lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phần I : Cơ sở lý thuyết 1 - Khái niệm : S ắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là châït lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chi

Phần I : Cơ sở lý

thuyết HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là

phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid

Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và

hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay nó áp dụng

rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thuốc Và nó

hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng

Phần I : Cơ sở lý

thuyết

1 - Khái niệm : S ắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương

pháp chia tách trong đó pha động là châït lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn ,hay một

chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế

hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử )

2- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột :

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký

Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo

Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion

Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký

sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác Chất phân tích A

+B+C

F2F3

F1

Phần I : Cơ sở lý

thuyết

Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu

giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) và ngược lại

Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi

03 lực F1,F2,F3 Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn

Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra

khỏi cột

Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là

khác nhau ,Kết quả là các chất khác nhau sẽ di

chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột ( như hình dưới đây )

+ Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân

như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau

Phần I : Cơ sở lý

thuyết

4 - Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

Kết quả của quá trinh tách các chất

được Detector phát hiện ghi thành sắc ký

đồ như hình trên

tr2

To : Thời gian lưu chết

t’ r1 : Thời gian lưu thực chất A

t’ r2 : Thời gian lưu thực chất B

tr1 : Thời gian lưu chất A

tr2 : Thời gian lưu chất B

Phần I : Cơ sở lý

thuyết

Từ các thông số của các peak trên đây ,nhiều đại

lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lơiü cho quá trình phân tích sắc ký.

4.1 Thời gian lưu thực t’ r : Retention time

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi

bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng

một điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy thời gian

lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :

+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh.

+ Bản chất ,thành phần,tốc độ của pha động

+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách

kém ,còn nếu tr quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của Peak rất kém ,thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi,hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém.

Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày

4.2 Hệ số dung lượng K’ : Capacity Factor

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng

chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng

K ’ = ( t R - t 0 )/ t 0

Nếu K ’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém

Nếu K ’ lớn thì Peak bị doãng Trong thực tế K ’

từ 1- 5 là tối ưu

Phần I : Cơ sở lý

thuyết

4.3 - Độ chọn lọc  :

Độ chọn lọc  cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký ,khi 02 chất A ,B có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng

tách ,mức độ tách biểu thị ở Độ chọn

lọc 

 = K’B / K’A Với điều kiện K’B > K’A

với  càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ

Phần I : Cơ sở lý

thuyết

4.2 Số đĩa lý thuyết N:

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H ,Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồìng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố :

+ Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh

+ Tốc độ và độ nhớt ( độ phân cực )của pha động

+ Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột

Vì vậy với một điều kiên sắc ký xác định thì chiều cao

H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số

đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định.

Phần I : Cơ sở lý

thuyết

4.2 Số đĩa lý thuyết N:

Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau :

N = 5,54 ( t R / W 0,5 ) 2

Trong đó : tR : Thời gian lưu của chất phân tích

W0,5 : Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak

Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến

5500 là vừa đủ

Phần I : Cơ sở lý

thuyết

4.3 Độ phân giải R : ( Resolution )

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất

ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của 02 Peak cạnh nhau phải được tính theo công thức sau :

R= 2( t’RB - t’RA)/ (wa + wB)

Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Gass) thì độ phân giải tối thiểu để 02 Peak tách là R =1.0 Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp

+ Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn ,việc tính toán

diện tích Peak sẽ không chính xác ,lúc này phải tìm cách tăng

R theo 03 cách sau:

* Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động ( Thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC ,thay đôíi

cường độ ion nếu là IE - HPLC )

* Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có kích thước nhỏ hơn

Phần I : Cơ sở lý

thuyết

4.3 Độ phân giải R : ( Resolution )

* Làm tăng độ chọn lọc  bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá trình tách hoặc thay đổi thành phần pha động

+ Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu,tốn nhiều pha động ,độ nhạy sẽ kém Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung môi Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình

dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các Peak ta phân tích

Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha

động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong quá

trình phân tích

Phần I : Cơ sở lý

thuyết

4.4 Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor)

Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Peak trên sắc ký đồ thu được

T được tính bằng tỷ số độ rộng của 02 nửa Peak tại điểm 1/10 chiều cao Peak :

Peak dạng đôïi xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T,

ba

T = a/b

Phần I : Cơ sở lý

thuyết

4.4Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor)

* Khi T  2.5 thì phép định lượng được chấp

nhận

* Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó xác

định ,vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho Peack cân đối hơn theo các cách sau :

+ Làm giảm thể tích chết tức là đoaün nối từ cột đêïn Detector

+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên

+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách

Phần I : Cơ sở lý thuyết

5 Phân loại sắc ký và ứng dụng :

+ Theo cơ chế chia tách của sắc ký ,người ta phân ra các loại sau đây :

Sắc ký hấp phụ ( NP - HPLC và RP - HPLC); sắc ký phân bố - sắc ký chiết ( LLC); sắc ký trao đổi ion ( IE - HPLC) ; sắc ký rây phân tử - sắc ký gel ( IG - HPLC) Nhưng thực tế hiên nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu

5.1 Sắc ký hấp phụ :

* Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) cuả pha động để kéo chất tan ra khỏi cột Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ:

Phần I : Cơ sở lý thuyết

+ Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực

+ Sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC): Pha tĩnh không phân cực pha động phân cực

Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi ,thành công để tách các hỗn hợp các

chất có tính chất gần tương tự nhau và

thuộc loại không phân cực ,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ hiệt giảm đau

Phần I : Cơ sở lý thuyết

I- Máy HP:C gồm các bộ phận cơ bản được tóm

tắt trên sơ đồ sau :

Degasse Pump

Tiím mẫu

Column

Detector

Phần II : Hệ thống HPLC

Trong đó :

1- Bình chứa dung môi pha độüng

2- Bộ phận khử khí

3- Bơm cao áp

4-Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)

5-Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay

trong bộ điều nhiệt )

6- Detector ( nhận tín hiệu )

7-Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC.

8- In dữ liệu

Phần II: Hệ thống HPLC

II.1 - Bình đựng dung môi

- Hiện tại máy HPLC thường có 04 đường dung môi vào đầu bơm cao áp Cho

phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rưaó giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 04 đường là 100 %

Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta

ít khi sử dụng 04 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 03và

02 đường để cho hệ pha động luôn được

pha trộn đồng nhất hơn,hệ pha độüng đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định

Hiện 04 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradial dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn

Phần II: Hệ thống HPLC

Lưu ý : - Tất cả các dung môi dùng

cho HPLC đều phải là dung môi tinh

khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC Hay dung môi tinh khiết phân tích

- Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được

sử dụng là hóa chất tinh khiết

phân tích

Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền,tạo ra các

Phần II: Hệ thống HPLC

II.2 Bộ khử khí Degasse :

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi

- Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (Bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ

ngừng hoạt động

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

Phần II: Hệ thống HPLC

II.3- Pump Cao áp :

- Mục đích để bơm pha động vào cột thực

hiện quá trình chia tách sắc ký Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc

250 at đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar) và pump phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar)

- Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tôïi đa 412 Bar Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút

- Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã

được cài đặt Hiện tại bơm có 2 Pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục

Phần II: Hệ thống HPLC

II.4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection):

ĐêØ đưa mẫu vào cột phân tích theo phương

pháp không ngừng dòng chảy Với dung tích

của loop là 5 - 100l

Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ công( tiêm bằng tay ) và tiêm mẫu tự động( Autosample)

II.5 Cột sắc ký :

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép

không rỉ ,chiều dài cột khoảng 10 -30cm ,đường kính trong 1-10mm ,hạt chất nhồi cỡ  = 5-10

m.(ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt )

Phần II: Hệ thống HPLC

- Với chất nhồi cột cỡ  = 1.8 -5 m có thể dùng cột ngắn ( 3-10 cm ) và nhỏ ( đường kính trong 1- 4.6 mm)loại cột naỳ có hiệu năng tách cao.

- Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký ( trong các dược điển USP 23 ,24 có tiêu chuẩn hóa các lọai cột )

- Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ ( pha đảo ) ,ngoài ra người ta còng dùng các loại hạt khác như :Nhôm Oxit,Polyme xốp ,chất trao đổi ion.

* Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven

Phần II: Hệ thống HPLC

II.6 - Detector :

- Là bộ phận Phát hiện các chất khi chúng ra

khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ

để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loaüi Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định

Cường độ phát xạ ,cường độ điện thế ,độ

dẫn điện ;độ dẫn nhiệt ;chiết suất

Phần II: Hệ thống HPLC

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai

Detector sau :

+ Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để

phát hiện UV

+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến ( UV -

VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang đây là loại thông dụng nhất

+Detector huỳnh quang đêí phát hiện các chất hữu

cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang Là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất

+Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod

Array ,ELSD (Detector tán xạ bay hơi ) các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các

Phần II: Hệ thống HPLC

- Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là :

+ Detector điện hóa : Đo dòng ,cực phổ ,độ dẫn ,điện lượng )

+ DetectorChiết suất vi sai : Detector khúc xạ ( thông thường dùng cho đo các chất đường ) + Detector đo độ dẫn nhiệt ,hiệu ứng nhiệt

II.6 - Bộ phận ghi tín hiệu

- Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang

+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ,thời

gian lưu,diện tích của Peak ,chiều cao

Phần II: Hệ thống HPLC

+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu

tất cả các thông số,phổ đồ và các thông số của Peak như tính đối xứng,hệ số

phân giải trong quá trình phân tích đồng thời sử lý ,tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như : Nồng

Phần III : CHỌN ĐIỀU KIỆN

SẮC KÝ

Muốn có một kết quả táh tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu ; Các điều kiện đó bao gồm :

Pha tĩnh : - Loại pha tĩnh

- Kích thước cột

Pha động : Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ Nếu là chương trình rửa giải Isocratic

Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng,

nhiệt độ và chương trình dung môi Nếu là chương trình rửa giải Gradient.