Nghiên cứu xác định hàm lượng Vitamin B1, B6 trong một số loại nấm lớn lấy từ vườn quốc gia Pù Mát Nghệ An bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Xuất phát từ chức năng của vitamin nói chung và vitamin B1, B6 nói riêng trong cơ thể, đồng thời góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng nấm dùng để làm dược liệu, chúng tôi chọn đề tài

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ NẤM LỚN 4

1.1.1 Giới thiệu về nấm 4

1.1.2 Phân loại và tác dụng trị liệu của nấm Linh Chi 6

1.1.3 Nấm lớn 8

1.1.4 Nấm Linh chi 9

1.1.5 Các mẫu nấm được nghiên cứu trong đề tài 10

1.2 GIỚI THIỆU VỀ VITAMIN B1, B6 11

1.2.1 Vitamin B1 11

1.2.2 Vitamin B6 13

1.2.3 Vai trò và nhu cầu của vitamin B1, B6 đối với cơ thể 14

1.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6 16

1.3.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp 16

1.3.2 Phân loại sắc ký và ứng dụng 17

1.3.3 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 19

1.3.4 Hệ thống HPLC 22

1.3.5 Chọn điều kiện sắc ký 25

1.3.6 Tiến hành đo sắc ký 28

1.3.7 Định lượng bằng phương pháp HPLC 29

CHƯƠNG 2 KĨ THUẬT THỰC NGHIỆM 37

2.1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 37

2.2 CHUẨN BỊ HÓA CHẤT 37

2.2.1 Yêu cầu chung 37

2.2.3 Chuẩn bị hóa chất cho phép xác định vitamin B6 38

2.3 LẤY MẪU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH 39

2.3.1 Lấy mẫu và baỏ quản mẫu 39

2.3.2 Chuẩn bị mẫu phân tích 39

2.4 CÁCH TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM 40

2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPLC với vitami B1 40

2.4.2 Xử lý mẫu nấm linh chi cho phép đo HPLC với vitamin B1 40

2.4.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPLC với vitamin B6 40

2 4.4 Xử lý mẫu nấm linh chi cho phép đo HPLC với vitamin B6 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 KHẢO SÁT CÁC THÔNG SỐ TỐI ƯU CHO PHÉP ĐO HPLC XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6 42

3.1.1 Khảo sát bước sóng 42

3.1.2 Khảo sát pha động 43

3.1.3 Khảo sát tốc độ dòng 45

3.2 KHẢO SÁT XÁC ĐỊNH KHOẢNG NỒNG ĐỘ TUYẾN TÍNH CỦA VITAMIN B1, VITAMIN B6 47

3.2.1 Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1 47

3.2.2 Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B6 48

3.3 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN, XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA VITAMIN B1, VITAMIN B6 49

3.3.1 Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của Vitamin B1 49

3.3.2 Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của Vitamin B6 51

CHUẨN VITAMIN B1, VITAMIN B6 54

3.5 ĐỘ LẶP LẠI TRÊN MẪU NẤM LINH CHI 57

3.6 HIỆU SUẤT THU HỒI VITAMIN TRONG CÁC MẪU NẤM 57

3.6.1 Hiệu suất thu hồi Vitamin B1 trong các mẫu nấm 58

3.6.2 Hiệu suất thu hồi vitamin B6 trong các mẫu nấm 59

3.7 TỔNG HỢP CÁC ĐIỀU KIỆN ÁP DỤNG PHÂN TÍCH 59

3.8 ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VIATAMIN B1, VITAMIN B6 TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM 61

3.8.1 Xác định hàm lượng Viatamin B1 61

3.8.2 Xác định hàm lượng Viatamin B6 63

KẾT LUẬN 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 68

Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

Trang

Bảng:

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát bước sóng của Vitamin B1 42

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát bước sóng của Vitamin B6 43

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát pha động của Vitamin B1 44

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát pha động của Vitamin B6 45

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát tốc độ dòng của Vitamin B1 46

Bảng 3.6 Kết quả khảo tốc độ dòng của Vitamin B6 46

Bảng 3.7 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1 47

Bảng 3.8 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B6 48

Bảng 3.9 Số liệu xây dựng đường chuẩn của vitamin B1 49

Bảng 3.10 Số liệu xây dựng đường chuẩn của vitamin B6 52

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo vitamin B1 55

Bảng 3.12 Kết quả đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo vitamin B6 56

Bảng 3.13 Kết quả phân tích các mẫu thử song song 57

Bảng 3.14 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trong phép xác định vitamin B1 58

Bảng 3.15 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trong phép xác định vitamin B6 59

Bảng 3.16 Tổng hợp các điều kiện đo vitamin B1 phương pháp HPLC 60

Bảng 3.17 Tổng hợp các điều kiện đo vitamin B6 phương pháp HPLC 60

Bảng 3.18 Kết quả xác định hàm lượng Vitamin B1 trong nấm linh chi 62

Bảng 3.19 Kết quả xác định hàm lượng Vitamin B6 trong nấm linh chi 64

Hình: Hình 3.1 Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1 47

Hình 3.2 Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B6 48

Hình 3.3 Đồ thị đường chuẩn của vitamin B1 50

Hình 3.4 Đồ thị đường chuẩn của vitamin B6 52

MỞ ĐẦU

Vitamin là một nhóm các hợp chất hữu cơ có phân tử bé, có cấu tạo hóa học rất khác nhau do đó các tính chất hóa học cũng như lí học cũng khác nhau, nhưng chúng đều giống nhau ở chỗ là rất cần thiết cho hoạt động sống của bất kỳ cơ thể nào Hiện nay người ta đã nghiên cứu và phân lập được trên

