Luận văn thạc sỹ: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm mốc tạo enzyme endo glucanase nhằm ứng dụng trong sản xuất ethanol thế hệ 2

Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm mốc tạo enzyme endo glucanase nhằm ứng dụng trong sản xuất ethanol thế hệ 2.Phân lập tuyển chọn được chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme endoglucanase cao ứng dụng trong khâu thuỷ phân cellulose thành đường trong quá trình sản xuất ethanol sinh học từ nguyên liệu thế hệ 2

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề:

Năng lượng đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển của kinh tế- xã hội và an ninhquốc gia Vì vậy trong chính sách phát triển kinh tế, xã hôi thì chính sách năng lượngcũng được đặt lên hàng đầu

Theo tính toán của các chuyên gia kinh tế năng lượng, dầu mỏ và khí đốt chiếm khoảng60-80% cán cân năng lượng thế giới Với tốc độ tiêu thụ như hiện nay và trữ lượng dầu

mỏ hiện có, nguồn năng lượng này sẽ nhanh chóng bị cạn kiệt trong vòng 40-50 năm nữa.Diễn biến phức tạp của giá xăng dầu gần đây là do nhu cầu dầu thô ngày càng lớn vànhững bất ổn chính trị tại các nước sản xuất dầu mỏ Để đối phó với tình hình đó, cần tìm

ra các nguồn năng lượng thay thế, ưu tiên hàng đầu cho các nguồn năng lượng tái sinh vàthân thiện với môi trường

Trong số nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng lượng gió,năng lượng mặt trời,…) năng lượng sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu, nhất là cácnước nông nghiệp và nhập khẩu nguyên liệu.Trongđó Ethanol sinh học( Bio-ethnol) làmột loại nhiên liệu sinh học dạng cồn, là nguyên liệu thay thế xăng Được sản xuất bằngcon đường sinh học, chủ yếu bằng phương pháp lên men và chưng cất các loại ngũ cốc cóchứa tinh bột để chuyển hóa thành đường đơn Ethanol thế hệ thứ nhất thường được sảnxuất từ các loại cây nông nghiệp có hàm lượng đường cao như : bắp( ở Mỹ), lúa mì, lúamạch, mía( ở Brazinl).Tuy nhiên việc phát triển Ethanol thế hệ 1 đang đối mặt với nhiềuthách thức do sự bất ổn về an ninh lương thực và hạn chế đất trồng, đồng thời chi phílương thực ngày càng cao Để phát triển công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học một cáchbền vững, cả thế giới chuyển sang lựa chọn nguyên liệu thứ 2, được sản xuất từ nguồnnguyên liệu sinh khối lignocelluloses[] Các nguyên liệu này chủ yếu có nguồn gốc từchất thải nông nghiệp, chất thải rừng, các sản phẩm phụ từ quá trình chế biến thực phẩm

hoặc loại cỏ sinh trưởng nhanh như rơm rạ,bã mía… Sinh khối lignocelluloses gồm 3thành phần: cellulose,hemicelluloses và lignin

Qúa trình sản xuất cồn trải qua 3 giai đoạn : tiền xử lý, thủy phân và lên men, trong đóquá trình thủy phân đóng vai trò quan trọng Và hiện nay phương pháp thủy phân bằngenzyme đang được nghiên cứu rộng rãi do ít tạo các ảnh hưởng xấu đến dịch lên men vàkhông ăn mòn thiết bị, an toàn với môi trường Qúa trình thủy phân cellulose trong sinhkhối lignocelluloses là kết quả của sự tác động hiệp đồng ít nhất 3 loại enzyme chính:endo-1,4-β-glucanase, exo-1,4-β-glucanase, β- D-glucosidase.Trong đó enzyme endo –glucanase cắt các liên kết trong phân tử cellulose, tạo điều kiện cho các enzyme kháctiếp cận cơ chất dễ dàng

Vì vậy, để góp phần vào việc phát triển nhiên liệu sinh học thế hệ 2, đề tài của tôi chọn là “ Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm mốc tạo enzyme Endo- glucanase nhằm ứng dụng trong sản xuất ethanol thế hệ 2”

2 Nội dung nghiên cứu:

o Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc tạo enzyme endo-glucanase

o Tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme endo cao

o Khảo sát ứng dụng của chủng trong sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ 2

