Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm phát triển phương pháp định lượng capsaicin và dihydrocapsaicin để lựa chọn nguyên liệu ớt có hàm lượng hoạt chất cao nhất. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
Trang 1NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CAPSAICIN VÀ DIHYDROCAPSAICIN TRONG
QUẢ ỚT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Văn Long*; Chử Văn Mến* Nguyễn Thị Thanh Hương*; Phạm Thị Thanh Hương*
TÓM TẮT
Tiến hành định lượng capsaicin và dihydrocapsaicin trong quả ớt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với quang phổ UV-Vis Tiến hành phân tích trên cột pha đảo C 18 (5 μm; 4,6 mm x 150 mm), với chương trình gradient sử dụng dung môi A (nước) và dung môi B (acetonitril), bước sóng 222 nm, tốc độ dòng 0,6 ml/phút Giới hạn phát hiện của capsaicin và dihydrocapsaicin tương ứng 8 và 11 ng/mL Giới hạn định lượng của capsaicin và dihydrocapsaicin tương ứng 24 và 33 ng/g Phương pháp này áp dụng cho 20 mẫu ớt thu mua trên thị trường Kết quả: hàm lượng capsaicin và dihydrocapsaicin biến động nhiều giữa các mẫu
* Từ khóa: Capsaicin; Ớt; Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Quantitation of Capsaicin and Dihydrocapsaicin in
Fructus Capsici using HPLC-UV/Vis method
summary
We quantitated capsaicin and dihydrocapsaicin in Fructus Capsici using HPLC-UV/Vis method The separation was carried out on a reversed phase C 18 (5 μm; 4.6 mm x 150 mm) by gradient elution with water and acetonitrile, the wave length was set at 222 nm, the flow rate water was set at 0.6 ml/min The limit of detection (LOD) of the method was 8 and 11 ng/g for capsaicin and dihydrocapsaicin, respectively The limit of quantification (LOD) was 24 and 33 ng/mL The developed method was applied to the quantitation of 20 sample of different Fructus Capsici samples purchased from markets The results showed that the contents of capsaicin and dihydrocapsaicin were different between samples
* Key words: Capsaicin; Capsicum; HPLC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ớt thuộc chi Capsicum, họ Cà (Solanaceae),
có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ,
ngày nay được trồng nhiều ở các nước
nằm trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt
đới của châu Á [1] Ở Việt Nam, hiện nay
có gần 10 loại ớt được sử dụng trong
chữa đau lưng, thấp khớp, đau dây thần
kinh, viêm thanh quản, viêm họng… [2] Nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của ớt cho thấy các nhóm hoạt chất như capsaicinoid (capsaicin, dihydrocapsaicin ), sắc tố carotenoid là capsanthine, adenine, betaine và cholien vitamin B1, B2, C… có tác dụng giảm đau,
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com)
Ngày nhận bài: 28/03/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/05/2014
Trang 2tác dụng trên da và niêm mạc, tác dụng
giảm tích lũy lipid gan… Gần đây, một số
tác giả nước ngoài cũng đã chứng minh
capsaicin có tác dụng giảm đau, chống
đau viêm khớp và viêm [3, 4] Một số
nghiên cứu chỉ ra capsaicin có hiệu
quả chống ung thư [5], cũng như chống
lại cholesterol cao và béo phì [6, 7]
Dihydrocapsaicin có tác dụng chống lại
sự hình thành mảnh xơ vữa động mạch
[8] Ngoài ra, capsaicin và những chất
khác trong nhóm capsaicinoid có tác dụng
sinh lý và dược lý trên đường ruột - dạ
dày, hệ tim mạch và hô hấp, cũng như
các giác quan và hệ điều hòa nhiệt
Hàm lượng của hoạt chất trong ớt phụ
thuộc nhiều vào loài, thổ nhưỡng, khí
hậu, cách trồng, chăm sóc và thu hoạch
Do vậy, việc đánh giá chất lượng ớt thu
mua trên thị trường là cần thiết Trong
nghiên cứu này, chúng tôi phát triển
phương pháp định lượng capsaicin và
dihydrocapsaicin để lựa chọn nguyên liệu
ớt có hàm lượng hoạt chất cao nhất
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Nguyên liệu và thiết bị
- Mẫu ớt được mua tại các khu vực
khác nhau của Việt Nam và mã hóa thành
các mẫu C01 đến C20