30 loại vitamin khác nhau, đồng thời đã nghiên cứu các thành phần, cấu tạo

và tác dụng sinh lý của chúng

Vitamin được cung cấp vào cơ thể con người để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng giúp cơ thể khỏe mạnh Trong nhiều thế kỉ, do thiếu một số vitamin gây nên các bệnh mù lòa (thiếu vitamin A), bệnh beri-beri (thiếu vitamin B1), bệnh scobut (thiếu vitamin C), thiếu axit folic trong thời kì thai nghén gây khuyết tật ống thần kinh ở thai nhi Người thiếu vitamin khi hàm lượng vitamin trong cơ thể ở mức thấp (bệnh giảm vitamin) Trạng thái giảm vitamin rất phổ biến ở ngay trong những người mới thoạt nhìn là hoàn toàn khoẻ mạnh Có thể gây ra những rối loạn của hệ thần kinh Họ dễ bị kích thích, dễ bị mất bình tĩnh do những nguyên nhân rất nhỏ nhặt, họ rất dễ mẫn cảm với âm thanh của radio, đối với tiếng ồn ào của trẻ con, bị bệnh mất ngủ, giảm khả năng lao động

Việc cung cấp không đầy đủ vitamin cho cơ thể sẽ có ảnh hưởng xấu không những với hệ thần kinh mà còn với một loạt cơ quan khác ở trong cơ thể Vì thế điều rất quan trọng là khẩu phần ăn của người khoẻ mạnh, và đặc biệt là người ốm cần phải có giá trị hoàn chỉnh không những về phương diện calo, về phương diện chất đạm mà còn về phương diện vitamin nữa Nhiều người còn cho rằng vitamin là thần dược chữa ung thư và kéo dài tuổi thọ

Khoa học hiện nay đang tiến hành những nghiên cứu thực nghiệm trên quy mô rộng lớn về vitamin, trong đó vitamin B1 và B6 là một trong những đối tượng được nghiên cứu

Vitamin B1 còn gọi là thiamine (dưỡng chất năng lượng) có vai trò vô cùng quan trọng trong việc duy trì các hoạtđộng tương tác của tế bào trong cơ thể, nhất là việc sản xuất năng lượng Trong đó các tế bào của cơ thể đã dùng ôxy để chuyển hóa carbohydrate và các loại đường thành năng lượng Bởi vậy, nếu không có vitamin B1 hoặc thiếu hụt nguồn dưỡng chất này thì hiệu quả sản xuất năng lượng có thể sẽ bị suy giảm hoặc bị vô hiệu hóa Ngoài ra, vitamin B1 còn có tác dụng hỗ trợ và bảo vệ hệ thống thần kinh trước nguy cơ

bị tổn thương và thoái hóa

Vitamin B6 là một loại vitamin hòa tan trong nước và là một phần của nhóm vitamin B Vitamin B6 hoạt động như một coenzym giúp chuyển hóa tryptophan thành niacin Nó còn đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa chất đạm, chất béo,carbohydrate Sự thiếu hụt vitamin B6 có thể gây ra nhiều triệu chứng: mệt mỏi, mất ngủ, khó chịu, rối loạn tâm thần, môi nứt nẻ,

da khô, rụng tóc Ở trẻ em thiếu vitamin B6 thường chậm lớn và có thể có những cơn co giật

Với vai trò và tầm quan trọng đó, vitamin B1 và B6 đã được nghiên cứu và phát hiện có trong nhiều loại thực phẩm nói chung và trong các loại nấm Linh chi

Xuất phát từ chức năng của vitamin nói chung và vitamin B1, B6 nói riêng trong cơ thể, đồng thời góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng nấm

dùng để làm dược liệu, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định hàm

lượng vitamin B1, B6 trong một số loại nấm Lớn lấy từ vườn quốc gia Pù Mát - Nghệ An bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao" làm luận văn

tốt nghiệp của mình

1 Nhiệm vụ nghiên cứu trong luận văn:

- Xác định các điều kiện tối ưu để đo sắc đồ HPLC của B1, B6

- Xác định hàm lượng vitamin B1, B6 theo phương pháp ngoại chuẩn

- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích

- Khảo sát độ lặp

- Xác định hiệu suất thu hồi

- Phân tích, xử lý số liệu

- Tính toán kết quả thực nghiệm

2 Đối tượng nghiên cứu: một số loại nấm Lớn lấy từ vườn quốc gia Pù Mát - Nghệ An

3 Phương pháp nghiên cứu: Các kết quả nghiên cứu đã được tiến hành bằng thực nghiệm Phương pháp thực nghiệm được sử dụng là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HLC (High Performance Liquid Chromatography)

4 Những đóng góp của đề tài: đã góp phần xác định thành phần dinh dưỡng của một số loại nấm lớn

Sở dĩ nấm được xếp vào giới riêng mà không được xếp vào giới thực vật hay động vật vì Nấm có nhiều đặc điểm khác thực vật như:

- Không có lục lạp, không có sắc tố quang hợp nên không thể tự động tạo các chất hữu cơ cho cơ thể khác như thực vật

- Không có sự phân hóa cơ quan thành thân, rễ, lá, hoa

- Phần lớn nấm không chứa xenlulozo trong vách tế bào mà chủ yếu bằng Chitin và glucan Chitin là chất gặp ở động vật nhiều hơn thực vật, chủ yếu ở nhóm giáp xác và côn trùng, tạo thành lớp vỏ hoặc cánh cứng cho các loài này

