Phân bón sinh học chương 3

Khái niệm phân bón sinh học cố định nitơPhân bón sinh học cố định nitơ là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật có khả năng cố định nitơ tự do ; đã được tuyển chọn với mật độ đạt

Chương 3

PHÂN BÓN SINH HỌC

CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO

3.1 Vai trò của nitơ và quá

trình cố định nitơ

Vai trò của nitơ

Acid nucleic Acid amine  protein Cấu tạo của diệp lục tố

 Chiếm 0,3% - 5% khối lượng cây trồng

 Là thành phần quan trọng trong các chất hữu cơ cơ bản và cần thiết cho

sự sinh trưởng phát triển của cây như: protein, chất diệp lục, nguyên sinh

chất, axit nucleic (ADN và ARN), vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng.

 Cây chỉ có thể hấp thu đạm chủ yếu ở dạng NH4+ và NO3-.

 Khi được cung cấp đủ N, cây sinh trưởng nhanh, ra nhiều nhánh, phân

cành, ra lá nhiều; lá cây có kích thước to, màu xanh; lá quang hợp mạnh,

hoa quả lớn và nhiều  làm tăng năng suất cây.

Ví dụ: Khi bón trung bình 1 kg N cho cây, có thể thu được khoảng 15

kg hạt ở cây có hạt, 10 kg đường ở mía, 70 kg củ ở khoai tây hoặc 25

kg rơm rạ ở lúa.

 Thiếu N cây sẽ sinh trưởng kém, còi cọc, lá vàng, ít hoa và quả, năng

suất thấp.

 Thừa N, cây có thể phát triển mạnh nhưng mềm yếu, dễ đổ ngã, dễ nhiễm

sâu bệnh, hạt và quả có thể nhiều nhưng chất lượng kém.

Quá trình cố định nitơ

Quá trình cố định Nitơ phân tử nhờ VSV là quá trình khử N2 thành

NH3 Sau đó NH3 kết hợp với các axit hữu cơ trong cơ thể sinh vật

để tạo thành các axit amin chứa trong các phân tử protein

Quá trình cố định nitơ nhờ VSV

N2 + H2 + ATP NH(nitrogenase) 3 + ADP + P

VSV

NH3 + axit hữu cơ axit amin protein

Sự cố định nitơ chỉ xảy ra dưới xúc tác của enzym Nitrogenase

để khử phân tử nitơ thành NH3

3.2 Vi sinh vật cố định nitơ

3.2.1 Khái niệm về vi sinh vật cố định nitơ

Vi sinh vật cố định Nitơ là loại sinh vật có khả năng cố định nitơ tự do trong không khí và trong đất (cây trồng không hấp thu được) thành đạm dễ tiêu cung cấp cho đất và cây trồng

 VSV cố định nitơ theo kiểu không cộng sinh gồm:

Vi khuẩn Azotobacter

- Cố định nitơ theo kiểu không cộng sinh

- Là vi khuẩn gram âm

- Có khả năng cố định 15-20 Kg N/ha

- pH thích hợp: 7,2 – 8,2

- Nhiệt độ thích hợp: 28 – 300C

- Độ ẩm thích hợp: 40 – 60%

AZOTOBACTER

Cố đinh 15-20

kg N / ha

Thúc đẩy sự nảy mầm của hạt giống

Sinh chất kháng sinh thuộc nhóm Aniomycine

Tiết chất kích thích sinh trưởng thực

vật

Sinh một số axit hữu cơ: Axit nicotinic, axit pentothenic…

Hòa tan

photphate

Tiết một số vitamin nhóm B: B1, B6…

N 2 Fixation

End Previous Next

Tác dụng của phân bón sinh học từ Azotobacter

Tác dụng của phân bón sinh học từ Azotobacter

Loài cây trồng Phương pháp ủ với phân

bón chứa Azotobacter % năng suất gia tăng

Rễ cây họ đậu tiết các chất hấp dẫn vi khuẩn Rhizobium chuyển động đến và gắn vào vỏ rễ

