ứng dụng kỹ thuật pcr công nghệ sinh học

Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong xét nghiệm bệnh tômViệc xét nghiệm bệnh tôm bằng hệ thống PCR Real-time được tiến hành theo qui trình trong vòng 10 phút nhằm làm sốc nhiệt

MÔN: SINH HỌC PHÂN

TỬ

GVHD: NGUYỄN THỊ DUY KHOA GVHD: NGUYỄN THỊ DUY KHOA

I KHÁI NIỆM

 PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction

 PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay gọi là "phản ứng khuếch đại

gen"

 PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch

đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men

 PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ

nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác

định huyết thống

III THỰC NGHIỆM PCR

 PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen

 PCR cần rất nhiều thành phần

- DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại

- Cặp mồi(primer),

- DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của

DNA - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho polymerase để xây dựng DNA mới

- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-

DNA-polymerase

đậy của máy PCR cũng được

đun nóng, trường hợp lượng

dung dịch phản ứng quá ít,

người ta cho một lớp dầu

(natural oil) lên trên bề mặt

hỗn hợp phản ứng Năm

2004, giá máy khoảng 2500

USD Phản ứng PCR được

thực hiện trong

III.1 Đoạn mồi

Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá

50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides)

- Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống

để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn Bước này gọi là gắn mồi

- Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA Bước này gọi là kéo dài

IV Những ứng dụng của PCR

 Vân tay di truyền

 Kiểm tra huyết thống

 Chuẩn đoán bệnh di truyền

 Tách dòng gen

 Gây đột biến điểm

 Phân tích mẫu DNA cổ

 Xác định gen của các đột biến

 So sánh mức độ biểu hiện của gen

Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong xét nghiệm bệnh tôm

Việc xét nghiệm bệnh tôm bằng hệ thống PCR Real-time

được tiến hành theo qui trình

trong vòng 10 phút nhằm làm sốc

nhiệt để trích ly DNA

Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong xét nghiệm bệnh tôm

Hỗn hợp dung dịch và tôm post nghiền nhuyễn lại trải qua công đoạn

làm lạnh nhanh, cho vào tủ đông ở

có chứa DNA

Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong xét nghiệm bệnh tôm

Dùng thiết bị chuyên

dụng lấy khoảng 2 µl (microlít)

dung dịch này cho vào một ống

có chứa hóa chất gọi là ống

phản ứng

Ống phản ứng được đặt vào máy lưu nhiệt trong vòng 2

tiếng đồng hồ Tại đây sẽ diễn

ra quá trình phản ứng nhân bản

DNA

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR

KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT

PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS D7S820 NGƯỜI VIỆT NAM

I Phương pháp nghiên cứu

2 Phương pháp:

a Tách ADN:

ADN từ máu được tách chiết theo phương pháp chuẩn dùng phenol và chloroform để tinh sạch Kết quả tách chiết thu được ADN có độ tinh sạch khá cao với OD trung bình 1,75 và hàm lượng >50ng/ml

b Kỹ thuật PCR:

Quá trình PCR với các giai đoạn cơ bản: biến tính, gắn mồi và tổng hợp Quá trình được thực hiện với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau được lựa chọn từ 50oC đến 58oC Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra trên gel agaroza 2%, nhuộm ethidium

bromide (25mg/ml)

2 Phương pháp:

c Kỹ thuật điện di:

Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR

đã được kiểm tra trên gel agaroza 2% sau

đó được điện di trên gel polyacrylamide

6% sử dụng ure 7M Băng ADN được phát hiện bằng phương pháp nhuộm bạc của

Bassam, 1991.

d Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang alen * Đánh số alen theo quy ước riêng: Dựa vào các alen

quan sát được của các mẫu khác nhau trên bản điện di,

chúng tôi chọn ra các mẫu mang các alen khác nhau và

đánh số alen theo thứ tự từ dưới lên trên (đánh số alen từ băng ADN có trọng lượng phân tử thấp nhất đến băng

ADN có trọng lượng phân tử cao nhất) Việc đánh số ở

đây chỉ mang tính quy ước sao cho mỗi alen xác định

được có ký hiệu riêng, vì đây là quá trình khảo sát ban đầu chưa có thang alen chuẩn để so sánh

d Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang alen

* Xây dựng thang alen: Trong quá trình đánh số, chúng tôi đồng thời chọn ra những mẫu mang những alen khác nhau tập hợp lại để tạo thang alen Thang alen được tạo bằng phương pháp trộn mẫu.