- Nấm dự trữ đường dưới dạng glycozen, thay vì tinh bột như thực vật Nấm cũng không được xếp vào giới động vật vì:

- Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử (hữu tính hay vô tính) giống hạt phấn của thực vật

- Sự dinh dưỡng của Nấm liên quan đến hệ sợi nấm Nấm lấy các chất dinh dưỡng thông qua màng tế bào của sợi nấm (tương tự như cơ chế

ở rễ thực vật)

1.1.2 Phân loại Nấm

Giới Nấm được chia làm 4 giới phụ:

- Giới phụ nấm nhầy - Gymnomycetoida

- Giới phụ nấm tảo - phycomycetoida

đa số nấm lớn thuộc ngành phụ Agaricomycotina Doweld (2001); chỉ có một

số rất ít loài thuộc 2 ngành phụ Pucciniomycotina R Baeuer, Beregow…(với

12 loài thuộc chi Septobasidium thuộc bộ Septobasidioles) và Ustilagomycotina Doweld (2001) với các lớp thuộc Ustilagomycetes (với 2 đại diện thuộc lớp nấm Than là Ustilago maydis trên ngô và Ustilago esculenta trên củ niễng đều ăn được) và Exobasidiomycetes (với một vài loài thuộc chi nấm Đảm ngoài Exobasidium gây bệnh phồng lá) Trong ngành phụ Agaricomycotina, đại đa số nấm lớn thuộc về lớp Agaricomycetes Hai lớp còn lại chỉ có số lượng loài rất khiêm tốn là Tremellomycetes (17 loài thuộc

bộ Tremellales) và lớp Dacrymycetes ( với 5 loài thuộc bộ Dacrymycetales) Trong lớp Agaricomycetes, các bộ có số lượng loài nhiều nhất là Aphyllophorales sensu lato (hơn 300 loài), Agaricales sensu lato (gần 300 loài), Boletales (gần 60 loài), Russulales (gần 40 loài) Các bộ có ít loài nhất

là Hymenogastrales (1 loài), Ceratiomycetales (1 loài)

1.1.4 Nấm linh chi

Nấm linh chi, tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim

(Ganodermataceae) Nấm linh chi còn có những tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung

Mỗi tên gọi của Linh chi gắn liền với một giá trị dược liệu của nó Tên gọi Linh chi bắt nguồn từ Trung Quốc, hay tiếng Nhật là Reishi hoặc Mannentake, tên gọi Latinh: Ganoderma lucidum

Linh chi có tới 2000 loại và phổ biến nhất là Ganoderma lucidum và Ganoderma zaponicum

Ở Việt Nam, loài nấm Linh chi Ganoderma lucidum mới được nuôi trồng thành công trong phòng thí nghiệm (1978) Năm 1994 loài nấm lim - một chủng Linh chi đỏ đặc sắc của các rừng Lim Bắc Việt đã được Phạm Quang Thụ đưa vào nuôi trồng chủ động Đến hiện nay, việc nuôi trồng nấm Linh chi đỏ đã được phổ biến tại các trang trại, đặc biệt là các vùng ven thành phố Huế

1.1.4.1 Phân loại và tác dụng trị liệu của nấm Linh Chi

Nấm Linh chi là một dược liệu mà con người từ xa xưa đã biết dùng làm thuốc Trong "Thần nông bản thảo" xếp Linh chi vào loại siêu thượng phẩm hơn cả nhân sâm; trong "Bản thảo cương mục" coi Linh chi là loại thuốc quý, có tác dụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cường tâm, kiện nảo (bổ óc), tiêu đờm, lợi niệu, ích vị (bổ dạ dày); gần đây các nhà khoa học

Trung Quốc và Nhật phát hiện nấm linh chi còn có tác dụng phòng và chống ung thư, chống lão hóa làm tăng tuổi thọ

Theo y học cổ truyền, nấm linh chi có vị nhạt, tính ấm, có tác dụng tư

bổ cường tráng, bổ can chí, an thần, tăng trí nhớ

Ở các nước Đông Nam Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…) việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng nấm Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm, đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt chất, tác dụng dược

lý và phương pháp điều trị lâm sàng

Giá trị dược lý của Linh chi càng được khẳng định khi Hội nghị nấm học thế giới thành lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế tại New Yord Qua phân tích về các mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh như: bệnh tim mạch, hô hấp, tăng khả năng miễn dịch, trị bệnh gan, có hiệu quả trong chống ung thư, khả năng kháng HIV…, ngoài ra các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay do nhiễm

xạ Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ nào cho cơ thể

Nấm Linh Chi cơ bản có các loại như sau:

 Hoàng Chi (còn gọi là Kim Chi) Nấm có màu vàng, vị ngọt, không độc, tính bình, an thần, ích tì khí

 Bạch Chi (còn gọi là Ngọc Chi) Đây là loại nấm Linh Chi màu trắng, có vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông mũi, an thần, trị ho nghịch hơi

 Thanh chi (còn gọi là Long Chi) Nấm này có màu xanh, tính bình, vị chua.Tác dụng làm sáng mắt, ăn thần, tăng trí nhớ, bổ gan khí

 Hắc chi (còn gọi là Huyền Chi) Nấm có màu đen, vị mặn, tính bình, không độc Tác dụng trị chứng bí tiểu, ích thận khí

 Tử chi (còn gọi là Mộc Chi) Nấm này có màu tím, vị ngọt, tính bình, không độc Trị các chứng đau nhức xương khớp và gân cốt

