Lý thuyết thực tập Nuôi cấy mô

Định nghĩa• Nuôi cấy mô thực vật là phương pháp tách rời một bộ phận sạch của cây mô, tế bào… đem nuôi cấy trong môi trường thích hợp và cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng trong điều kiện

Lý thuyết Thực tập Chuyên

ngành Di truyền - SHPT

Nuôi cấy mô thực vật

• Vấn đề 4: Nhu cầu dinh dưỡng của mô cấy

• Vấn đề 5: Pha dung dịch mẫu – Pha môi trường nuôi cấy

• Vấn đề 6: Chất điều hòa tăng trưởng thực vật

• Vấn đề 7: Lựa chọn mẫu cấy và các phản ứng của mẫu cấy

• Vấn đề 8: Cấy chuyền

• Vấn đề 9: Các chất ức chế, sự nhiễm trùng và phương pháp xử lí

VẤN ĐỀ 1 : GIỚI THIỆU CHUNG VỀ

NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

I Định nghĩa

II Cơ sở khoa học

III.Mục tiêu

IV.Ứng dụng

I Định nghĩa

I Định nghĩa

I Định nghĩa

• Nuôi cấy mô thực vật là phương pháp tách rời một bộ phận sạch của cây (mô, tế bào…) đem nuôi cấy trong môi trường thích hợp

và cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng tuyệt đối để chúng tiếp tục phân bào rồi biệt hóa thành mô, cơ quan (cụm chồi, chồi…) và phát triển thành cây mới.

II Cơ sở khoa học

Tế bào thực vật có tính toàn năng

II Cơ sở khoa học

• Tế bào thực vật có khả năng phân hóa để đảm nhận các chức năng khác nhau và phản phân hóa tế bào để trở về dạng phôi sinh tiếp tục phân chia

Tế bào phôi sinh

Quá trình phân hóa

Tế bào chuyên hóa (rễ, thân, lá)

Quá trình phản phân hóa

Sơ đồ sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Sơ đồ sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Tế bào hợp tử Tế bào phôi sinh

Tế bào chuyên hóa

Tế bào phôi sinh

Tế bào chuyên hóa

Quá trình phân hóa

Quá trình phản phân hóa

• Tạo quần thể lớn và đồng nhất trong thời gian tương đối ngắn

• Tạo được nhiều cây con từ mô hoặc cơ quan của cây (lóng thân, phiến lá, hoa, hạt phấn, chồi phát hoa…)

• Làm sạch mầm virus bằng cách cấy mô phân sinh ngọn

• Cải biến giống cây trồng bằng đa bội hóa mô cấy, gây đột biến nhân tạo, cấy tế bào trần…

III Mục tiêu

IV Ứng dụng

• Nhân giống vô tính (nhân giống sinh dưỡng, vi nhân giống)

- Tạo cụm chồi trực tiếp

- Tạo cụm chồi gián tiếp từ callus

- Tạo phôi sinh dưỡng

• Nhân giống hữu tính

VẤN ĐỀ 2 : PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT VÀ

I Phòng chuẩn bị mẫu

I Phịng chuẩn bị mẫu

Autoclave xách tay Autoclave phòng thí nghiệm

I Phòng chuẩn bị mẫu

II Phòng cấy

• Không cửa sổ

• Vách không trực tiếp với bên ngoài

• Có máy điều hòa

• Đèn huỳnh quang, đèn UV

300 mm

450 mm

300 mm

450 mm

400

mm

1000 mm

200 mm

300 mm

450 mm

400

mm

TUÛ CAÁY

III Phòng nuôi

Đảm bảo vô trùng

Chịu nhiệt;

