vitamin D trongthịt bao gồm vitamin D3 và 25-hydroxyvitamin D3, được định lượng bằngphương pháp HPLC sau khi thủy phân bằng kiềm, chiết pha rắn và bán chuẩn

bị HPLC [28] Một hệ thống bán chuẩn bị HPLC gồm bộ điều khiển 600 vàbơm, một máy làm lạnh 717PLUS tự động, và một detector hấp thụ 2487

Detector DAD được sử dụng ở khoảng 220-320 nm và việc định lượng đượchiện ở bước sóng 265 nm Vitamin D2 được sử dụng giống như chất nội chuẩnđối với vitamin D3 cũng như là đối với 25(OH)D3 Nghiên cứu này là mộtphương pháp phân tích có thể được sử dụng cho việc đánh giá các loại vitamin

D khác nhau, đóng góp thông tin mới vào bảng thành phần thực phẩm

Markus Herrmann và cộng sự đã phát triển một phương pháp phân tíchsắc ký lỏng khối phổ song song (LC-MS) [37] Thiết bị gồm hệ thống khối phổAPI 5000 kết hợp với một nguồn bức xạ ion hóa, tách sắc ký sử dụng cột sắc

ký pha đảo Supelco C8 (Supelcosil LC-8, 3.3cm x 3mm, kích thước hạt 3 μg/ml [44] m)cột bảo vệ C8 (4 ×2,0 mm) để định lượng 25(OH)D2 và 25(OH) D3 trong huyếtthanh [37] Phương pháp mới này được đánh giá kết quả cùng với hai phươngpháp sử dụng rộng rãi để xét nghiệm miễn dịch RIAvà ECLIA Kết quả chothấy phương pháp LC-MS định lượng chính xác 25(OH)D phù hợp với phépphân tích bằng RIA còn đối với phương pháp ECLIA thì cho thấy có sự sailệch

Một phương pháp định lượng đơn giản vitamin D được Lone Hymoller vàcộng sự công bố năm 2011 [35] Mẫu huyết tương hoặc huyết sau khi xà phònghóa và chiết xuất được tách bằng cột sắc ký lỏng pha đảo C30 (250mm × 4.6

mm ID) với cỡ hạt 5,0 μg/ml [44].m và cột bảo vệ C30 (10 mm × 4.0 mm ID) với cỡ hạt5,0 μg/ml [44].m Nhiệt độ cho cả hai cột là 500C, thể tích tiêm mẫu là 50 μg/ml [44].L.Chươngtrình gradient rửa giải được thực hiện tại tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút vớiMeOH (85%) và EtOH trong 55 phút Trong 12 phút đầu tiên 5% EtOH đượcbơm qua cột và sau đó là tỉ lệ EtOH được tăng lên đến 40% trong ba phút.Mười bảy phút sau đó số lượng EtOH được tăng lên đến 90% trong thời gian 3phút và được duy trì liên tục trong 10 phút để làm sạch các cột Gradient đượcđưa trở lại thiết lập ban đầu trong 5 phút và 5 phút sau đó các mẫu tiếp theo cóthể được tiêm Peak thu được nằm trong khoảng 25 phút đầu tiên Giới hạnphát hiện gấp ba lần so với tín hiệu nhiễu nền đã được xác định đến 0,14ng/mL huyết tương và giới hạn định lượng gấp mười lần tín hiệu nhiễu nền đến0,45 ng/mL huyết tương Phương pháp này được sử dụng để xác định thànhphần vitamin D và chất chuyển hóa của nó trong huyết tương của sáu loài khácnhau với: bò, lợn, gia cầm, chồn, ngựa, và con người Ở gia súc hiệu suất thuhôi đạt 86,6 và 101,0%, sai khác trong ngày từ 0,9 đến 5,9%, và sai khác giữacác ngày là 0,2 đến 1,7% Tuy nhiên, tùy thuộc vào loại và số lượng mẫu màphần tỉ lệ sai số là khác nhau