 Linh Chi đỏ (còn gọi là Xích Chi, Đơn Chi, Hồng Chi) Nấm có màu

đỏ tươi khi còn non, trưởng thành có lớp bào tử màu nâu trên bề mặt Nấm có

vị đắng, không độc, tính bình, tăng trí nhớ, dưỡng tim, bổ gan, chữa bệnh tiểu đường, huyết áp và tim mạch

Mặc dù có tới 6 loại nấm Linh Chi khác nhau, nhưng tất cả được phân loại theo màu sắc, y học coi nấm Linh Chi đỏ là loại có dược tính đa dạng và mạnh nhất, do đó nó là loại Linh Chi được dùng phổ biến nhất trên thế giới

Vô số các tài liệu, trang web khi đề cập đến nấm Linh chi nói chung, là mặc định nói về nấm Linh chi đỏ Nấm Linh chi trồng phổ biến ở Việt nam là nấm Linh chi đỏ Loại nấm Linh chi trồng tại Hàn Quốc, Nhật Bản, hay Trung Quốc, cũng là nấm Linh chi đỏ.Tuy nhiên, chất lượng nấm Linh chi (đỏ) mỗi nơi mỗi khác nhau do ảnh hưởng bởi các yếu tố về giống, điều kiện môi trường, phương pháp gieo trồng, cách chăm sóc, thu hoạch

1.1.4.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi

- Nhiệt độ: giai đoạn nuôi sợi, nấm Linh chi sinh trưởng và phát triển

tốt ở nhiệt độ 2030oC, giai đoạn hình thành quả thể nhiệt độ thích hợp 2228oC

- Độ ẩm: độ ẩm cơ chất khoảng 6065% Độ ẩm không khí của nhà

- Độ pH: Linh Chi thích nghi trong môi trường trung tính đến axit yếu

(pH 5,5-7)

- Độ thoáng: trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm Linh chi cần

độ thông thoáng tốt

1.1.4.3 Thành phần hóa học Nấm Linh Chi

Có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt chất và xác định tác dụng dược lý của nấm linh chi như: Germanium, acid ganoderic, acid ganodermic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans, adenosin, beta-D-glucan, (đặc biệt trong nấm Linh chi, có hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 - 8 lần) Các nhà khoa học Việt Nam tìm thấy trong nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố vi lượng cần thiết cho

sự vận hành và chuyển hóa của cơ thể như: đồng, sắt, kalium, magnesium, natrium, calcium

Sau đây là những thành phần hóa học chính của nấm Linh chi:

- Hợp chất đa đường (45% số lượng): arabinogalactane, glucane; ganoderane A, B, C

beta-D Triterpene: axit ganoderic A, B, C, D, F, H, K, M, R, S, và Y

- Ganodermadiol phân sinh của loại axit lanostaoic

- Esteroides: Ganodosterone

- Axit béo chưa bão hòa

- Chất đạm protide: Ling Zhi-8, glycoproteine (lactine)

- Khoáng chất: Ca, Ge, Co, Mg, Fe, Mn, Zn, Be, Cu, Ag, Al, Na…

- Những chất khác: manitole, adenine, trechalose, uracine, lysine… Qua phân tích về các mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh như: bệnh tim mạch,

hô hấp, tăng khả năng miễn dịch, trị bệnh gan, có hiệu quả trong chống ung thư, khả năng kháng HIV…, ngoài ra các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể

hay do nhiễm xạ Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ nào cho cơ thể

1.1.5 Các mẫu nấm được nghiên cứu trong đề tài

MN 206: Ganoderma triangulatum MN 205: Phellinus melanodermus

MN202: Ganoderma applanatum MN 203: Ganoderma lucidum

MN 210: Phellinus setulosus MN 201: Hexagonia apiaria

MN 207: Nigrofomes melanporus MN 204: Ganoderma philippii

MN 209: Ganoderma fulvellum MN 211: Ganoderma lobatum

1.2 GIỚI THIỆU VỀ VITAMIN B1, B6

Tên gọi "vitamin" có từ năm 1912 do nhà khoa học Ba Lan Funk với ý

nghĩa đó là những "amin sống" Chúng được chia thành 2 nhóm lớn

- Các vitamin tan trong nước: Các vitamin nhóm B, vitamin C, vitamin PP, vitamin P, chủ yếu tham gia vào các quá trình liên quan tới sự giải phóng năng lượng như quá trình oxi hoá khử, quá trình phân giải các

hợp chất hữu cơ

- Các vitamin tan trong dầu: Vitamin A, D, E, K tham gia vào các phản

ứng tạo nên các chất có chức năng cấu trúc các mô, các cơ quan

Vitamin nhóm B là hợp chất rất quan trọng trong tế bào sống như là thành phần cần thiết cho sự phát triển

1.2.1 Vitamin B1

• Tên gọi khác: Thiamin, aneurine hydrochloride

• Tên IUPAC: 2-[3-[(amino- 2-methyl- pyrimidin- 5-yl) methyl]- methyl- thiazol- 5-yl] ethanol

4-• Công thức phân tử: C12H17N4OS+Cl-.HCl

• Khối lượng phân tử: 337.27

• pKa1 =4.8, pKa2 =9.0

• Công thức cấu tạo:

