Phương pháp phát hiện và phòng chống HIV

Phương pháp phát hiện và phòng chống HIV

Tiểu luận kỹ thuật gen

Đề tài : Phương pháp phát hiện và phòng chống HIV

GVHD: PGS.TS Khuất Hữu Thanh SVTH : Phạm Anh Toàn

Nguyễn Xuân Kính

 1981­2006 ,25 tr ng iườ

 0,4% nhi m HIV ,2009ễ

  Di truyền ngược chiều từ RNA sang DNA

 HIV­1 , HIV­2

Tải lượng virut

Đo số lượng bản sao của virut trong máu

Các k  thu t phân t   đo t i l ng virut ỹ ậ ử ả ượ

 K  thu t real time PCR  ỹ ậ

 K  thu t bDNA ỹ ậ

 K  thu t NASBA ỹ ậ

Kỹ thuật real – time PCR

 Xử lý huyết tương thu RNA tinh sạch

 RNA virut phiên mã ngược thành cDNA

 Mẫu dò Taq man bắt căp với cDNA

 Taq polymerase cắt bỏ mẫu dò , ánh sáng huỳnh quang phát ra

Xử lý huyết tương thu dna rna tinh sạch

 Sát trùng nơi lấy máu bằng cồn 70 độ

 Sử dụng chất chống đông máu EDTA

 Ly tâm ống chứa máu 2000v/ phút thu huyết tương

Tách chiết rna tổng số từ mẫu máu bằng kit hãng invitrogen

 Đ  đ m b o thu đc Rna tinh s ch ,c n lo i b  Rnase bám trên d ng c   ể ả ả ạ ầ ạ ỏ ụ ụ

thi t b  b ng cách ngâm d ng c  trong dung d ch DEPC 1% trong 8­12 h  ế ị ằ ụ ụ ị

,h p kh  trùng v i nhi t đ  áp su t cao .l y 200 ul m u cho vào  ng  ấ ử ớ ệ ộ ấ ấ ẫ ố

eppendorf ,b  sung proteinase K .l c nh  30s ,  20 phút   37 đ   .li tâm 6  ổ ắ ẹ ủ ở ộ phút t c đ  12000 vòng /phút thu d ch ,thêm 400 ul iso propan  và tr n  ố ộ ị ộ

đ u .chuy n d ch sang c t S N A P .Li tâm 1 phút t c đ  12000v/phút ,b   ề ể ị ộ ố ộ ỏ

d ch li tâm và r a c t b  d ch li tâm và r a c t 2 l n b ng dung d ch r a  ị ử ộ ỏ ị ử ộ ầ ằ ị ử

1X ,trong 2 phút 

 S  d ng 120 ul n c kh  ion đ  thu axit nucleic t ng s  .Lo i DNA b ng  ử ụ ướ ử ể ổ ố ạ ằ cách cho thêm 15ul đ m 10X cho Dnase ,  37 c trong 8 ­10 phút ,thêm  ệ ủ

300ul Iso propan và đ o  ng 4 ­5 l n  ả ố ầ

 Chuy n d ch vào 1 c t S N A P m i .Li tâm trong 1 ­2 phút   t c đ   ể ị ộ ớ ở ố ộ

12000v/phút ,b  d ch ly tâm và r a c t 2 l n b ng dung d ch r a 1x .s   ỏ ị ử ộ ầ ằ ị ử ử