Vi khuẩn tiết chất tạo

nốt sần và làm cong rễ

Vi khuẩn xâm nhiễm và nhân

lên trong nốt rễ

Sự có mặt của vi khuẩn trong rễ kích

thích tế bào rễ phân chia mạnh

Hệ rễ cây chủ phát triển dưới tác

dụng của vi khuẩn cộng sinh

Sinh khối thực

vật chủ gia tăng

Mối quan hệ cộng sinh hai bên cùng có lợi được thiết lập Vi khuẩn tiếp tục nhân lên Sinh trưởng, phát triển của cây chủ được

thúc đẩy

3.3 Phân bón sinh học cố

định nitơ

3.3.1 Khái niệm phân bón sinh học cố định nitơ

Phân bón sinh học cố định nitơ là sản phẩm chứa một

hay nhiều chủng vi sinh vật có khả năng cố định nitơ tự

do ; đã được tuyển chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn hiện

hành; khi bón cho cây trồng sẽ làm gia tăng năng suất,

chất lượng nông sản, tăng độ phì nhiêu của đất và không

ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái

3.3.2 Sản xuất phân bón sinh học cố định nitơ

Quy trình chung

Lên men giống cấp 1,2,3

Chế phẩm VSV dạng rắn

Sinh khối VSV

Tối ưu điều kiện nhân giống, lên men

Phân lập chủng VSV cố định nitơ Tuyển chọn chủng có hoạt tính mạnh, hữu ích

Xử l{ sinh khối VSV sau khi lên men

3.3.2.1 Phân lập chủng vi sinh vật cố định nitơ

1 Thu thập mẫu dùng cho phân lập: Mẫu được thu thập phải có sự phân bốphổ biến của loại VSV cố định nitơ cần phân lập

2 Chuẩn bị môi trường phân lập: Môi trường phân lập phải chứa các yếu tốgiúp chọn lọc được loại VSV cố định nitơ, thường dùng là môi trường trongthành phần không chứa nguồn nitơ Môi trường phải được khử trùng trước khi

sử dụng

3 Pha loãng mẫu đất đã thu thập

4 Cấy dịch đã pha loãng lên môi trường phân lập để tạo các khuẩn lạc riêng rẽcủa các loại VSV cố định nitơ

5 Nuôi dưỡng các đĩa cấy trong điều kiện thích hợp về nhiệt độ, độ ẩm

6 Kiểm tra sự tạo thành khuẩn lạc của các VSV cố định nitơ

Các bước

3.3.2.1 Phân lập chủng vi sinh vật cố định nitơ

 Thu thập mẫu đất tại những nơi trồng lúa, ngô

 Chuẩn bị môi trường phân lập

Thường sử dụng môi trường Asby có các thành phần:

Glucoza 20gK2HPO4 0.5gMgSO4 7H2O 0.2gNaCl 0,2gCaCO3 5gK2SO4 0,1gThạch 20gNước cất 1 lít

pH 7,0 – 7,2

 Pha loãng mẫu đất đã thu thập

 Cấy dịch đã pha loãng lên môi trường đặc trưng dành cho Azotobacteria

 Nuôi dưỡng các đĩa cấy trong điều kiện thích hợp về nhiệt độ (28 – 300C)

3.3.2.1 Phân lập chủng vi sinh vật cố định nitơ

Ví dụ 1: Phân lập vi

khuẩn Azotobacteria

Không chứa nitơ

3.3.2.1 Phân lập chủng vi sinh vật cố định nitơ

Thu thập mẫu nốt rễ ở các cây họ đậu

Chuẩn bị môi trường phân lập

Thường sử dụng môi trường Asby có các thành phần:

Mannitol 10 0 gK2 HPO4 0 5 g

Mg SO4 7H2 O 0 2 gNaCl 0 1 gDịch nấm men 0 5 guôAgar 20 0 gConggo đỏ 0,025%

Nước cất 1000 mlpH: 6,5 – 7,5

Khử trùng bề mặt nốt rễ bằng hóa chất (ethanol 70% )

Nghiền mẫu nốt rễ bằng cối, chày sứ vô trùng

Pha loãng mẫu đất đã thu thập

Cấy dịch đã pha loãng lên môi trường đặc trưng dành cho Rhizobium

Nuôi dưỡng các đĩa cấy trong điều kiện thích hợp: 25 – 380C, trong 48

– 72 giờ, đến khi quan sát thấy các khuẩn lạc riêng rẽ trong môi trường

Ví dụ 1: Phân lập vi

khuẩn Rhizobium

Không chứa nitơ

3.3.2.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật cố định nitơ

Mục đích

 Muốn có chế phẩm phân bón sinh học có khả năng cố định nitơ tự do tốt,cần tuyển chọn được chủng VSV có cường độ cố định nitơ cao, sức cạnh tranhlớn, thích ứng với điều kiện pH, nhiệt độ rộng, phát huy được ở nhiều vùngsinh thái khác nhau, không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người, vật nuôi vàmôi trường sinh thái

 Việc tuyển chọn được chủng VSV cố định nitơ mang nhiều đặc điểm quýnhư trên là công đoạn không thể thiếu trong quy trình sản xuất chế phẩmPBSH cố định nitơ