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN

1.1.Thành phần chính của vật liệu lignocellulose

Lignocelluloselà một hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phong phú , bền vững và khó phân giảitrong điều kiện tự nhiên Hàng năm có khoảng 4*1010 tấn sinh khối thực vật được tạo ra,trong đó lignocelluloses chiếm 50%

Lignocellulose là thành phần chính trong thực vật thân gỗ và thân thảo được cấu tạo từ 3hợp phần chính là cellulose, hemicelluloses và lignin Dưới đây là thành phần nguyênliệu lignocelluloses trong tự nhiên ( hình 1.1)

Hình 1.1 Thành phần nguyên liệu lignocelluloses

Hàm lượng của cellulose, hemicelluloses và lignin là khác nhau giữa các loài, trong cùngmột cây hay các cây khác nhau dựa vào độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây

và các điều kiện khác

Bảng 1.1 Thành phần của một số loại nguyên liệu lignocelluloses[46]

Nguồn nguyên liệu Cellulose Hemicelluloses Lignin

vị trí C1 tự do Đầu còn lại là đầu không khử, nhóm chức hydroxyl ở vị trí C1 bị bao vâytrong một liên kết O-glycozit.Các mạch cellulose được nhóm lại với nhau dưới dạng visợi bền bởi các liên kết hydro nội và ngoại phân tử.[3]

Hình 1.2 Công thức hóa học của cellulose

Hình 1.3 sơ đồ cấu tạo sợi celluloseCellulose gồm từ 1.400÷10.000 gốc β-D- glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucozit tạo thành dạng chuỗi Cấu trúc của cellulose bao gồm đồng thời vùng tinh thể vàvùng vô định hình Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao, cấu trúc sợi đậm đặc, chiếmkhoảng ¾ cấu trúc cellulose Tỷ lệ vùng kết tinh và vùng vô định hình tùy thuộc vàonguồn gốc xuất xứ của nguyên liệu Trong vùng tinh thể các phân tử cellulose liên kếtchặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất Ngược lạitrong vùng vô định hình, các phân tử cellulose iên kết không chặt chẽ với nhau nên dễdàng bị tấn công.Tuy nhiên, việc thủy phân cellulose chỉ diễn ra khi cellulose được táchkhỏi các thành phần cùng cấu tạo nên thành tế bào thực vật

1.1.2 Hemicellulose

Hemicellulose là hợp chất polysaccharid chiếm tỷ lệ lớn trên thế giới sau cellulose.Lượng hemicellulose được tạo thành trên thế giới được đánh giá là 3.900 triệu tấn/năm.Ngược lại cellulose, hemicellulose là một loại polymer phân nhánh, độ trùng hợp khoảng

70 đến 200 có cấu trúc phức tạp hơn đơn phân Là các polysaccharid tan trong kiềm, liênkết với cellulose trong cấu trúc thành tế bào thực vật Cấu tạo từ nhiều nhóm đườngmonomer, chủ yếu chứa những nhóm đường D-pentose khác nhau như: xylose, mannose,galactose, và arabinose Trong đó Xylose, Mannose là những thành phần chính.Khác vớiCellulose, Hemicellulose bao gồm những chuỗi mắt xích ngắn (200 đơn vị đường)

Hình 1.4: Cấu trúc hemicelluloseTùy thuộc vào tỉ lệ của các thành phần monomer cơ bản, hemicellulose còn được gọi làmannan (chứa mannose), xylan (chứa xylose) hoặc galactan (chứa galactose) Cácmonose trong hemicellulose liên kết với nhau thông qua các liên kết β-1,3, -1,6 và -1,4glycozid, thường bị acetyl hóa Xylan, polymer của xylose, là thành phần chiếm tỷ trọnglớn cấu tạo nên hemicelulose trong các vật liệu lignocellulose Thủy phân hoàn toàn hợpchất này sẽ tạo ra các nguyên liệu có giá thành thấp phục vụ cho các ngành công nghiệphoặc trực tiếp cho lên men cồn[5]

Khác với cellulose và hemicelluloses, lignin là những hợp chất cao phân tử rất phức tạp,

có cấu trúc không gian ba chiều, vô định hình, được tổng hợp bởi thực vật bậc cao,chiếm

23- 32% trọng lượng khô trong các mô của cây thân gỗ Lignin được cấu thành từ cácđơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferylalcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmaryalcohol

Hình 1.5: Các đơn vị cơ bản của ligninCác nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin bao gồm nhóm phenolic hydroxyl tự

do, methoxyl, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu mạch thẳng và nhómcarbonyl ( Hình 1.6).Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic hydroxyl hơn syringy

Hình 1.6 Cấu trúc lignin

Sự có mặt của lignin trong sinh khối gây khó khăn cho việc thủy phân nguyên liệu thànhđường do cản trở sự tiếp xúc của cellulase với cellulose sinh khối Do vậy phân hủylignin sẽ tạo điều kiện cho thủy phân hiệu quả cellulose Mặt khác, lignin lại là một trongcác nguyên liệu quý được sử dụng trong công nghiệp như nhiên liệu.Thu hồi lignin giúpnâng cao giá trị sử dụng sinh khối thực vật.[2]

1.2.Các loại nấm mốc phân hủy lignocelluloses:

Nấm mốc phân hủy lignocelluloses có 3 loại : nấm mục nâu, nấm mục trắng, nấm mụcxốp Trong đó, nấm mục trắng và nấm mục nâu thuộc nhóm Basidiomycetes là nhóm cókhả năng phân hủy lignocelluloses cao nhất trong tự nhiên

khác như Chaetomium,Ceratocystis, Lulworthia, Halosphaeria và Pleospora[4] Các loài

nấm này phân hủy mạnh cellulases ngay từ đầu Sợi nấm có khả năng phát triển trong lớpcủa thành tế bào thực vật

Trong nhóm nấm này,khả năng sản sinh các enzym phân huỷ cellulose cũng khác nhau.Loài nấm có khả năng sản sinh hàng loạt enzym phân huỷ cellulose và được nghiên cứu

kỹ là T.reesei[17] T.reesei sản sinh ít nhất ba enzym endoglucanaza, hai exoglucanaza và một hoặc hai enzym β-glucosidaza Nhiều loại nấm mục xốp khác cũng đã được nghiên

cứu

Các loài thuộc Trichoderma tiết ra một lượng lớn các enzym khác nhau,có khả năng phối

hợp để phân huỷ tinh thể cellulose

1.2.2.Nấm mục trắng:

Là loại nhóm nấm dị tản thuộc nhóm nấm Basidiomycete có khả năng phân hủy

lignocellulose Các nấm mục trắng khác nhau có tốc độ phân hủy lignin và carbohydratetrong gỗ khác nhau đáng kể Có hai dạng nấm mục trắng chủ yếu, phân loại dựa trên tínhđặc hiệu khi tấn công Dạng thứ nhất là phân hủy có chọn lọc, ở giai đoạn đầu ligninđược phân hủy nhanh hơn so với cellulose và hemicellulose, khiến cho gỗ mất màu

nhưng vẫn giữ được một phần cấu trúc, chẳng hạn như Phellinus nigrolimitattus Dạng

thứ hai là phân hủy đồng thời, hệ enzyme naỳ do những loài nấm này sinh ra có thể phânhủy cả ba thành phần chính với tốc độ gần như nhau, thân gỗ bị phá hủy hoàn toàn, trở

thành dạng mùn trắng như nấm cổ linh chi Ganoderma applatanum và Heterobasidion annosum.[13]

ra khi phân giải hemicenlulose Vì là phân tử nhỏ nên H2O2 dễ dàng khuyếch tán qua thành

tế bào thực vật và làm mục gỗ [4]

1.3 Hệ Enzyme phân hủy lignocelluloses

1.3.1 Hệ ezyme phân hủy hemicelluloses:

Để thủy phân hoàn toàn hemicelluloses thành monosaccharides cần sự kết hợp của một sốloại enzyme Chúng bao gồm β-D-xylanases, β- D- galactanases, β- D- mannanases

- Các enzyme phân hủy xylan:

Để thủy phân hoàn toàn polymer xylan phân nhánh cần có một số loại enzyme khác nhaunhư: endo-β- D- xylanases, β-xylosidases, α- glucuronidases, α- arabinosidases, vàacetylxylan esterases Endo-xylanases tấn công mạch chính của xylan và các oligomechứa nhóm thế hoặc không chứa nhóm thế, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết 1,4-β-D-xylopyranozyl của xylan như: L- arabino-D-xylan, L-arabino-D-glucurono-D-xylan

và D-glucorono-D-xylan

β-xylosidases có tác dụng chuyển hóa các oligome thành xylose Enzyme nàycũng phốihợp hoạt động với endoxylanases,α-arabinosidases và acetylxylan esterases để thủy phânhoàn toàn xylan thành monosaccharides