d ng 120 ul n c kh  ion đ   ụ ướ ử ể thu RNA t ng s  tinh s ch ổ ố ạ

Ki m tra đ  tinh s ch RNA  ể ộ ạ

 Ki m tra đ  tinh s ch RNA b ng đi n di trên gel  ể ộ ạ ằ ệ agarose 

 Ki m tra đ  tinh s ch c a RNA b ng quang ph  k ể ộ ạ ủ ằ ổ ế

Mẫu dò Taq man bắt căp với cDNA

Kit th  HIV ử

 Quá trình này đ c l p l i nhi u l n, k t qu  là 1 l ng  ượ ặ ạ ề ầ ế ả ượ

l n RNA s  đ c t o ra ớ ẽ ượ ạ

1.Khu ch đ i chu i  ế ạ ỗ

acid nucleic c a h n 109 b n cóth  đ c  ủ ơ ả ể ượ

th c hi n ch  trong 90 phút hành đ ng ba enzyme ự ệ ỉ ộ

2. Thi t b  đ t ti n thermocycling là không c n  ế ị ắ ề ầ

hi n các bi u hi n mRNA cu i ệ ể ệ ố

6. Nó h  tr  vi c phát hi n các trình t  mRNA con  ỗ ợ ệ ệ ự

ng i mà khôngcó các nguy c  ô nhi m DNA  ườ ơ ễ

II.LIỆU PHÁP GEN TRONG PHÒNG

-AAV viral vecto được thiết kế mang một gen liệu pháp 4,7 kb

nhằm hạn chế tái bản HIV trong tể bào, tuy nhiên khả năng gắn gen liệu pháp vào nhiễm sắc thể số 19 của người rất thấp và hầu như không có tác dụng (Chaterjee và cộng sự, 1992).

Adenoviral trong li u pháp phòng ch ng hiv ệ ố

­Vectơ li u pháp thi t k  t   ệ ế ế ừ adenovirus  là m t vect   ộ ơ lai ch a ba lo i gen: gen c a  ứ ạ ủ adenovirus  là (đo n  ạ CCD Ad5 ; gen c a HIV là  ủ gen gag và tpa đã bi n đ i c a  ế ổ ủ

human cytomegavirus). t o nên hai vect  li u pháp gạ ơ ệ e n  phòng ch ng HIV là vect  Ad5FLgag ố ơ  (Ad5 HIV­I gag) 

và Ad5tpagag (Ad CMVI­ ipaHIVgag). Các vect  li u  ơ ệ pháp gen Ad5FLgag vi Ad5tpagag dã đ c th  ươ ử

nghiêm trên khí và trên chuôi cho k t quá r t kh   ế ấ ả

quan, t  l  t  bào nhi m HIV c a kh  d c đi u tr   ỷ ệ ế ễ ủ ỉ ượ ề ị

gi m nhi u so v i   kh  không đ c đi u tr  Các  ả ề ớ ở ỉ ượ ề ị

vect  này là nh ng vect  tri n v ng có th  s  d ng  ơ ữ ơ ể ọ ế ử ụ phòng và ch ng ố  HIV/AIDS cho ng i trong th i gian ườ ờ

s p t i ắ ớ

­Vectơ liệu pháp thiết kế từ virus HIV-1 được thiết kế và thử nghiệm từ năm 1991 (Poznansky và cộng sự, 1991; Shimada và cộng sự 1991) Cơ sở thiết kế vectơ liệu

pháp phòng chống HIV -1 từ bộ gen HIV - 1 đã biến

dổi, và được cài gắn thêm môi số gen khác có chức

năng ức chế tái bản hoặc hoạt động của HIV Đến nay,

có nhiêù loại vecto phòng chống HIV được sử dụng

Trong đó có một sô vectơ thử nghiệm có hiệu quả.

­Ví d : ụ

Vectơ pCMVAR9 bao gồm bộ gen virus HIV-1 dã cắt bớt một số gen, và cài thêm promoter hCMV của bộ gen người (hCMV - gen human cytomegavirus) và tín hiệu đóng gói SD (packaging

signal); Vectơ mã hoa protein vỏ của virus (env-coding plasmid), plasmid này dược thiết kế gồm các gen mã hóa vỏ của virus