Ngoài ra thiamin còn tồn tại dưới dạng photphat este gồm thiaminmonophotphat (TMP), thiamin triphotphat (TTP), thiamin pyrophotphat (TPP) là dạng mà vị trí OH sẽ được đính vào hoặc 1, 2 hoặc 3 gốc photphat (R)

nm và λmax2 =264.5 nm

1.2.1.2 Tính chất hóa học

Thiamin bị oxy hóa bởi K3[Fe (CN)6] trong môi trường kiềm tạo thành thiocrom màu vàng phát huỳnh quang màu xanh da trời, tính chất này được dùng để xác định B1 bằng phương pháp đo huỳnh quang

Thiamin tạo kết tủa khi phản ứng với tannin, thủy ngân (II) clorua, axit picric.Trong cơ thể, vitamin B1 tham gia vào nhiều phản ứng chuyển hóa, đặc biệt là chuyển hóa glucid

1.2.2.1 Tính chất vật lý

Vitamin B6 là tinh thể không màu, vị hơi đắng, hòa tan tốt trong nước

và trong rượu, chịu nhiệt, nhạy cảm với ánh sáng, pyridoxin bazơ có nhiệt độ nóng chảy ở 1600C, pyridoxin hydrochloric nóng chảy ở 204 -2060C, bền vững khi đun nóng Bền khi đun sôi trong axit hay kiềm, không bền trong môi trường có tính oxy hóa

Vitamin B6 nhạy cảm với ánh sáng, chúng phân hủy nhanh khi chiếu sáng ở môi trường kiềm hay trung tính, còn trong môi trường axit thì pyridoxin, pyridoxan và pyridoxamin bền hơn Tính chất vật lý của vitamin B6 được tóm tắt ở bảng dưới

Bảng 1.1: Tính chất của 3 dạng vitamin B6

Tên hoạt chất Pyridoxin.HCl Pyridoxan.HCl Pyridoxamin.HCl

CTPT C8H12ClNO3 C8H9NO3.HCl C8H12N2O2.HCl Nhiệt độ nóng chảy (0C) 204 - 206 160 226 - 227

λmax (nm) 292; 290; 253 390; 318 328; 253

1.2.2.2 Tính chất hóa học của vitamin B6

Tất cả 3 chất trên đều có tính bazơ do nhân pyridin gây ra tác dụng với các axit tạo thành muối Chế phẩm dược dùng là pyridoxin hydroclohidrat dễ tan trong nước, tạo muối, kết tủa với axit silicovonframic, axitphotphovonframic, dễ hòa tan trong các dung dịch kiềm

Vitamin B6 dễ bị oxy hóa, tác nhân xúc tác quá trình này là ánh sáng tia tử ngoại, vitamin B6 tác dụng với Fe (III) cho muối phức màu đỏ Vitamin B6 ở dạng dẫn xuất photphat như pyridoxan photphat tham gia nhóm ngoại (coenzyme) của nhiều men như: transaminase, decacboxylase, dehydro desylfuarase… tham gia trong các quá trình chuyển hóa axit amin, lipid, glucid, chuyển protein sang glucid

Vitamin B6 giữ vai trò đặc biệt trong chuyển hóa acid amin:

acid aspartic acid pyruvic acid oxalacetic alanin

1.2.3 Vai trò và nhu cầu của vitamin B1, B6 đối với cơ thể

thể, nhất là việc sản xuất năng lượng Trong đó các tế bào của cơ thể đã dùng ôxy để chuyển hóa carbohydrate và các loại đường thành năng lượng

Bởi vậy, nếu không có vitamin B1 hoặc thiếu hụt nguồn dưỡng chất này thì hiệu quả sản xuất năng lượng có thể sẽ bị suy giảm hoặc bị vô hiệu hóa

- Vitamin B1 còn có tác dụng hỗ trợ và bảo vệ hệ thống thần kinh trước nguy cơ bị tổn thương và thoái hóa

- Ngoài ra vitamin B1 còn hỗ trợ các bộ phận trong cơ thể và hệ thần kinh ngắt các thông báo truyền gửi cho nhau

- Vitamin B1 chữa một số biểu hiện thần kinh, viêm dây thần kinh (do rượu, rối loạn tiêu hoá, nhiễm độc do nhiễm khuẩn…) do đau thấp khớp, zona Những bệnh về tim và tiêu hoá, gan, đi lỏng, xơ gan, thoái hoá mỡ, trong những trường hợp nhiễm khuẩn được điều trị bằng kháng sinh, salicylat, sulfamid…

- Nhu cầu về vitamin B1 phụ thuộc vào các điều kiện khác nhau như trạng thái sinh lý của cơ thể, chế độ thức ăn, làm việc… Trung bình cơ thể người cần từ 200mcg -1,3 mg vitamin B1/ngày

 Vitamin B6

- Vitamin B6 là một loại vitamin hòa tan trong nước và là một phần của nhóm vitamin B Vitamin B6 hoạt động như một coenzym giúp chuyển hóa tryptophan thành niacin

- Nó còn đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa chất đạm, chất béo, carbohydrate Vitamin B6 tham gia vào quá trình tổng hợp hemoglobin

và sự bài tiết của tuyến thượng thận

- Vitamin này còn cần thiết cho phản ứng lên men tạo glucose từ glycogen, góp phần duy trì lượng đường huyết trong máu ổn định; giúp bảo vệ tim mạch, tăng cường hệ miễn dịch và duy trì chức năng não khỏe mạnh

- Thiếu hụt vitamin B6 có thể dẫn đến thiếu máu nguyên bào sắt, viêm dây thần kinh ngoại vi, viêm da, tăng bã nhờn, khô nứt môi Vitamin B6 dùng điều trị nhiễm độc isoniazid hoặc cycloserin