Cho ánh sáng đi qua

Lưu giữ độ ẩm đảm bảo tiểu khí hậu

Đảm bảo thông khí với môi trường bên ngoài

Bình nuôi

Một số dụng cụ, trang thiết bị cho phòng thí

nghiệm nuôi cấy mô thực vật

Một số dụng cụ, trang thiết bị cho phòng thí

nghiệm nuôi cấy mô thực vật

• Nút màng polyethylen chịu nhiệt

• Nút bông

• Cao su chịu nhiệt

• Nhựa chịu nhiệt

Một số dụng cụ, trang thiết bị cho phòng thí

nghiệm nuôi cấy mô thực vật

PIPETMAN

BÌNH ĐONG, ỐNG ĐONG

CÂN KỸ THUẬT CÂN PHÂN TÍCH

MÁY ĐO PH

KÍNH HIỂN VI

KÍNH LÚP

TỦ ẤM TỦ NUÔI

MÁY LẮC BỒN ỔN NHIỆT

DỤNG CỤ THUỶ TINH

BẾP TỪ LÒ VI SÓNG

DAO VÀ KẸP KIM LOẠI

• Các muối vô cơ

Một số hóa chất cần cho phòng thí nghiệm

nuôi cấy mô thực vật

VẤN ĐỀ 3: SỰ VÔ TRÙNG

I Ý nghĩa của sự vô trùng

II Các phương pháp vô trùng

I Ý nghĩa của sự vô trùng

• Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm,khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi

Sự vô trùng là điều kiện cần thiết để thành công trong việc nuôi cấy mô thực vật

2 Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave

• Điều kiện hấp khử trùng: 1atm và 103oC /

Dao, kẹp, đĩa petri, cốc thủy tinh (becher), bông gòn

Bình mẫu bị nhiễm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…

II Các phương pháp vô trùng

Một số loại nồi khử trùng thông dụng

KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG

2 Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave

II Các phương pháp vô trùng

Nắp nồi

Ốc vặn

Đồng hồ áp suất

Van an toàn Buồng hấp Phểu châm nước

Mực châm nước

Van xả nước

Van xả hơi

2 Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave

II Các phương pháp vô trùng

- Xả hơi để đuổi không khí (khi đạt 0,5 atm hay 0,5 kg/cm 2 )

- Tiếp tục nâng nhiệt cho đến nhiệt độ cần khử trùng là 121 o C (1 atm hay 1 kg/ cm 2 )

- Giữ ổn định nhiệt độ trên đến khi hết thời gian khử trùng.

- Tắt điện hoặc nguồn cung cấp nhiệt.

- Để cho áp suất trong nồi trở về không hoặc xả hơi thật chậm

- Mở nắp nồi.

- Để 10 – 15 phút (cho sấy khô giấy gói hoặc nút bông)

2 Vơ trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave

II Các phương pháp vơ trùng

CÁCH TIẾN HÀNH

• Cồn 90 o , 70 o: Làm biến tính protein

→ Diệt vi khuẩn, nấm nhưng không diệt bào tử

• NaClO, Ca(ClO) 2 → Javel

→ Oxy hóa của Cl → Phát hủy vách tế bào → Diệt vi khuẩn

• CuSO 4 , AgNO 3 , HgCl 2 …

→ Kim loại nặng đều có tính kháng khuẩn mạnh

→ Cơ chế: Ức chế sự sao chép DNA của vi khuẩn

3 Vô trùng bằng hóa chất

II Các phương pháp vô trùng

Tùy loại mẫu và kích thước mẫu mà thay đổi nồng độ và thời gian khử mẫu

• Mở đèn UV trước khi cấy khoảng 15 – 30 phút

• Khử trùng không khí trong phòng cấy hoặc tủ cấy

4 Vô trùng bằng đèn UV

II Các phương pháp vô trùng

Lý do phải khử trùng bằng màng lọc

Nguyên tắc khử trùng bằng màng lọc.

Ưu diểm: nhanh, không thay đổi thành phần môi trường

Nhược điểm: đắt, rât khó ứng dụng cho các dung dịch có độ nhớt cao

KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG

5 Vô trùng bằng màng lọc

II Các phương pháp vô trùng

VẤN ĐỀ 4: NHU CẦU DINH DƯỠNG

CỦA MẪU CẤY

I Yếu tố hóa học

II Yếu tố vật lý

1 Nước

• Nước cất hoặc nước khử ion

I Yếu tố hóa học

• Vai trò:

Vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ

Thành phần không thể thiếu của nhiều enzyme

Cân bằng áp suất thẩm thấu, duy trì thế điện hoá của thực vật

2 Muối khoáng

I Yếu tố hóa học

I Yếu tố hóa học

Vitamin nhóm B – Bổ sung vào phần thiếu hụt của tế bào

B 1 (Thiamin hydrocloride); B 2 : Riboflavin

B 5 (Panthotenic acid); Biotin: Cần thiết cho phân bào.