Chỉ tiêu cần tuyển chọn

 Cường độ cố định nitơ phân tử cao

 Khả năng sinh trưởng của VSV: thời gian mọc, kích thước khuẩn lạc, kíchthước tế bào VSV

 Điều kiện sinh trưởng, phát triển: nhu cầu dinh dưỡng, nhu cầu oxy, pHthích hợp, nhiệt độ thích hợp

 Khả năng cạnh tranh: với các loài VSV khác

 Chủng VSV đã được tuyển chọn sẽ được bảo quản bằng phương phápthích hợp và được sử dụng như giống gốc cho sản xuất chế phẩm phân bónsinh học

2.3.2.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật cố định nitơ

Tiêu chuẩn về

chủng, giống

Chủng VSV được tuyển chọn là tốt nếu tích hợp được nhiều đặc tính ưu việt như:

- Có cường độ cố định nitơ phân tử cao

- Có khả năng sử dụng các nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền như các phế phụ phẩm, nguyên liệu thô, phế thải… như nguồn cơ chất

- Có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt trong phạm vi pH , nhiệt độ rộng.

- Có các đặc tính khác: Sinh chất kích thích sinh trưởng, sinh chất kháng nấm, bệnh hại

3.3.2.3 Tối ưu điều kiện nuôi cấy vi sinh vật cố định nitơ

hợp cho các VSV cố định nitơ Trong môi trường phải có đầy đủ nguồn cacbon, muối đa và vi lượng, các chất kích thích sinh trưởng, các chất cảm ứng tổng hợp nitơ Thành phần môi trường có giá thành càng rẻ càng tốt.

Azotobacteria pH thích hợp trong khoảng 7,2 – 8,2 Với Rhizobium pH thích hợp nằm trong khoảng 6,5 – 7,5

cho quá trình tăng sinh Do vậy, cần nuôi cấy nhân sinh khối VSV ở khoảng nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ nuôi nếu quá thấp hoặc quá cao đều có thể gây ức chế phát triển, thậm chí có thể gây chết chủng, giống

trong quá trình nuôi Để tăng cường lưu lượng oxy hòa tan trong môi trường, có thể nuôi VSV trong điều kiện lắc hoặc có sục khí.

4 giai đoạn: Pha tiềm ẩn (không tăng sinh khối), pha phát triển mạnh (gia tăng sinh khối theo cấp số nhân), pha cân bằng (không tăng sinh khối), pha suy giảm (Số lượng VSV sống suy giảm) Do vậy, cần xác định thời gian dừng nhân giống, lên men thích hợp, đặc biệt trong quá trình nhân giống phải dừng nhân giống khi VS V đang ở pha phát triển mạnh, không được để giống già hoặc tạo bào tử.

3.3.2.4 Nhân giống vi sinh vật cố định nitơ

3.3.2.4 Nhân giống vi sinh vật cố định nitơ

- Nhân giống cấp 1: Cấy các chủng giống từ ống nghiệm vào bình tam giác chứa môi trường nhân giống cấp 1 thích hợp cho từng chủng Nuôi cấy lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp Sau khoảng 12 - 24 giờ nuôi cấy thu được giống cấp 1.

- Nhân giống cấp 2: Cấy các chủng giống cấp 1 sang bình tam giác khác chứa môi trường nhân giống cấp 2 Nuôi cấy lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp Sau khoảng 12 - 24 giờ nuôi cấy thu được giống cấp 2.

- Trong quá trình nhân giống phải đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sinh trưởng, sinh sản của VSV.

- Các môi trường dùng để nhân giống VSV đều phải được khử trùng trước khi tiến hành nhân giống.

Các bước

Có thể nhân giống 1 hoặc 2 cấp

3.3.2.5 Lên men sản xuất sinh khối vi sinh vật cố định nitơ

- Nhằm tạo ra khối lượng lơn sinh khối VSV cố định nitơ

- Có thể lên men trên cơ chất rắn hoặc lỏng

- Tiến hành lên men tạo sinh khối VSV ở điều kiện thích hợp về thành phần môi trường, pH môi trường, nhiệt độ

3.3.2.6 Thu hồi, xử lý sinh khối vi sinh vật cố định nitơ

- Sinh khối VSV cố định nitơ phải được thu hồi ở thời điểm phát triểnmạnh

- Thu hồi sinh khối VSV bằng phương pháp ly tâm với tốc độ 5000 –

10000 vòng/phút hoặc lọc qua vải thô có lót chất mang giữ VSV trên bềmặt vải lọc

3.3.2.7 Chuẩn bị chất mang và các phụ gia

Yêu cầu đối với chất mang

- Phải dễ kiếm, dễ sử dụng, rẻ tiền

-Có khả năng hút nước cao (150 – 200%)