- Lượng vitamin khuyến cáo dùng mỗi ngày khác nhau tùy theo giới tính và độ tuổi và sẽ ngày càng tăng khi già đi Trung bình cơ thể người cần từ 100mcg -2,0 mg vitamin B6/ngày

1.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6

Hiện nay có nhiều phương pháp để nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin như: Phương pháp cực phổ, Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, phương pháp phổ đạo hàm bậc, phương pháp trắc quang… Tuy nhiên, để chọn phương pháp vừa đảm bảo độ chính xác, tính kinh tế và tính khả thi phù hợp với nhiều phòng thí nghiệm, thì trong luận văn này chúng tôi đã chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vì nó

có nhiều ưu điểm như: phân tích đồng thời nhiều hợp chất, không cần làm bay hơi mẫu, độ nhạy, độ phân giải cao, nhanh chóng, dễ dàng kết nối với khối phổ…

1.3.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay đây là phương pháp áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm

thuốc, là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng

Ưu điểm của HPLC:

- Điều kiện phân tích khá dễ dàng

- Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao

- Độ lặp lại cao

- Thường không phân hủy mẫu trong quá trình phân tích

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử)

Trong luận văn này chúng tôi sử dụng Hệ thống sắc ký Alliance với

bơm 2690, detector huỳnh quang 2475 (Hãng Waters, Mỹ)

1.3.2 Phân loại sắc ký và ứng dụng

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc

ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có sắc ký Gel hay Rây phân tử Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động Như vậy, nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C Vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác F1, F2 và F3

Chất phân tích A + B + C

F1 F2

Pha tĩnh Pha động F3

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại

Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3 Trong

đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột.Theo cơ chế chia tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ của sắc ký, người ta phân ra các loại sau đây:

- Sắc ký hấp phụ (NP-HPLC và RP-HPLC)

- Sắc ký phân bố - Sắc ký chiết (LLC)

- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC)

- Sắc ký rây phân tử - sắc ký gel (IG-HPLC)

Nhưng thực tế hiên nay, chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu Sắc ký hấp phụ là quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ:

- Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực

- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực

Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ nhiệt giảm đau Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP)

1.3.3 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ Từ các thông số của các pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lợi cho quá trình phân tích sắc ký

1.3.3.1 Thời gian lưu: Retention time (t R )

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại Thời gian lưu của mỗi chất

là hằng định và các chất khác nhau có thời gian lưu khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

Một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì peak bị dãn và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên

1.3.3.2 Hệ số dung lượng K ’

- Hệsố dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.Thường được

tính theo công thức sau:

K’ =     1

o

R o

o R o

R

t

t t

t t t t

- Hệ số dung lượng K’ phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặc tính của pha tĩnh và pha động

- Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém K’ lớn thì pic bị loãng, độ nhạy kém Trong thực tế K’ từ 1 đến 5 là tối ưu

1.3.3.4 Số đĩa lý thuyết N

- Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc kí nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như một lớp pha tĩnh có chiều cao là H Tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động Vì vậy với một điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức:

N =

2 2

5 , 0

2

16 54

R

w

t w

t t

Trong đó: tR là thời gian lưu của chất phân tích

W0,5 là độ rộng tại điểm ½ của peak

1.3.3.5 Độ phân giải R (Resolution)

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên

một điều kiện sắc ký đã cho Trong thực tế nếu các Peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để 2 Peak tách là R =1 Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp

Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích Peak sẽ không chính xác

Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung môi Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các Peak

ta phân tích

Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong quá trình phân tích

1.3.3.6 Hệ số không đối xứng T

- Hệ số đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ thu được T được tính bằng tỷ số độ rộng của hai nửa pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều cao của pic

T =

a b

- Pic dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được, vì vậy phải quan tâm đến hệ số không ðối xứng T, khi T  2,5 thì phép định lượng được chấp nhận, nếu T > 2,5 thì điểm cuối của pic rất khó xác định Vì vậy cần thay

đổi các điều kiện sắc kí để làm cho pic cân đối xứng hơn theo cách sau:

+ Làm giảm thể tích chiết, tức là đoạn nối từ cột đến Detecter

+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên

+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu phân tích hoặc giảm thể tích

dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn

Lưu ý:

- Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết

và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích

- Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích, nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các Peak tạp trong quá trình phân tích

1.3.4.2 Bộ khử khí

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động Nếu như trong quá trình phân tích, dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra:

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng dẫn đến cho thời gian lưu của Peak thay đổi

- Sinh bọt khí làn nhiễu đường nền, làm xuất hiện các pic lạ

- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên

và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

1.3.4.3 Bơm

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc

ký Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến

500 at (1at =0.98 Bar) và bơm phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên đến

1200 bar), không bị ăn mòn bởi nhiều loại dung môi Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường dùng bơm có áp suất tối đa 412 Bar Tốc độ dòng: 0.1-9.999 ml/phút.Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại thường dùng loại bơm có 2 pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục

thông thường

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 - 30cm, đường kính trong 1-10mm.Thông thường chất nhồi cột là

Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm Oxit, polyme xốp, chất trao đổi ion Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column)

1.3.4.6 Đầu dò

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích

A = k.C Trong đó:

A: là tín hiệu đo được Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất …

C: Nồng độ chất phân tích

k: là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau:

- Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV (Detector UV)

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang và đây là loại thông dụng nhất

- Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn xuất có huỳnh quang và là loại Detector có

độ chọn lọc cao nhất

- Loại hiện đại hơn có Detector Diod Array, ELSD (Detector tán xạ bay hơi) các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất

theo độ hấp thu cực đại của các chất Ngoài ra còn có một số loại Detector khác nữa…