- Hóa chất: capsaicin và dihydrocapsaicin
chuẩn (Sigma), độ tinh khiết > 98%
Acetonitril, methanol, nước cất đạt tiêu
chuẩn cho HPLC Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích
- Máy HPLC Alliance Water 2695D, gồm hệ bơm 4 kênh dung môi, autosampler, buồng ổn định nhiệt cột và Water 996 PDA Detector Thực hiện phân tích trên cột pha đảo C18 (4,6 mm x 150 mm,
5 µm)
2 Phương pháp nghiên cứu
- Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn gốc được pha bằng cách hòa tan capsaicin và dihydrocapsaicin chuẩn trong methanol với nồng độ 1 mg/ml Từ dịch gốc capsaicin
và dihydrocapsaicin, pha các dung dịch chuẩn làm việc thích hợp
- Mẫu thử: cân chính xác 1 g mẫu bột
ớt, cho vào bình định mức 25 ml, thêm methanol 100% đến vạch Chiết siêu âm trong 60 phút ở 25oC, lọc qua màng 0,45 µm Dịch lọc được dùng để tiêm mẫu
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Khảo sát điều kiện sắc ký
Tiến hành khảo sát với điều kiện sắc ký: cột Water C18 (4,6 mm x 150 mm; 5 μm); pha động gồm nước:acetonitril với các điều kiện rửa giải khác nhau Chúng tôi tìm được điều kiện sắc ký tối ưu gồm chương trình chạy đẳng dòng, tỷ lệ pha động là nước:acetonitril = 50:50; tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl; detector UV tại bước sóng phát hiện
222 nm
Trang 3Hình 1: Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu bột ớt (b);
1: capsaicin, 2: dihydrocapsaicin
Sắc ký đồ thu được cho các píc tách rõ ràng, nhiễu nền thấp thể hiện qua sắc ký đồ
của mẫu bột ớt và chuẩn capsaicin và dihydrocapsaicin Trên sắc ký đồ, píc của mẫu
thử có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của píc capsaicin và dihydrocapsaicin
chuẩn với thời gian lưu 6,97 và 8,93 phút Tại thời gian lưu píc capsaicin và
dihydrocapsaicin trên các sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn, so sánh phổ hấp thụ UV thu
được của píc, kết quả: phổ mẫu thử và mẫu chuẩn trùng khít lên nhau với hệ số phù
hợp 0,9998 (hình 2) Chứng tỏ, píc thu được trên sắc ký đồ của mẫu thử tinh khiết và
các thành phần khác có trong mẫu thử không ảnh hưởng đến quá trình phân tích
capsaicin và dihydrocapsaicin
Hình 2: Phổ UV của chuẩn capsaicin và dihydrocapsaicin (a) và píc capsaicin và
dihydrocapsaicin được xác định trong mẫu bột ớt (b)
Trang 42 Thẩm định phương pháp định lượng
* Lựa chọn bước sóng:
Từ phổ UV của capsaicin và
dihydrocapsaicin, chúng tôi thấy: capsaicin
và dihydrocapsaicin đều có 2 đỉnh cực đại
tại 222 nm và 278,7 nm Kết quả đánh giá
tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) của capsaicin
và dihydrocapsaicin tại 2 bước sóng này
được thể hiện ở bảng 1
Bảng 1:
BƯỚC
SÓNG
Tại bước sóng 222 nm, píc capsaicin
và dihydrocapsaicin có tỷ lệ tín hiệu/nhiễu
cao nhất Vì vậy, chúng tôi lựa chọn bước
sóng này để phân tích capsaicin và
dihydrocapsaicin trong các mẫu bột ớt
* Tính tương thích của hệ thống sắc ký:
Khảo sát tính tương thích hệ thống sắc
ký dựa vào phân tích 5 lần một mẫu
chuẩn capsaicin trên máy HPLC với cùng
điều kiện đã nêu Đánh giá dựa vào sai
số tương đối và độ lệch chuẩn tương đối
của 5 phép thử song song đối với thời
gian lưu, diện tích píc
Bảng 2: Tính tương thích của hệ thống
sắc ký
(10 µg/ml)
THỜI GIAN LƯU (phút)
DIỆN TÍCH PÍC (mAU x min)
- Phương trình đường chuẩn, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):
Hòa tan capsaicin và dihydrocapsaicin trong methanol tới nồng độ 1.000 µg/ml được dung dịch chuẩn gốc Từ dung dịch gốc, pha các dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp để thiết lập đường chuẩn về mối liên hệ giữa diện tích píc capsaicin
và dihydrocapsaicin với nồng độ Phương trình tuyến tính được xây dựng dưới dạng y = ax + b Trong đó, y và x lần lượt tương ứng với diện tích píc và nồng độ capsaicin và dihydrocapsaicin Đối với giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), hòa loãng dung dịch chuẩn gốc tới nồng độ thích hợp với methanol