4 Tổng quan nghiên cứu xác định vitamin D trong nấm

Phần lớn các nghiên cứu trên thế giới trong thời gian về phân tích xác địnhhàm lượng vitamin D trong nấm sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năngcao Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hàm lượng vitamin D cao có trong nấmđược hình thành nhờ bức xạ mặt trời Chính vì vậy các hàm lượng trong nấmnuôi trồng thường thấp bởi đặc điểm của phương pháp nuôi cấy thường trongmôi trường thiếu ánh sáng

Viraj J Jasinghe và cộng sự đã đưa ra kết luận từ việc phơi nắng cho nấm

để tăng hàm lượng vitamin D [46] Nấm đông cô (Lentinula edodes), nấm Sò (Pleurotus ostreatus), nấm Mỡ (nấm nút) (Agaricus bisporus), và nấm Bào ngư (Pleurotus cystidus) được chiếu xạ 1 giờ với tia cực tím A (UVA; bước sóng

315-400 nm), tia cực tím B (UVB; bước sóng 290-315 nm), và tia cực tím-C(UVC; bước sóng 190-290 nm) Mẫu bột nấm khô đông lạnh (0,5g) được cânchính xác vào bình đáy tròn 250 ml và trộn với 4ml dung dịch natri ascorbate(17,5 g natri ascorbate trong 100 ml dung dịch NaOH 1M), 50 ml etanol (95%),

và 10 ml dung dịch kali hydroxit 50% Mẫu được xà phòng hóa trong điều kiệnđun hồi lưu ở 80 °C trong 1 giờ, sau đó nó đã nhanh chóng làm lạnh đến nhiệt

độ phòng và chuyển vào phễu tách Hỗn hợp này lần đầu tiên được chiết xuấtvới 15ml nước de-ion, sau đó là 15 ml etanol và sau đó chiết ba lần với n-pentan có thể tích lần lượt là 50, 50 và 20 ml Toàn bộ phần hữu cơ được rửa

ba lần với 50 ml dung dịch KOH 3% trong etanol 5% và sau đó rửa lần cuốivới nước de-ion cho đến khi trung hòa Các phần dịch chiết hữu cơ đượcchuyển vào bình đáy tròn, cô quay ở 40°C, và ngay lập tức tái hòa tan trong 5

ml etanol Sau đó mẫu được đi qua một bộ lọc 0,45 μg/ml [44].m 20 μg/ml [44].l của mẫu lọcđược tiêm vào hệ thống HPLC đầu dò UV và tách rửa nhờ cột C18 pha đảo vớipha động là ACN:MeOH (5:25) và tốc độ dòng chảy 2,3 ml/phút Quá trìnhchuyển đổi của ergosterol thành vitamin D2 dưới UVA, UVB và UVC đã có

sự khác biệt đáng kể Hàm lượng vitamin D2 cao nhất (184 ± 5.71 μg/ml [44].g/g DM)được quan sát thấy trong nấm Sò chiếu tia UVB ở nhiệt độ 35 0C và độ ẩmkhoảng 80% Mặt khác, theo cùng điều kiện chiếu xạ, nồng độ vitamin D2 thấpnhất (22,9 ± 2,68 μg/ml [44].g/g DM) đã được quan sát thấy trong nấm Mỡ Ngoài racường độ của bức xạ tia cực tím và liều chiếu xạ được áp dụng, cũng góp phầnvào sự chuyển đổi của ergosterol trong nấm thành vitamin D2 Ngay cả trongđiều kiện bình thường, 5 g nấm đông cô tươi được chiếu trong 15 phút với tia

UVA, hoặc UVB là thừa đủ để có được các liều cung cấp được đề nghị củavitamin D cho người lớn (10 μg/ml [44].g/ngày) [46].