1.3.4.7 Bộ phận ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang.Trong các máy thế hệ

cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của Peak, chiều cao…Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạytrên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số của Peak như tính đối xứng, hệ số phân giải trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD%

1.3.4.8 In kết quả

Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện

1.3.5 Chọn điều kiện sắc ký

Muốn có một kết quả tách tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc

ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu Các điều kiện đó bao gồm

1.3.5.1 Lựa chọn pha tĩnh

Dựa vào các tài liệu Dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hay các loại cột khác nhau Chúng ta thông thường dùng 2 loại cột pha thuận (NP) và cột pha đảo (RP) Ngoài ra, ta có thể dùng một số loại cột khác như cột CN, cột NH2

a Cột pha thuận (NP): Silicagel trung tính

Pha tĩnh: Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực

hay ít phân cực Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước

Pha động: dùng cho lọai này là các dung môi không phân cực hay ít phân cực như: Methanol, Benzen, Acetonitril, Chlorofoc

b Cột pha đảo (RP): (Silicagel đã Alkyl hóa)

Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực

có thể tạo cặp ion Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch cacbon thẳng (C8 hay C18 tương đương

RP 8 hay RP 18) hay các mạch cacbon vòng (Phenyl- tương đương cột Phenyl) vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít

Pha động: Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực

như: Methanol, Acetonitril, nước hay các loại dung dịch đệm, hỗn hợp của các dung môi đệm Sự tách của chất được nhồi loại cột này có độ lặp lại cao

và nó được ứng dụng chủ yếu trong phân tích dược phẩm Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu.Hiện nay pha tĩnh trên nền Silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào nhóm thế của nguyên tử H, ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh trên nền oxit nhôm, trên nền chất hữu cơ cao phân tử, trên nền mạch cacbon

1.3.5.2 Lựa chọn pha động

Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích, ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của Peak

đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị Pha động có thể làm thay đổi:

- Độ chọn lọc

- Thời gian lưu

- Hiệu năng tách của cột

- Độ phân giải

- Tính đối xứng của Peak

Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn, được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học

- Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng (đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm kết tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột Ví dụ: đệm photphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column)

- Pha động phải bền vững theo thời gian càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao, hoá chất tinh khiết phân tích

- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phải phù hợp với loại Detector Ví dụ: UV - VIS khi sử dụng thì dung môi không được hấp thụ quang (Ví dụ: acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm) Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang

- Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt

Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC) pha động là dung môi phân cực là: Nước, ACN, MeOH, acid hay Base hữu cơ và một vài Amin hay Aminoacid…Do sự thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha động phân cực hơn pha động chứa một chất hữu cơ Ví dụ: thêm nước vào ACN hay MeOH Sẽ tạo được pha động phân cực hơn nó Vì thế thực tế người ta thường dùng hỗn hợp các chất làm pha động Tất nhiên, độ phân cực phụ thuộc vào tỷ lệ nước được thêm vào.Ngoài các dung môi chính, trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP-HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm pH để ổn định pH Chất tạo phức, tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất.Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương trình sắc ký Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký tốt, phù hợp thì chúng ta mới có thể định tính, định lượng được các lọai chất đa thành phần một cách nhanh chóng và hiệu quả cao

1.3.6 Tiến hành đo sắc ký

1.3.6.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc

Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, năng lượng đèn đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký Ví dụ: Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: rửa bằng MeOH, không rửa bằng nước

Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước trước cho sạch muối, sau đó rửa Tỷ lệ ACN hay MeOH: Nước (50: 50) cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu Tuyệt đối tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó

để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng được Lưu ý nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phân tích

1.3.6.2 Chuẩn bị dung môi pha động

Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết dùng cho HPLC

Các hóa chất dùng phải là loại tinh khiết phân tích Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian

Mẫu thử xử lý mẫu thử theo đúng qui trình, theo nguyên tắc:

- Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu

- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết…

- Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm

- Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột,

có thể gây ra nghẽn cột

Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần

+ Tỷ lệ các dung môi pha động

+ Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu

với mẫu thử là chất bay hơi, chất có thể phản ứng được với hơi nước hoặc không khí

Các thành phần vi lượng có thể bị hấp phụ hoặc phản hấp phụ bởi bình chứa trong thời gian bảo quản

Tiến hành đo sắc ký

Quá trình chạy sắc ký cần chú ý:

- Có thể xảy ra sự phân huỷ của chất thử trong khi phân tách

- Có thể xuất hiện píc lạ trên sắc đồ do dung môi dùng hoà tan mẫu thử

có chứa tạp chất Vì vậy cần phải kiểm tra bằng sắc ký các vết tạp đó

Chuẩn bị mẫu thử

Dung môi để hòa tan mẫu thử phải được xem xét cẩn thận Lý tưởng nhất là dùng pha động làm dung môi để hoà tan nó.Trừ trường hợp mẫu thử

khó tan trong dung môi này thì phải tìm dung môi khác thích hợp hơn Dung

môi phải đáp ứng các yêu cầu sau:

+ Độ tinh khiêt cao để không có píc lạ

+ Có thể hoà lẫn được với dung môi rửa giải (pha động)

+ Cho đáp ứng rất nhỏ với detector

+ Dung môi và dung dịch thử phải được lọc qua màng lọc 0,45µm

Tiêm mẫu:

Có 2 cách tiêm mẫu vào cột: Dùng bơm tiêm và van tiêm mẫu thể tích xác định Dùng van tiêm mẫu cho kết quả chính xác hơn (+1%) so với dùng bơm tiêm (± 1 - 2%)