- Các enzyme phân hủy mannan:

1,4-β- mannoses có khả năng thủy phân liên kết 1,4-β-mannopyranozyl của mannan và D-glacto-D-mannan

D-Endo-mannanase làm xúc tác cho quá trình thuỷ phân β-DD-mannan thành D-manose và

1.3.2.Hệ enzyme phân hủy lignin:

Hệ enzyme giữ vai trò chủ yếu trong phân hủy lignin là manganese peroxidase( MnP) vàlignin peroxidase(LiP) và laccases Các enzyme này tạo ra những chất oxi hóa mạnhmạng lưới lignin [ 3]

 Lignin peroxidase(EC 1.11.1.14) lần đầu tiên được tìm thấy trong môi trường

nuôi cấy P chrysosporium[ Glenn- Tien công bố năm 1983] Hiện nay có thể tìm thấy enzym này trong một số loài nấm làm mục gỗ khác như Phlebia radiate, Phlebia tremellose, Trametes versicolor và xạ khuẩn Streptomyces viridosporus, Thermomonospora fusc Enzyme này xúc tác cho các quá trình oxi hóa khác nhau

trong mối liên kết ary của phức hợp lignin, phân hủy liên kết ete β- O-4 và liên kết

Cα và Cβ của nhánh bên lignin LiP xúc tác tiến trình decacboxyl hóa axit

phenylaxetic, oxy hóa rượu có OH ở Cα thành hợp chất Cα- oxo, hydroxyl hóa, tạo quinon và xúc tác cho phản ứng mở vòng thơm.[10]

 Manganese peroxidase(EC 1.11.1.13) được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy P chrysosporium, được Kuwahara và cộng sự công bố năm 1984 [12] Manganese

peroxidase có trọng lượng phân tử khoảng từ 40-48 kDal và có điểm đẳng điện pI

2,9-7,0 Ngoài P chrysosporium, MnP còn được tìm thấy trong nấm mục trắng khác T versicolor, P radiata, Ceriporiopsis cubvermis, Agarious bisporus,

Nematoloma frowadic MnP là enzyme duy nhất trong số các enzyme peroxidase

mà các cơ chất chủ yếu của nó là các acid hữu cơ có ion Mn+ Enzyme này hoạt động như một phenoloxydase trên cơ chất phenol bằng cách sử dụng Mn3+/ Mn2+làm cặp oxy hóa khử trung gian.Nhiệm vụ chính của enzyme này là tham gia vào phản ứng oxy hóa hợp chất phenol cũng như cấu trúc phenol của lignin MnP tấn công trực tiếp vào cấu trúc vòng thơm lignin, chuyển hóa thành những gốc oxy hóa có trọng lượng phân tử thấp theo con đường oxy hóa khử Mn

 Laccase(EC 1.10.3.2) là một oxidase chứa đồng Có khả năng xúc tác phản ứngchuyển hóa hợp chất phenol thành những phenoxyl, oxi hóa những hợp chất

không rượu trong điều kiện nhất định Đa số những nấm gây mục trắng đều có thểsinh laccase.

 Ngoài ra còn có các enzyme phát sinh H2O2 : nấm mục trắng cũng tạo ra một sốenzyme có khả năng phát sinh H2O2 Các enzyme nội bào này là glucose-1-oxidase, glucose-2-oxidase, methanol oxidase và axyl- CoA oxidase Các enzymengoại bào phát sinh H2O2 là glyoxal oxidase Các enzyme này đượcP.chrysosporium tiết ra [6]

1.3.3.Hệ enzyme phân hủy cellulose::

Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việcthủy phân liên kết 1,4-β- glucoside trong cellulose Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm

Bảng 1.2 Hệ enzyme phân hủy cellulose:

Loại enzyme Cơ chất tối ưu Khối

lượngphân tử(kDa)

Nhiệt độtối ưu

PH tối ưu Tài liệu

tham khảo

Endo-1,4-β-glucanases Cellulose vô

định hình

Cellobiohydrolases(CBH) Cellulose tinh

- Exo-β-1,4-glucanases hay cellobiohydrolase(EC 3.2.1.19) xúc tác phân cắt liên tiếp các