Năm 2010 Sundar Rao Koyyalamudi và cộng sự đã công bố một côngtrình khoa học về nồng độ vitamin D2 trong nấm mỡ (Agaricus bisporus) sau

khi tiếp xúc với tia cực tím bằng hệ thống HPLC-MS sử dụng cột Gemini 5μg/ml [44].mC18 với pha động methanol:acetonitrile (25:75, v/v), tốc độ dòng 0.2 mL/min[41] Hàm lượng vitamin D2 trong nấm tăng tương ứng với số lượng các xungánh sáng tia cực tím Không có sự khác biệt thành phần vitamin D2 trong nấm

từ các giỏ 200 g và 500 g theo các xung ánh sáng Nấm lớp trên cùng có hàmlượng vitamin D2 cao hơn so với lớp dưới cùng của một giỏ, còn nấm thái lát(dày khoảng 5 mm) sau khi chiếu xạ có hàm lượng vitamin D2 cao hơn nấmthái lát thông thường Như vậy, sử dụng các xung cực tím cung cấp mộtphương pháp có hiệu quả cao để tăng nồng độ vitamin D2 trong nấm mỡ A.

Bisporus [41]

Katherine M Phillips và cộng sự đã xác định được vitamin D4 trong quátrình phân tích vitamin D2 trong sắc ký đồ HPLC-UV của nấm ăn [32] Cácsterol được xác định bằng sắc ký khí, phát hiện bằng phương pháp ion hóangọn lửa sau khi xà phòng hóa để thực hiện chiết lipid tổng, dùng sắc ký khíkhối phổ (GC-MS) để kiểm tra định tính lại thành phần vitamin D4 đã đượcđịnh lượng bằng HPLC với đầu dò UV sử dụng vitamin D3 làm chất nội chuẩn.Nấm portabella, nấm nút màu trắng, nấm crimini, nấm kim châm (Enoki), nấmĐông cô, nấm maitake, nấm hàu, nấm morel, nấm mào gà (Chanterelle), đượcchiếu xạ UV và phân tích Phân tích 4 thành phần vitamin D của mỗi mẫu trongtổng số 71 mẫu từ các nhà cung cấp bán lẻ và nhà sản xuất của Mỹ cho thấyvitamin D4 có mặt (>0.1 μg/ml [44].g/100 g) trong tổng số 18 mẫu tổng hợp và trong ítnhất một mẫu của từng loại nấm trừ nấm nút màu trắng Mức cao nhất trongcác mẫu sau khi tiếp xúc với tia UV là nấm portabella, nấm maitake (0,2-7,0

và 22,5-35,4 mg/100 g) Trong một mẫu nấm sò hàm lượng vitamin D4 đạthơn gấp đôi so với D2 (6,29 so với 2,59 mg/100 g) vitamin D4 vượt quá 2mg/100 g trong nấm morel và nấm mào gà, mẫu có chứa D4 nhưng không pháthiện được trong hai mẫu nấm morel Tiền vitamin D4 là 22,23-dihydroergosterol đã được tìm thấy trong tất cả các mẫu (4,49-16,5 mg/100 g)[32]

Năm 2013 Maximilian Wittig và cộng sự đã công bố một bài báo về

phương pháp phân tích vitamin D trong nấm sò (Pleurotus ostreatus) sau khi

xử lý bằng tia UVB [38] Thiết bị chủ yếu của phương pháp là một máy sắc ký(HPLC Agilent 1200 G1315) với đầu dò mảng diode (DAD) Sau 60 phútchiếu xạ 10 chất tham gia vào phản ứng quang hóa đã được tách ra, được xácđịnh bởi phổ DAD đặc trưng và phân biệt bởi trọng lượng phân tử của nó, cácchất vitamin D2, previtamin D2, tachysterol2, lumisterol2 và ergosterol, cùng vớimột số lượng nhỏ một loạt các chất có cấu trúc tương tự 22,23-dihydroergocalciferol (vitamin D4) đã được tìm thấy [38]

Cũng theo Maximilian Wittig quy trình xử lý mẫu cũng ảnh hưởng đếntổng sản lượng vitamin D cũng như tỷ lệ của tiền vitamin, vitamin D2 vàvitamin D4 Thủy phân bằng kiềm nóng có tác dụng phân hủy tốt nhất cấu trúccủa nấm và cho hiệu suất thu được vitamin D cao nhất (D2: 141,32 μg/ml [44].g/g DM,