Đo tín hiệu detector

Detector được dùng phổ biên nhất trong HPLC là detector UV-VIS Detector sử dụng phải đáp ứng một số yêu cầu sau:

+ Hoạt động được ở vùng tuyến tính của nó có độ hấp thụ nhỏ đối với dung môi (độ nhiễu đường nền thấp)

+ Tránh lọt không khí vào cột và detector,

+ Giữ sạch cell và làm sạch nó thường xuyên

Tín hiệu detector:

Tín hiệu detector đo được khi chất ra khỏi cột sắc ký được máy ghi lại dưới dạng pic Ở máy sắc ký cổ điển, việc đo diện tích hoặc chiều cao pic được thực hiện bằng tay Còn ở các máy sắc ký hiện đại việc đo đạc này được

tự động hoá nhờ máy tích phân máy tính

Các phương pháp định lượng

Sắc ký là phương pháp rất thuận lợi để định lượng một chất trong hỗn

hợp vì chất đó được tách ra khỏi các chất khác, và đồng thời được định lượng dựa vào việc đo chiều cao hay diện tích pic.Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký:

Phương pháp chuẩn ngoại (External Standard)

Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó

cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện So sánh diện tích, (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hoá 1 điểm hoặc nhiều điểm

a Chuẩn hoá 1 điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

Sx (Hx): diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử

Ss (Hs): diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn

b Chuẩn hoá nhiều điểm Tiến hành qua các bước sau:

- Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các kết quả thu được là các diện tích, hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn

- Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ của chất chuẩn (C), Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Có thể thực hiện việc tính, toán này theo 2 cách:

+ Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của nó

Hình 1.1 Đồ thị phương pháp chuẩn ngoại

+ Xây dựng phương trình hồi qui tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) píc với nồng độ của chất cần xác định

Y = a + bCx

Trong đó:

Y: Diện tích pic hoặc chiều cao a: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung b: Độ dốc của đường chuẩn

Cx: Nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử

X

Y a C

Phương pháp chuẩn nội (Internal Standard)

Trong định lượng bằng phương pháp sắc ký nói chung cũng như HPLC nói riêng phương pháp chuẩn ngoại (ESTD) tỏ ra có nhiều nhược điểm trong phân tích, các mẫu phải xử lý phức tạp (chiết, tách ) và đặc biệt là các mẫu vừa phức tạp vừa có hàm lượng thấp của chất cần định lượng, ví dụ như các mẫu huyết tương trong nghiên cứu dược động học

Phương pháp chuẩn nội (ISTD) giúp khắc phục được những nhược điểm trên của ESTD Ngoài ra, nó còn có thể giúp hạn chế tối đa được những sai số gây nên do máy móc và kỹ thuật.Kỹ thuật chuẩn nội có thể được tóm tắt như sau: người ta thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Chất được thêm này gọi là chuẩn nội

Từ những dữ kiện về diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chất chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong mẫu thử một cách chính xác

Có một số yêu cầu đặt ra với chất chuẩn nội:

- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn

và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử

- Có cấu trúc hóa học tương tự nhau như chất thử

- Có nồng độ xấp xỉ nồng độ của chất thử

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

- Phảỉ có độ tinh khiết cao

Vì rằng kết quả (response) của chất chuẩn và chuẩn nội với detector không cùng độ nhạy, nên trước hết cần phải xác định hệ số đáp ứng (response factors) để hiệu chỉnh trong tính kết quả.Hệ số đáp ứng Fx được xác định như sau: chuẩn bị một hỗn hợp có chứa những lượng (hoặc nồng độ) đã biết của chất chuẩn và chuẩn nội rồi chạy sắc ký Sắc đồ thu được sẽ cho ta biết các dữ liệu về diện tích của các pic

Trong phương pháp chuẩn nội, người ta thấy có mối tương quan giữa tỷ

số của khối lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn và chuẩn nội với tỷ số điện tích của 2 pic Và hệ số đáp ứng được tính theo phương trình sau:

Tính theo nồng độ ta có:

:

is c

C S F

C S



Ở đây: mc,mis lần lượt là khối lượng của chất chuẩn và chuẩn nội

Cc, Cis lần lượt là nồng độ của chuẩn và chuẩn nội

Sc, Sis lần lượt là diện tích pic chuẩn và chuẩn nội

Các sai số sẽ được hạn chế tối đa nếu hệ số Fx xấp xỉ đơn vị có nghĩa là chất chuẩn và chuẩn nội có cùng đáp ứng với detector Tuy nhiên, trong thức

tế điều này thường khó đạt được hoàn hảo

Tiến hành định lượng thành phần trong mẫu thử theo hai phương pháp:

a Phương pháp chuẩn 1 điểm: Chuẩn nội được thêm vào cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử, rồi tiến hành sắc ký

Lượng hoặc nồng độ của thành phần trong mẫu thử được tính như sau:

Ở đây: mt khối lượng của chất cần phân tích trong mẫu

Ct, Cis lần lượt là nồng độ của chất cần phân tích trong mẫu

Hình 1.2 Phương pháp đường chuẩn sử dụng nội chuẩn

Song song tiến hành sắc ký mẫu thử cũng được thêm chuẩn nội với lượng (hoặc nồng

độ) như thang chuẩn.Tính tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) píc của chất thử trên diện tích (hoặc chiều cao) pic chuẩn nội (Sx/Sis) Rồi dựa vào đường chuẩn sẽ tìm được nồng độ của chất thử (Cx)