đơn vị đường từ đầu không khử hoặc đầu khử của phân tử cơ chất, giải phóng các

oligosaccharide, cellobiose và glucose

- β- glucosidases hoặc β- glucosidase glucohydrolase( EC 3.2.1.21) thủy phân cellobise

và cellodextrine tạo glucose

Ba enzyme này xúc tác cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình thủy phân cellulose tạo glucose.[30],[39],[45]

1.4 Giới thiệu về Endo- glucanases:

1.4.1 Nguồn gốc:

Endo-β-1,4- glucanases(EC 3.2.1.4) có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhautrong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật Trong tự nhiên có rấtnâahiều chủng vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn, và một số loại nấm men có khả năng sinhtổng hợp endo-β-1,4- glucanase

Nấm mốc là một trong những vi sinh vật có khả năng tổng hợp endo-β-1,4-glucanase

mạnh nhất Nhiều chủng nấm mốc thuộc các chi Aspergillus, Tricoderma, Penicillium, Phanerochaete đã được nghiên cứu có khả năng tổng hợp endo- β-1,4-glucanase mạnh như: Aspergillus niger[25], A flavus, A fumigates[27], Trichoderma reesei [53]…

Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng được xem là một trong những đối tượng có khả năngsản sinh Endo-β-1,4- glucanases khá phong phú Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đã được

nghiên cứu là Acidothemus cellulobuticus[22]

Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn được sinh tổng hợp ở thực vật Arabidopsis [23], ở

động vật nguyên sinh và một số động vật không xương sống khác như mối , ở động vật

thân mềm như Mytilus edulis [63]

Trong số các nguồn sinh Endo-β-1,4-glucanases như trên thì vi sinh vật được xem lànguồn cung cấp enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật như:

- Là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn, cũng là nguồnnguyên liệu con người có thể tạo ra được

- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn ( từ 16-100 giờ)

- Vi sinh vật phát triển nhanh, tỷ lệ enzyme trong tế bào cao vì thế sản xuất chếphẩm enzyme dễ dàng, hiệu suất thu hồi

1.4.2 Cấu trúc không gian của enzyme endo-glucanase:

Hình 1.7: Cấu trúc không gian enzyme endoglucanase

Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và

cấu trúc khác nhau Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối

lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi

polypeptide Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không gian các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng

liên kết cơ chất Chính nhờ sự khác nhau về cấu trúc không gian của

các protein enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng[7]]

1.4.3 Tính chất hóa lý của Endo-β-1,4-glucanase:

Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính của enzyme đạt mạnh nhất ởnhiệt độ và pH nhất định Độ bền nhiệt độ và pH hay mức độ và tính chất chịu ảnhhưởng của các chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ hay ion kim loại cũng có sự khác nhau

1.4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạnnhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độthích hợp,khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50°C Ở nhiệt độcao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính; còn ở nhiệt độ thấp

dưới 0°C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độthích hợp.[4]

Hoạt tính xúc tác của endoglucanase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 55°C Theo kết quả nghiên cứu của Kiamoto và cs (1996), các endoglucanase từ chủng A.oryzae

KBN616 hoạt động tốt nhất trong dải nhiệt độ 45-55°C [22]

1.4.3.2 Ảnh hưởng của pH

Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trường phản ứng.Tùy thuộcvào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềmhoặc acid

Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ

A niger NRRL-363 là 5,5 [21]; của cellulase từ A niger Z10 là 4,5 và 7,5

[25]; của endoglucanase từ Trichoderma reesei là 4,0-5,0 [22]; của

endoglucanase từ A oryzae KBN616 là 4,0 và 5,0 [23].

1.4.3.3 Ảnh hưởng của kim loại:

Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme Các ionkim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch

enzyme Theo nghiên cứu của Gao và cs (2008), endoglucanase từ A terreus M11 bị

giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg2+ (2 mM), 59% khi ủvới Cu2+ (2 mM) [24]

1.4.3.4.Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ:

Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất vàmức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau Nghiên cứu của Trịnh Đình

Khá (2006) trên chủng Penicillium sp DTQ-HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ

methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt làn-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63% Các chất tẩy rửa tween

20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau,trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34% [25]