- Hàm lượng cacbon hữu cơ cao (> 60%)

- Hàm lượng muối khoáng không vượt quá 1%

- Chứa đủ các chất dinh dưỡng và các yếu tố môi trường thích hợp choVSV hoạt động trong thời gian dài (3 – 6 tháng)

- Kích thước hạt nhỏ

- Chất mang có thể được khử trùng hoặc không khử trùng

3.3.2.7 Chuẩn bị chất mang và các phụ gia

Các loại chất mang hay sử dụng để sản xuất chế phẩm PBSH cố định nitơ

- Than bùn phơi khô: Là loại chất mang được sử dụng nhiều nhất Thanbùn được hình thành do sự tích tụ và phân huỷ không hoàn toàntàn dư thực vật trong tự nhiên Tàn dư xác thực vật trong than bùnkhông bị phân giải triệt để nên vẫn tích lũy lượng lớn chất hữu cơ (15%

- 35%)

- Đất có nhiều mùn hoặc đất phù sa khô

- Đá trầm tích Điatomit với thành phần chủ yếu là silic oxyt: Cónhiều lỗ xốp và tính trơ

- Các loại vật liệu chứa nguồn hữu cơ: Cám gạo, cám mì, bột ngô, trấu(Các loại vật liệu này phải chọn loại khô, không bị mốc)

Các loại chất phụ gia

-NPK

- Đường: Glucose, Saccharose

3.3.2.7 Chuẩn bị chất mang và các phụ gia

-Với than bùn: Phơi khô, sau đó đập hoặc nghiền nhỏ, có thể loại bỏcác tạp chất lớn qua sàng

- Với cám, gạo, ngô, trấu: Loại bỏ các tạp chấp như mảnh vụn kim loại,thủy tinh, nilon

- Có thể khử trùng chất mang hoặc không khử trùng chất mang

Xử lý chất mang

Phối trộn chất mang + chất phụ gia

- Chất mang than bùn (hoặc đất, hoặc cám gạo…) được bổ sung 1 – 2%vôi bột, 01% lân supephotphat, 1% đường saccharose

3.3.2.8 Tạo sản phẩm phân bón sinh học cố định nitơ

Các bước

1 Phối trộn vi sinh vật với chất mang

Theo tỉ lệ nhất định, thường là: Vi sinh vật 3 - 5%; chất mang + chất phụ

gia 95 - 97%

(Vi sinh vật cố định nitơ có thể sử dụng chỉ 1 loại hoặc 1 -3 loại Nếu sử

dụng nhiều loại VSV thì chúng phải không ức chế nhau)

2 Ủ hoạt hóa vi sinh vật trong chất mang

Sau khi phối trộn VSV với chất mang, cần ủ hoạt hóa VSV trong 7 – 14 ngày,

ở 28 – 30 o C nhằm ổn định VSV trong chất mang Sau khi ủ hoạt hóa, mật

độ VSV trong chế phẩm tối thiểu phải đạt 10 7 – 10 8 CFU/g

3 Đóng gói, bảo quản chế phẩm

- Sản phẩm phân bón sinh học cố định nitơ dạng bột nên được đóng gói trong túi nilon tối màu, bảo quản nơi khô ráo, tránh ánh nắng trực tiếp

- Trước khi đóng gói có thể sấy chế phẩm ở nhiệt độ 40 – 45 o C đến khi

độ ẩm trong chế phẩm còn khoảng 7%

3.3.2.9 Yêu cầu về chất lượng chế phẩm PBSH cố định nitơ

Sản phẩm PBSH cố định nitơ phải có chất lượng đáp ứng các tiêu chí sau:

- Về mật độ tế bào vi sinh vật cố định nitơ: Tùy theo điều kiện của từngquốc gia, mật độ VSV cố định nitơ trong 1 gam chế phẩm dạng bột hoặc 1mililit chế phẩm dạng lỏng có thể dao động từ 107 – 109đối với chế phẩmtrên nền chất mang khử trùng và 105 – 106 trên nền chất mang không khửtrùng Theo tiêu chuẩn Việt Nam, mật độ VSV cố định nitơ trong phân bónphải đạt trên 108 CFU/g đối với chế phẩm trên nền chất mang khử trùng và

105 CFU/g đối với chế phẩm trên nền chất mang không khử trùng

- Đối với cây trồng: Phải có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng, phát triểncây trồng; nâng cao được năng suất, chất lượng cây trồng

- Đối với đất, môi trường sinh thái: Nâng cao độ phì của đất; không ảnhhưởng xấu đến môi trường sinh thái