MLV (Moloney murine leukemia virus); Vecto HIV chuyển dịch (transfer vector), vectơ này mang các gen GA, RRE và promoter CMV của bộ gen người có chức năng ngăn cản tái bản gen của HIV trong tế bào đồng thời hạn chế khả năng gắn bộ gen HIV với

bộ gen tế bào

­Các vectơ HIV-1 phòng chống nhiễm HIV/AIDS đã được thử nghiệm trên chuột, có hiệu quả hạn chế phát triển của virus HIV trong tế bào Tuy nhiên khi sử dụng viral vectơ HIV-1 có hiện tượng tái tổ hợp gen giữa

vectơ liệu pháp với virus HIV, dẫn đến các đột biến gen

và các hậu quả không mong muốn Do vây vectơ liệu pháp 111V-1 cho đến nay còn là vấn đề cần tiếp tục

nghiên cứu, thử nghiệm trên động vật và trên các tế bào người in vitro

b  S  d ng Oligo­ aiitisen và ribozym  ử ụ

trong phòng ch ng HIV ố I  AIDS

­ Oligo-antisen có thê ức chế quá trình dịch mã cùa HIV hoặc

ức chế hoạt động phiên mã của nhiều gen khác nhau của HIV

như ức chế gen gag (Lori và cộng sự, 1994 ), kìm hãm gen rev (Vandedriessche và cộng sự, 1995) gen em ((ỉuotoku J và

cộng sự, 1991)

-Ribozvm được dụng tìm đến RNA thông tin (mRNA) của

HIV , thực hiện phản ứng cắt đặc hiệu, làm mất hoạt tính

mRNA của HIV (Dropulic, 1994) Virus HIV-1 ribozym có thể tác động và gây mất hoạt tính mRNA của một sô gen HIV như các gen gag, pol, tat (Chen và cộng sự, 1992; Dropulic,

1994)

­Hi n nay nhi u th  nghi m viral vect  và ệ ề ử ệ ơ

nonviral vecto phòng ch ng HIV/AIDS, tuy ố

nghiên c n th  nghi m trên ng i thu đ c k t ầ ử ệ ườ ượ ế

qu  còn th p. C n nghiên c u đ  tìm ra các ả ấ ầ ứ ể

vect  li u có hi u qu  th c s , góp ph n h n ơ ệ ệ ả ự ự ầ ạ

ch  tác đ ng c a đ i d ch AIDS toàn c u.ế ộ ủ ạ ị ầ

­S  d ng các li u pháp gen phòng ch ng ử ụ ệ ố

HIV/A1DS, c n l a ch n các gi i pháp thích h p ầ ự ọ ả ợ

v i nh ng giai đo n khác nhau trong chu trình ớ ữ ạxâm nhi m t  bào và phát tri n c a HIV, nh m ễ ế ể ủ ằ

đ m b o hi u qu  c a li u pháp.ả ả ệ ả ủ ệ

Các giai đo n trong chu trình xâm  ạ nhi m và phát tri n c a virut hiv ễ ể ủ

 M t s  chi n l ộ ố ế ượ c liêu pháp gen ch ng HIV/AIDS ố

Tính ch t giai đo n ấ ạ

1 Ti p c n t  bào t i th  th  CD4 ế ậ ế ạ ụ ế

2. G n v i th  th  CD4 ắ ớ ụ ể

3. Ph n lòi tách khói ph n vó ầ ầ

4. Phiên mã ng c t o cDNA ượ ạ

5. B  gen HIV g n v i b  gen t  hào  ộ ắ ớ ộ ế

11. Các virus HIV m i phá t  bào  ớ ế

12. Ti p t c xâm nhi m t  bào khác ế ụ ễ ế

2. Phòng ch ng HIV/ AIDS b ng tăng c ố ằ ườ ng mi n d ch c a t  bào ễ ị ủ ế

a. Sử dụng gen đột biến Rev 10

- Tạo một loại pr đột biến trong tế bào bằng gen đột

biến Rev 10

- Sử dụng vectơ oligonucleotid mang Rev 10, chuyển

vào tế bào lympho TCD4 bào nhờ kỹ thuật bắn gen Kết quả cho thấy, có sự tái tổ hợp với bộ gen tế bào tạo nên các tế bào lympho TCD4 mang gen đột biên

Rev 10, các tế bào này có khả năng kìm hãm sự xâm

nhiễm của HIV (Woffendin và cộng sự, 1996; Liêm

và cộng sự, 1993)

b.S  d ng gen tăng c ng ho t đ ng c a các  ử ụ ườ ạ ộ ủ gen cytokin

-Cytokin : là các pr , các chất tạo nên bởi hệ thống tế bào miễn dịch trong đáp ứng miễn dịch.