D4: 22,72 μg/ml [44].g/g DM) Quy trình chuẩn bị mẫu như sau, bột mẫu nấm khô (5 g),

4 ml dung dịch natri ascorbate (17,5 g natri ascorbate trong 100 ml dung dịchnatri hydroxyd 1M), cho và bình bình đáy tròn màu hổ phách 250ml, trộn với

50 ml ethanol (95%), 10ml KOH 50%, và 100 μg/ml [44].g vitamin D3 ( hòa tan trong 1

ml methanol) Hỗn hợp được xà phòng hóa bằng cách đun hồi lưu 80 0C trong

1 giờ, và bình được lắc để đảm bảo hỗn hợp được xáo trộn tốt Trước khi đượcchuyển vào một phễu chiết, hỗn hợp được làm lạnh xuống nhiệt độ phòng vàpha loãng với 50 ml nước cất Sau đó chiết liên tục trong phễu chiết, đầu tiênvới 50 ml dietyl ete, sau đó với 10 ml etanol hoặc 50 ml n-pentane, với 50 mln-pentane, và cuối cùng với 20 ml n-pentane Phần dung môi được gộp chung,chiết ba lần với 50 ml 3% kali hydroxit trong 5% ethanol, và cuối cùng rửasạch bằng nước khử ion cho đến khi chất chiết đã được trung hòa Phần chiếtđược sấy khô qua đêm (natri sulfat khan) và các dung môi được loại bỏ bằngcách sử dụng một thiết bị cô quay chân không Phần dư được tái hòa tan trong1,5 ml methanol bằng siêu âm và được đem đi phân tích trên hệ thống HPLC,với đầu dò UV, hoặc hệ thống LC-MS Ngoài ra bài báo này cũng nhắc đếnphương pháp xà phòng hóa ở nhiệt độ lạnh (18-20 0C), và qúa trình triết đượclắc liên tục trong vòng 18giờ ở 200C Một phương pháp chiết khác cũng đượcgiới thiệu với sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm, hỗn hợp một mịn mẫu nấm, vớichất nội chuẩn được thêm vào và chiết 3 lần với n-pentan kết hợp siêu âm trong

10 phút Sau đó toàn bộ phần chiết được li tâm ở 40C trong 15phút Phần dịchlỏng thu được cho cô quay đến khô và sau đó quy trình được lặp lại như ở trên

để phân tích HPLC Kết quả thu được giới hạn phát hiện cho vitamin D2/4 là

0,02 μg/ml [44].g/g DM và ước tính cho previtamin D2/4 (0,06 μg/ml [44].g/g DM), tachysterol2/4

(0,02 μg/ml [44].g/g DM) và lumisterol2/4 (0,06 μg/ml [44].g/g DM) Độ thu hồi của vitamin D2 là97± 0,7% Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp công cụ phân tích, đánhgiá quá trình giải phóng vitamin D sau khi xử lý UVB để sản xuất nấm sò cóthành phần dinh dưỡng cân bằng của các hợp chất vitamin D [38]

Năm 2014 Ulrich Krings và cộng sự cũng đã công bố về đồ thị hàmlượng sterol và các axit béo sau khi xử lý UVB của nấm sò [43] Quả thể của

nấm sò (Pleurotus ostreatus) được chiếu UVB với tại 310-320 nm cường độ

11,5W/m2 cho 60 phút ở 20°C Vitamin D2 được hình thành ngay trong quảthể, trong cuống và trong phiến nấm Hàm lượng bão hòa trên 100 μg/ml [44].g/g chấtkhô đã đạt được sau 1 giờ Hàm lượng của các đồng phân lumisterol2,tachysterol2 và previtamin D2 cũng được tăng theo, vitamin D4 đạt nồng độ tối

đa khoảng 20 μg/ml [44].g/g chất khô Xử lý UVB nấm sò trước khi thái lát là nguồn bổsung được nhu cầu hàng tuần của vitamin D của người lớn Quá trình phân tíchđược thực hiện trên hệ thống LC-MS gồm 320-Triple Quad LC–MS2 (PaloAlto, CA, USA) và Varian Pro Star UV/vis detector (Palo Alto, CA, USA)[43]