B 3 (Panthotenate de calcium), B 6 (Pyridoxine HCl)

PP (acid nicotinic), Myo-Inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào

4 Vitamin

Mô thực vật chủ yếu sống bằng phương pháp dị dưỡng,

có thể tổng hợp chất hữu cơ nhờ quang hợp

Thường dùng đường sucrose, có thể dùng glucose Fructose, malnose kém hiệu quả.

Manitol, sorbitol: Dùng để ổn định áp suất thẩm thấu Các nguồn carbon khác kém hiệu quả

3 Nguồn cacbon

Malt extract: Dịch trích từ lúa đại mạch, rỉ đường, mạch nha

Bột chuối nghiền; Bột khoai tây nghiền Dich chiết cà rốt, cà chua, khóm; Dịch chiết nấm men

Dich thuỷ phân casein, casein hydrolysat

Tuy vậy có tác dụng rất tốt trong nuôi cấy mô tế bào Thành phần hoá học: Kích thích sinh trưởng-kinetin, auxin, acid amin tự do, protein, peptid, đường, axit hữu cơ, myo- inositol …

Chất điều hòa sinh trưởng

Giá thể

Thạch (Agar) là giá thể phổ biến

Là một loại polysacharide chiết xuất từ tảo.

Hoà tan ở trong 80 o C.

ở 40 o C trở về trạng thái gel- nửa cứng Ngoài ra còn có một số chất giá thể khác như phytagel, agarose Nồng độ: 0.6 – 1%

pH MÔI TRƯỜNG

Là yếu tố cực kỳ quan trọng trong môi trường

pH ảnh hưởng đến các yếu tố sau:

• Sự tương tác giữa các chất, đặc biệt là trong quá trình khử

trùng

• Rất quan trọng đối vơi việc thuỷ phân agar pH càng thấp thì

môi trường càng lỏng.

• Ảnh hưởng đến các vitamin và các chất hữu cơ

• Trước khử trùng: pH = 5.5 – 5,7 (trừ các thí nghiệm đặc biệt).

• Sử dụng KOH, NaOH để điều chỉnh độ pH.

• Trong quá trình nuôi cây pH giảm dần (môi trường chua hoá)

I Yếu tố hóa học

Ánh sáng

Đòi hỏi đối với nguồn sáng

Phát sinh cơ quan, hình thành cây

Cường độ

2800 - 3000 lux

Chu kỳ chiếu sáng 16/24;

hoặc 18/24

Chất lượng quang phổ: dải tần

Vai trò của ánh sáng

Kích thích

tạo diệp lục

Cung cấp chất dinh dưỡng cho cây

Ảnh hưởng đến phát sinh hình thái

Khi tạo callus, tạo củ, lưu giữ quỹ gen- cần cường độ

ánh sáng thấp

I Yếu tố vật lý

-Có cường độ chiếu sáng tương đối đồng đều cho

một mục đích sử dụng.

-Dùng ánh sáng lạnh để chống tăng nhiệt độ – thông

dụng là đèn huỳnh quang

- Sử dụng thiết bị tắt mở tự động để tắt bật ánh sáng theo chu kỳ định trước, thường là 16 giờ chiếu sáng/

8 giờ tối

Phương pháp bố trí ánh sáng trong phòng thí nghiệm

I Yếu tố vật lý

Vai trò của nhiệt độ: Duy trì sự phát triển bình thường của thực vật Tuỳ theo mục đích người ta sử dụng các chế độ nhiệt độ khác nhau để sự sinh trưởng và phát triển của thực vật được tối ưu

Phương pháp duy trì nhiệt độ phòng nuôi

Ở Xứ lạnh – chủ yếu phải tăng nhiệt độ bằng sưởi,

Ở Việt Nam – phải giảm nhiệt độ bằng điều hoà

Ưu điểm: diện tích sử dụng lớn, giá

thành rẻ Thường dùng cho các mục

đích chung, sản xuất đại trà

I Yếu tố vật lý

Được duy trì nhờ bình nuôi Thường là độ ẩm bão hoà

Mở hẳn nút 2-3 ngày trước khi đưa cây ra ngoài

để độ ẩm gần với độ ẩm tự nhiên

I Yếu tố vật lý

Độ ẩm khoảng 70%

• Môi trường đặc: đặt sát mặt môi trường hoặc cắm vào thạch 1/3 mẫu vật.