-Trong trường hợp tế bào nhiễm HIV, do hoạt dộng các gen HIV làm suy yếu khả năng sản sinh interferon của tế bào Liệu pháp gen với chiến lược đưa một gen liệu pháp để tăng cường hoạt động gen sản sinh interferon, đã và đang được

nghiên cứu và thử nghiệm trên chuột.

-Gen IL-2 có tác dụng kích thích sự tăng sinh của các tế bào T CD4 ngăn cán sự phá hủy hệ miễn dịch do HIV gây ra, khống chế tái bản và nhân lên của HIV Với vai trò quan trọng của gen IL-2 dối với hệ thống miễn dịch chống HIV/AIDS,

hiện nay một số thử nghiệm liệu pháp gen theo xu hướng tăng cường gen mã hóa IL-2 cho các tế bào nhiễm HIV, đã thu được nhiều kết quả bước đầu.

c.  Chi n l c s  d ng các gen t  t  Ced) và gen đ c t   ế ượ ử ụ ự ử ộ ố (toxic gen)

 -Khi HIV mới xâm nhiễm tế

bào, bằng liệu pháp đưa các

gen tự tử (Ced) thymidin

kinase (TK) phối hợp sử dụng

thuốc chống virus ganciclovir

(GCV), tạo thành phức hợp

ganciclovir-phosphat ức chế

hoạt động của enzym DNA

polymerase quá trình tái bản

gen của tế bào bị ngừng ,sự

phân chia tế bào bị gián đoạn

tế bào co lại và chết.

3. Vaccin DNA trong đi u tr  IIIV/AIDS ề ị

­Vaccin DNA được xem là một chiến lược hiệu quả cùa liệu pháp gen phòng chống HIV/AIDS.

-Vaccin DNA khác với các loại vaccin khác ở chỗ vaccin DNA là phức hợp các gen (DNA), khi đưa vào tế bào các gen được tái bản, phiên mã và dịch mã trong tế bào tạo nên các loại protein liệu pháp tương ứng Protein liệu pháp có (ác dụng ngăn cản sự xâm nhập của HIV, hoặc ức chế sự phát triển và nhân lên của

HIV trong tế bào Các loại vaccin khác (vaccin vi khuẩn, virus giảm độc tố; vaccin mảnh peptid, vaccin tái tổ hợp ) đều là các protein kháng nguyên, khi đưa protein kháng nguyên vào cơ thể gây đáp ứng miễn dịch tế bào, kích thích các loại tế bào tương ứng với kháng nguyên sản sinh các kháng thể đặc hiệu.

S  đ  vai trò c a vacxin dna trong li u  ơ ồ ủ ệ pháp gen phòng ch ng hiv/aids ố

­Hiện nay vaccin DNA HIV-1 đã và đang được thử nghiệm phòng chống HIV/AIDS trên chuôi có hiệu quá cao Bản chất của vaccin DNA HIV-1 là một vectơ liệu pháp gen, được cải tiến từ bộ gen HIV-I Một số loại vaccin DNA, được thử nghiệm phòng chống HIV/AIDS được tạo thành từ các plasmid tái tổ hợp, gồm

plasmid pTXGE và các gen đặc hiệu cho hệ thống miễn dịch ở người như gen IL-2, gen IFN-y và gen GM- CSF Plasmid tái lổ

hợp pTXGE được tạo thành từ plasmid pTX (4,5 -5 kb) cài thêm

bộ gen H1V-1 biến đổi (đã xoá bỏ một số vùng gen của HIV như

gen pol, các gen vpu, vpr, tat bị xóa một vài vùng nhỏ).

­Thí nghiệm thử nghiệm vaccin DNA phòng chống HIV/AIDS trên chuột thành công, đã mở ra một triển vọng mới trong điều trị HIV/AIDS cho người bằng vaccin DNA.

Cám  n s  quan tâm theo dõi c a  ơ ự ủ