và tiêm vào hệ thống HPLC để phân thích Đánh giá LOD dựa trên píc thấp nhất có thể phát hiện trên sắc đồ có giá trị tỷ lệ tín hiệu/nhiễu bằng 3 Đánh giá LOQ dựa trên nồng độ thấp nhất có thể định lượng được có giá trị tín hiệu/nhiễu bằng 10
Hình 3: Đường chuẩn của capsaicin (a)
và dihydrocapsaicin (b)
Trang 5Bảng 3: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của capsaicin và dihydrocapsaicin
THAM SỐ
* Độ thu hồi:
Thí nghiệm độ thu hồi để đánh giá mức độ chính xác của phương pháp bằng cách thêm một lượng xác định chuẩn vào mẫu đã biết trước nồng độ Hỗn hợp được chiết
và phân tích ngay Chất chuẩn thêm vào được chuẩn bị ở 3 nồng độ khác nhau Tại mỗi nồng độ, tiến hành lặp lại 5 lần
Bảng 4: Độ thu hồi của capsaicin và dihydrocapsaicin
(ng/ml)
TỶ LỆ THU HỒI TRUNG BÌNH (%)
Capsaicin
Dihydrocapsaicin
* Độ đúng và độ chính xác (độ lặp):
Độ đúng và độ lặp lại trong ngày được thực hiện bằng cách phân tích dung dịch chuẩn 5 lần/ngày Độ đúng và độ lặp lại giữa các ngày được thực hiện bằng cách phân tích dung dịch chuẩn trong 5 ngày liên tiếp
Bảng 5: Độ đúng và độ lặp lại của capsaicin và dihydrocapsaicin
CHẤT
NỒNG ĐỘ BAN ĐẦU (ng/ml)
Nồng độ phát hiện (µg/ml) Độ đúng (%) Độ lặp (%)
Nồng độ phát hiện (µg/ml) Độ đúng (%) Độ lặp (%)
Capsaicin
Dihydrocapsaicin
Trang 63 Kết quả định lƣợng capsaicin và
dihydrocapsaicin trong các mẫu bột ớt
Định lượng capsaicin và dihydrocapsaicin
trong các mẫu bột ớt được thu mua tại các
khu vực khác nhau
Bảng 6: Hàm lượng capsaicin và
dihydrocapsaicin (mg/100 g) trong bột ớt
MẪU
Hàm lượng capsaicin và dihydrocapsaicin
thay đổi nhiều giữa các mẫu Hàm lượng
biến đổi trong khoảng 3,25 - 4,84 mg/g
đối với capsaicin và 1,55 - 2,88 mg/g đối
với dihydrocapsaicin trong mẫu bột ớt khô
Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu
trước đó [9]
KẾT LUẬN
Phương pháp HPLC để định lượng
capsaicin và dihydrocapsaicin trong bột ớt
(Capsicum sp, họ Cà - Solanaceae) được
phát triển và thẩm định đầy đủ, áp dụng
vào phân tích hàm lượng capsaicin và
dihydrocapsaicin trong các mẫu bột ớt thu mua trên thị trường Kết quả cho thấy hàm lượng của capsaicin và dihydrocapsaicin biến đổi nhiều giữa các mẫu thu mua trên thị trường
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đỗ Huy Bích và CS Cây thuốc và động
vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 2 NXB Khoa học Kỹ thuật 2004, tr.504-508
2 Đỗ Tất Lợi Những cây thuốc và vị thuốc
Việt Nam NXB Y học 2004, tr.382-384
3 Menéndez L, Lastra A, Hidalgo A, Baamonde A The analgesic effect induced by
capsaicin is enhanced in inflammatory states Life Sci 2004, May 14, 74 (26), pp.3235-3244
4 Kim CS, Kawada T, Kim BS, Han IS, Choe
SY, Kurata T, Yu R Capsaicin exhibits
anti-inflammatory property by inhibiting IkB-a degradation
in LPS-stimulated peritoneal macrophages Cell Signal 2003, Mar, 15 (3), pp.299-306
5 Oyagbemi AA, Saba AB, Azeez OI Capsaicin:
a novel chemopreventive molecule and its underlying molecular mechanisms of action Indian J Cancer 2010, Jan-Mar, 47 (1), pp.53-58
6 Joo JI, Kim DH, Choi JW, Yun JW
Proteomic analysis for antiobesity potential of capsaicin on white adipose tissue in rats fed with a high fat diet J Proteome Res 2010, Jun 4, 9 (6), pp.2977-2987
7 Negulesco JA, Young RM, Ki P Capsaicin
lowers plasma cholesterol and triglycerides of lagomorphs Artery 1985, 12 (5), pp.301-311
8 Yan-Wei Hu, Xin Ma, Jin-Lan Huang, Xin-Ru Mao, Jun-Yao Yang, Jia-Yi Zhao, Shu-Fen Li, Yu-Rong Qiu, Jia Yang, Lei Zheng mail, Qian Wang Dihydrocapsaicin atenuates paque
fomation through a PPARγ/LXRα pathway in apoE−/− mice fed a high-fat/high-cholesterol diet Plos One 2013, June, 8 (6),p.66876
9 Zeid Abdullah Al Othman, Yacine Badjah Hadj Ahmed, Mohamed Abdelaty Habila, Ayman Abdel Ghafar Determination of capsaicin and
dihydrocapsaicin in capsicum fruit samples using high performance liquid chromatography Molecules 2011, 16, pp.8919-8929