VẤN ĐỀ 5: PHA DUNG DỊCH MẪU –

PHA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

I Pha dung dịch mẫu

II Pha môi trường nuôi cấy

I Pha dung dịch mẫu (Pha dung dịch mẹ)

• Dung dịch mẫu là dung dịch pha sẵn và bảo quản trong tủ lạnh.

• Có nồng độ cao gấp 10 – 100 lần.

• Thuận tiện khi pha môi trường.

• Đảm bảo độ chính xác các thành phần hóa chất đủ với nồng độ thấp.

Tại sao phải pha dung dịch mẫu?

I Pha dung dịch mẫu (Pha dung dịch mẹ)

Pha dung dịch mẫu của

MÔI TRƯỜNG MURASHIGE & SKOOG (1962)

(MS)

chứa muối khoáng đa lượng

Skoog II, Skoog III: Dung dịch

chứa muối khoáng vi lượng

CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG

• Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi truờng White, Knop và Knudson C, Blaydes…

• Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg …

• Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962)…

Khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, nên thăm dò so sánh 3 loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu phù hợp với loại môi trường nào nhất, sau đó điều chỉnh các thành phần dinh dưỡng

II Pha môi trường nuôi cấy

• Thành phần môi trường cấy đã được các nhà khoa học nghiên cứu.

• Tùy đối tượng nghiên cứu có một môi trường nuôi cấy thích hợp

• Môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào:

Đối tượng nuôi cấy

Giai đoạn nuôi cấy

Mục đích nuôi cấy

• Cân hóa chất chính xác.

• Mỗi loại hóa chất phải dùng muỗng mút riêng

• Cho nước cất vào bình → Cho hóa chất vào tuần

tự và khuấy đều → Thêm nước cất cho đủ thể tích

• pH chính xác (hiệu chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)

• Bổ sung agar → Đun → Cho vào erlen, ống nghiệm…

• Hấp khử trùng

II Pha môi trường nuôi cấy

CÁCH TIẾN HÀNH

VẤN ĐỀ 6: CHẤT ĐIỀU HÒA TĂNG

TRƯỞNG THỰC VẬT (GROWTH REGULATOR)

I Vai trò của chất điều hòa tăng

trưởng thực vật

II Các chất điều hòa tăng trưởng

thực vật thường dùng

I Vai trò của chất điều hòa tăng

trưởng thực vật

• Bên cạnh các chất dinh dưỡng cần cho mô nuôi cấy, việc bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật cũng cần thiết để:

Kích thích sự tăng trưởng, phát triển mẫu cấy.

Phân hóa cơ quan.

Cung cấp sức sống cho mô và các tổ chức.

• Yêu cầu đối với chất điều hòa tăng trưởng thực vật tùy từng loại thực vật, loại mô và sự hiện diện chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh ở từng giai đoạn phát triển của mẫu cấy

II Các chất điều hòa tăng trưởng

 Auxin tự nhiên: AIA (Acid Indol Acetic)

 Auxin tổng hợp: AIB (Acid Indol Butyric); ANA (Acid Naphtyl Acetic); 2,4-D

α-II Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng

• Phân chia tế bào

• Tế bào phân chia chiều dọc

• Ức chế tạo chồi bên

• Liên quan đế sự phân hóa mô dẫn, tạo phôi soma

• Nồng độ thấp: Kéo dài lóng thân, rễ, kích

• Nồng độ cao:

Kích thích sự tạo sẹo tại vùng bị tổn thương

Nhân nhanh sinh khối mô sẹo

• Được tổng hợp từ rễ, di chuyển lên ngọn và tích tụ

ở ngọn→ Trên đường di chuyển, nó phá vỡ “Ưu thế ngọn” và kích thích sự tạo chồi bên

• Nồng độ sử dụng: 0,1 – 10 mg/l

• Các dạng cytokinin:

Trong tự nhiên: Zeatin

Tổng hợp: BAP (BA – Benzyl Aminopurine), Kinetine, Adenine, TDZ (vừa có tính chất của auxin, vừa có tính chất của cytokinin)