Hình 1.2 Sự gia tăng hàm lượng vitamin D 2 trong nấm(FBb-quả thể được chiếu sáng từ phía dưới; FBs-quả thể thái lát; ST-cuống; FBt-quả thể chiếu sáng

từ phía trên) [43]

5 Đánh giá, lựa chọn phương pháp

Với sự phát triển trong suốt những thập niên qua về thiết bị và sự nhồi cột,sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nổi lên như một phương pháp được ưa thíchcho kỹ thuật tách và phân tích định lượng của rất nhiều loại mẫu

Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có thể dò tìm lượng mẫu nhỏ đến 200

pg Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như không giới hạn do HPLC đã trởthành một công cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghiệp

Khi được sử dụng như một công cụ phân tích, LC có thể xác định các cấu

tử trong một hỗn hợp và lượng của chúng trong mẫu Khi kết hợp với những kỹthuật phân tích khác thì có thể nhận diện định tính các cấu tử trong mẫu

Phương pháp HPLC sử dụng cột pha đảo và detector UV cho phép phântích đồng thời các chất với độ nhạy cao ở bước sóng tối ưu Phương pháp này

có thể sử dụng để phân tích thực phẩm và những mẫu sinh học [44]

Từ những kết quả nghiên cứu về vitamin D nói chung và vitamin D2 trongnấm nói riêng cũng như trên điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm chúng tôilựa chọn phương pháp HPLC làm phương pháp định lượng

6 Sơ lược về lý thuyết HPLC

Nghiên cứu kỹ thuật tách bằng LC là cần thiết vì nó sẽ tiếp tục đóng mộtvai trò quan trọng trong tất cả những lĩnh vực của phân tích hóa học, mặc dù cónhững tiến bộ hơn nữa trong các thuốc thử chọn lọc và những cải tiến trong các

kỹ thuật vật lí đo lường

Với sự phát triển trong suốt những thập niên qua về thiết bị và sự nhồi cột,sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nổi lên như một phương pháp được ưa thíchcho kỹ thuật tách và phân tích định lượng của rất nhiều loại mẫu

HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng vàpha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặcmột chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổibằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phân tích HPLC nhanh, hiệuquả và có thể dò tìm lượng mẫu nhỏ đến 200 pg Những cơ hội áp dụng HPLChầu như không giới hạn do HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếutrong khoa học và công nghiệp

Sắc kí lỏng dựa trên hiện tượng: dưới cùng một điều kiện, mỗi cấu tửtrong một hỗn hợp tương tác với môi trường xung quanh khác với tất cả cáccấu tử khác

Khi được sử dụng như một công cụ phân tích, LC có thể xác định các cấu

tử trong một hỗn hợp và lượng của chúng trong mẫu Khi kết hợp với những kỹthuật phân tích khác thì có thể nhận diện định tính các cấu tử trong mẫu

Phép tách được đòi hỏi khi:

 Một hỗn hợp quá phức tạp cho việc phân tích trực tiếp ví dụ đophổ

 Các chất phân tích rất giống nhau ví dụ các đồng phân

 Sự cần thiết phải điều chế một chất có độ tinh khiết cao

 Xác định lượng của của một chất nào đó

Sắc kí cột mở, sắc kí bản mỏng được sử dụng trong những trường hợptách tương đối đơn giản, còn HPLC là kỹ thuật tách những hỗn hợp phức tạp và

có khả năng tách với độ phân giải cao để giải quyết những vấn đề nhanh hơn vàtốt hơn

Trong HPLC nhiều thông số phải được xác định và thiết lập trước khimẫu được cho vào trong máy Vì thế để thành công với HPLC, cần thời gian đểthiết lập chế độ và điều kiện hoạt động thích hợp cho máy trong mỗi phép phântích

6.2 Cơ chế của quá trình tách trong HPLC

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký

và loạisắc ký

Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc phađảo

Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử

Trong đó chủ yếu hiện nay sử dụng sắc kí hấp phụ Quá trình sắc ký dựatrên sự hấp phụ mạnh, yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sựrửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột Sự tách mộthỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ Trong trườngloại này có hai loại hấp phụ :

Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP - HPLC): Pha tĩnh phân cực,pha độngkhông phân cực

Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC): Pha tĩnh không phân cực ,phađộng phân cực

Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp cácchất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếuhay trung bình như các vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau

Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký cột, hấp phụ pha đảo ( RP )

6.3 Nguyên lý hoạt động của hệ thống HPLC

Hỗn hợp cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp, tiêmmột thể tích chính xác vào bộ phận tiêm mẫu và được mang vào cột bởi mộtdòng chảy liên tục của cùng dung môi (pha động) trong đó mẫu được hòa tan

Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt xốp có diện tích bề mặt lớn(pha tĩnh) Các cấu tử trong mẫu liên tục tương tác với pha tĩnh Pha động (còngọi là chất rửa giải) được bơm qua cột được nhồi chặt các hạt sắc kí

Với việc chọn pha động và vật liệu nhồi cột thích hợp, các cấu tử trongmẫu sẽ di chuyển dọc trên cột với những tốc độ khác nhau dó đó các cấu tửđược phân tách thành các phân đoạn khác nhau dọc theo dòng chảy của cột Khi những cấu tử lần lượt thoát ra khỏi cột và đi vào detector thích hợp, ởđây tín hiệu được ghi lại, xử lí và chuyển ra ngoài một sắc kí đồ, cho biết sựhiện diện của mỗi cấu tử dưới dạng một Peak Khi đó lượng cấu tử có trongmẫu được tính toán dựa vào chiều cao hoặc diện tích của Peak của nó

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

7 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

7.1 Hóa chất

+ Metanol ( loại dùng cho HPLC của Merk)

+ n-hexan (loại dùng cho HPLC)

+ Dietyl ete(PA của Trung Quốc )

+ Chất chuẩn vitamin D2, D3 100mg của Supelco

+ Axetonitril (Loại dùng cho HPLC)

+ Etanol 960( Trung Quốc)

+ Axit ascobic (Merk)

+ KOH, NaOH (82%)

+ Nước cất đề ion

Tất cả các hóa chất còn lại đều thuộc loại tinh khiết phân tích

7.2 Thiết bị và dụng cụ

+ Hệ thống HPLC Agilent 1100 Series với đầu dò UV

+ Cột dùng cho phân tích LiChrospher®100 RP-18(5μg/ml [44].m) 250-4mmAgilent

+ Máy quang phổ UV – Vis: Agilent 8453

+ Máy cất quay chân không: IKA® RV10 digital

+ Máy siêu âm: Ultrasonic LC 60H

+ Máy nghiền thực phẩm, hệ thống đun hồi lưu

+ Máy Vortex IKA- made in USA

+ Đèn UVB Exo –Terra

+ Cân phân tích độ chính xác 10-5g

Dụng cụ: bình chiết 250ml, bình định mức (ml) 5; 10; 100 Pipet (ml) 1;2; 5; 10 Pipet tự động định mức(μg/ml [44].l) 100, 1000 Bình đáy tròn (ml) 250, 500.Bình tam giác và các dụng cụ thủy tinh khác.

8 Thu thập và bảo quản mẫu

Các mẫu nấm khô được thu thập từ rừng quốc gia Pù Mát Nấm sò đượcmua tại chợ Vườn Ươm-tp Hà Tĩnh có nguồn gốc sản xuất tại xã Thạch Đài,huyện Thạch Hà - tỉnh Hà Tĩnh Nấm Đông Cô được mua tại chợ tỉnh Hà Tĩnh

có nguồn gốc sản xuất từ huyện Đông Anh ngoại thành Hà Nội Nấm thủy tiênnâu, nấm kim châm được mua tại siêu thị Ocean mart Hà Tĩnh có xuất xứ NhậtBản và Trung Quốc Nấm sau khi thu hoạch được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C.Một số mẫu được chiếu xạ bằng đèn UVB

Hình 2.1.Hình ảnh một số mẫu nấm tươi