2 Cytokinin

II Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng

• Kích thích mau sự phân chia tế bào

• Tế bào tăng trưởng theo đường kính

• Nồng độ thấp: Cảm ứng sẹo, tái sinh

Tương tác giữa các nhóm

Cytokinin và Auxin

• Trong cơ thể thực vật các auxin và cytokinin không bao giờ tác dụng riêng rẽ mà luôn luôn tác dụng phối hợp

• Tác dụng phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát sinh, phát triển của

tế bào

Tỷ lệ A/C > 1 → Hình thành rễ

Tỷ lệ A/C < 1 → Phân hoá chồi

Tỷ lệ A/C = 1 → Mô sẹo

• Trao đổi chất của auxin ảnh hưởng đến trao đổi chất cytokinin và ngược lại

VẤN ĐỀ 7: LỰA CHỌN MẪU CẤY VÀ

CÁC PHẢN ỨNG CỦA MẪU CẤY

I Quy trình nuôi cấy mô thực vật

II Yêu cầu của mẫu cấy

III.Khử trùng mẫu cấy

IV.Cấy mẫu

V Phản ứng của mẫu cấy

I Quy trình nuôi cấy mô thực vật

• Trồng cây con ra chậu

I Quy trình nuôi cấy mô thực vật

• Cây khỏe mạnh, phát triển tốt, không sâu bệnh.

• Lấy các bộ phận non.

• Mẫu được chọn có thể là: đốt thân, lá non, trái, cọng phát hoa, đỉnh sinh trưởng…

• Kích thước không quá nhỏ, không quá lớn

II Yêu cầu của mẫu cấy

IV Cấy mẫu

Môi trường đặc Thao tác cấy tương

đối đơn giản

• Chỉ có phần tiếp xúc với môi trường là hấp thu chất dinh dưỡng

• Chất thải do mô tập trung quanh mô cấy

• Chất dinh dưỡng lắng

→ Gây độ lệch về chất dinh dưỡng trong môi trường

Thao tác phức tạp

V Phản ứng của mẫu cấy

Mỗi mẫu cấy có phản ứng khác nhau tùy thuộc:

• Loại mô: Mô có tổ chức, mô không có tổ chức

• Thành phần môi trường nuôi cấy

Tạo thể chồi (Protocrom)

Tạo phôi vô tính (phôi soma)

V Phản ứng của mẫu cấy

• Giúp mẫu cấy sống và tăng trưởng chồi → Kích thích chồi tạo rễ cây con → Cần auxin và gibberelin.

• Nhân nhanh cụm chồi → Tách rồi các chồi → Cấy sang môi trường tăng trưởng → Tạo rễ

→ Cần 3 loại môi trường: Môi trường nhân chồi

(cytokinin: số chồi tỉ lệ thuận với nồng độ cytokintin

và tỉ lệ nghịch với chiều cao chồi), tăng trưởng (auxin, gibberelin), tạo rễ (auxin hoặc môi trường căn bản).

1 Mẫu cấy có tổ chức

V Phản ứng của mẫu cấy

Mục đích

1 Mẫu cấy có tổ chức

V Phản ứng của mẫu cấy

• Cấy đỉnh sinh trưởng (Đỉnh sinh trưởng gồm vùng tận ngọn là sinh mô chờ đợi, vùng phân mô này phân cắt khi cấy bắt đầu trổ hoa) Mảnh cấy tốt nhất có hai phác thể lá.

• Cấy đỉnh chồi: Cắt ngang phần ngọn thân, cấy vào môi trường → Giâm cành vi mô

• Cấy mầm bên (mầm ngủ): Tạo một chồi hoặc cụm chồi không đều nhau

• Dễ khử trùng

• Môi trường cấy đơn giản và dễ thành công

• Các cây con thường giữ đặc tính di truyền của cây mẹ

• Lóng, lá, rễ, biêu bì, lá đài, cánh hoa, nhị đực…

Có thể phát triển chồi, cụm chồi trực tiếp

Qua trung gian: Tạo mô sẹo

Mô sẹo đặc: Tiếp tục tái sinh chồi, thể chồi, rễ…

Mô sẽo xốp: Sẽ bị thoái hóa dần (hóa nâu) rồi chết

• Đặc biệt, hiện nay, nuôi cấy rễ được phát triển mạnh nhằm mục đích nhân sinh khối rễ, sau đó li trích thu nhận các hợp chất tinh dầu có giá trị

2 Mẫu cấy không có tổ chức

III Phản ứng của mẫu cấy