* Chuẩn thang alen: ký hiệu lại các

alen đã khảo sát được theo quy ước quốc

tế Alen của locus D7S820 được ký hiệu từ

6 đến 14 căn cứ vào số đoạn lặp của mỗi

alen

băng ADN trên bản gel agaroza

Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR ở một số mẫu trên gel

agaroza theo điều kiện nhiệt độ gắn mồi 58oC

2 Kết quả chọn lọc alen và tạo

thang alen :

Thang alen chuẩn của locus D7S820 với 7 alen khác nhau được phân tách bằng kỹ thuật điện trên gel PA

biến tính

Xác định quan hệ huyết thống:

Đạt chính xác 99,9%

GS Lê Đình Lương và các cộng sự đã tự bỏ tiền túi để nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này trong việc xác định quan hệ huyết thống

Đến năm 2000, với đề tài "Xác định nhanh, chính xác các đặc trưng cá thể ở người bằng kỹ thuật PCR"

Với các mẫu máu, tóc, nước bọt ở các cá thể

khác nhau, dùng PCR có thể tìm ra các tính trạng chung ở các cá thể có cùng huyết thống

Hiện nay, để xác định huyết thống, thế giới thường dùng từ 8-14 gen Phòng thí

nghiệm của chúng tôi đã đưa vào ứng dụng thường xuyên hàng ngày 13 gen Vì với

mỗi trường hợp cụ thể, cần sử dụng những gien khác nhau và với mỗi trường hợp chỉ dùng từ 8-14 gien là đủ

CÁC CÁCH LẤY MẪU

 Cách thu thập mẫu ADN bằng tăm bông: Mẫu lấy ở đây không phải là nước bọt mà là các tế bào má từ bên trong miệng

 Việc lấy mẫu máu khô

Cách thu thập mẫu ADN bằng tăm

 Lấy xong que thứ nhất, đưa trả lại ngay vào phong bì mà bạn vừa lấy ra

 Lặp lại như thế với ba que tăm còn lại (nên nhớ là có bốn que thì hai que lấy tế bào má bên trái, hai que lấy tế bào

má bên phải)

 Với trường hợp trẻ còn nhỏ, không tự lấy được thì người lớn lấy hộ

Lưu ý: Không nói chuyện khi lấy mẫu, để tránh bắn nước bọt của

mình vào mẫu của trẻ.

 Dán kín các phong bì đã có mẫu Cho các phong bì chứa mẫu cùng với bản cam đoan vào phong bì lớn đã ghi sẵn địa chỉ của Phòng

Phân tích rồi dán lại Khi hoàn tất mọi việc, nên đem gửi mẫu đi xét nghiệm ngay Nếu vì lý do nào đó không gửi ngay được thì bảo quản mẫu ở nơi khô ráo, sạch sẽ ở nhiệt độ bình thường (khoảng 250C).

Việc lấy mẫu máu khô

 Chuẩn bị một miếng vải bông trắng sạch (mới), kích thước khoảng 3x3 cm Viết tên người cho mẫu vào mép miếng vải trước khi lấy mẫu

 Dùng cồn và bông lau sạch đầu ngón tay Dùng kim chích máu chích vào đầu ngón tay Nhỏ ba - bốn giọt máu thấm vào giữa miếng vải Sau đó, phơi hoặc hong khô

 Sau khi khô, mỗi mẫu được cho vào một túi ny-lông sạch, mới, rồi đưa vào một phong bì nhỏ Ghi tên người cho

mẫu ngoài phong bì

 Bảo quản mẫu ở 40C (ngăn rau của tủ

lạnh), nếu chưa đi gửi ngay.

 Kiểm tra lại xem các phong bì đã dán kín chưa Sau đó, gộp tất cả các phong bì nhỏ lại, cho vào một phong bì lớn cùng với đơn xin xét nghiệm và lệ phí xét nghiệm, rồi

gửi ngay bằng dịch vụ chuyển phát nhanh (EMS)

Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR

1 Lấy mẫu: ADN có thể tách

chiết từ những mẫu khác nhau,

như máu tươi, máu khô, tế bào

niêm mạc, nước xúc miệng, tóc,

da, phân, v.v Mẫu có thể lấy

tại chỗ hoặc gửi từ xa hàng

nghìn kilômet, mất nhiều ngày,

trong phong bì bình thường, qua

bưu điện, không cần bảo quản

lạnh

Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR

2 Tách chiết ADN: Nhiều quy

trình tách chiết ADN khác nhau

của thế giới đã được nghiên cứu,

thử nghiệm và thích ứng với điều

kiện nước ta Do vậy, góp phần

giảm giá thành, tiết kiệm kinh

phí Với mỗi loại mẫu có một quy

trình tách chiết thích hợp riêng

Đảm bảo chất lượng và số lượng

ADN từ những lượng mẫu nhỏ

Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR

3 Nhân ADN đặc hiệu: Đây

là khâu quan trọng nhất của

quy trình Các hỗn hợp hoá

chất khác nhau và các chu trình

nhiệt khác nhau đã được thử

nghiệm cho từng cặp mồi Trên

cơ sở đó, đã tối ưu hoá thành

phần của từng hỗn hợp, từng

chu trình nhiệt cho từng cặp

mồi, dựa vào những hoá chất

sẵn có trên thị trường trong

nước

Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR

4 Điện di: Điện di được dùng để

tách biệt các đoạn ADN có độ dài

ngắn khác nhau Độ tách biệt này

phụ thuộc nhiều yếu tố Các yếu tố

đã được lựa chọn và tối ưu hoá trên

cơ sở vật liệu sẵn có, hạ giá thành

đáng kể và tăng độ phân giải lên

hàng trăm lần, giúp phân biệt rõ các

đoạn ADN chỉ chênh lệch nhau bốn

nucleotid

Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR

5 Nhuộm ADN: Chất lượng điện

di và kết quả nhân ADN đặc hiệu

chỉ có thể hiện rõ trên bản gel với

quy trình nhuộm ADN được tối

ưu hoá và phương pháp nhuộm

thích hợp được lựa chọn Ngoài

ra, kinh nghiệm và kỹ năng của

kỹ thuật viên cũng rất cần thiết,

góp phần hạ giá thành chung

Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR

6 Phân tích kết quả: Bản gel sau khi

nhuộm xong sẽ có dạng như hình trên

Các đoạn ADN có độ dài khác nhau

hiện rõ trên bản gel, có thể quan sát

bằng mắt thường và đo đếm Trong

Đối với nhưng nơi chế biến thủy hải sản, muốn kiểm tra vi sinh vật gây

bệnh thì phải mất ba - bốn ngày xét

nghiệm, khiến cho thời gian bảo quản kéo dài, làm tăng giá thành sản phẩm

Sử dụng kỹ thuật PCR, thời gian xét

nghiệm nay chỉ cần 4 giờ là có thể cho kết quả

Bộ kit phát hiện bệnh đốm trắng ở tôm, do Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử ĐH Khoa học

Tự nhiên TP.HCM nghiên cứu và làm ra

Trong lĩnh vực PCR, Nam Khoa sản xuất và

cung cấp cho các phòng thí nghiệm lâm

sàng các bộ thử nghiệm PCR (bộ kit) để

phát hiện các virus gây bệnh cho người

như: lao, viêm gan B, viêm gan C, sốt xuất

huyết, u nhú (virus Human Pailloma), mụn

giộp (virus Herpes) Ngoài ra, để giúp các

phòng thí nghiệm có thể ứng dụng những kỹ

thuật tiên tiến trong lĩnh vực PCR, Công ty còn

sản xuất các bộ thử nghiệm real-time PCR,

PCR-ELISA để giúp phát hiện và định lượng

virus viêm gan B, viêm gan C

CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (WHITE SPOT SYNDROME

VIRUS) CHO TÔM SÚ BẰNG CÁC

KỸ THUẬT PCR

(a) Kỹ thuật PCR tổ (nested PCR)

 Kỹ thuật này sử dụng 2 cặp mồi thay vì 1 cặp mồi như kỹ thuật PCR cổ điển, trong đó cặp mồi thứ hai nằm giữa cặp mồi thứ nhất Kỹ thuật này còn gọi là kỹ thuật PCR 2 bước

 Kỹ thuật này sẽ có nhiều đoạn sản phẩm DNA hơn là kỹ thuật PCR cổ điển, số đoạn ADN được phát hiện sẽ nói lên tính định lượng tương đối của phản ứng

 Kỹ thuật nầy được Lo et al công bố vào năm 1996

(b) Kỹ thuật real-time PCR

Thay vì dùng kỹ thuật điện di để phát hiện ADN người ta thiết kế một hệ thống quang học ngay trên máy PCR để đo cường độ ánh sáng sinh ra tương ứng với lượng sản phẩm PCR được khuếch đại

Có nhiều cách phát hiện lượng ánh sáng (màu) sinh ra:

 Sử dụng SYBR GREEN

 Dùng đoạn dò TaqMan (TaqMan probe)

Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán sớm

+ Mẫu tôm nuôi: lấy một phần nhỏ mang của 10 - 20 con có biểu hiện bệnh lý đặc trưng nhưng tổng trọng lượng không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam, lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 950 + Mẫu tôm mẹ: lấy mẫu tôm mẹ phức tạp hơn vì phải đảm bảo tôm vẫn còn sống để tham gia sinh sản Do vậy, ưu tiên lấy mẫu mắt, chân bơi 2 hoặc một phần mang, lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 950 Lượng mẫu không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam

2 Tách chiết DNA (Desoxyribonucleic Acid

Nguyên tắc của việc tách chiết này là dựa trên sự

phối hợp cơ học (nghiền), hóa học và sốc nhiệt để tách

chiết DNA virus ra dịch chiết Cụ thể, mẫu được nghiền

trong bộ nghiền mẫu vô trùng với một lượng dung dịch

tách chiết DNA (NaOH và SDS) Dịch nghiền được đưa

vào biến tính bằng cách đun sôi 5 - 10 phút rồi làm lạnh

nhanh ở điều kiện lạnh Sau đó dịch nghiền được ly lâm 5

phút với tốc độ 13.000 vòng/phút Dịch nổi thu được sau

khi ly tâm đưa vào khuyếch đại DNA hoặc bảo quản lạnh

–20oC trong vòng một tuần (khi mẫu chưa được phân tích

ngay)

3 Khuyếch đại DNA

+ Giai đoạn biến tính (denaturation): phân tử DNA được tách ra làm hai mạch đơn ở nhiệt độ 94oC Thời gian này kéo dài 30 giây đến 1 phút

+ Giai đoạn lai (hybridization): là giai đoạn các

“mồi” bắt cặp với “khuôn” ở nhiệt độ thấp hơn (khoảng 55oC) Thời gian này kéo dài 30 giây đến 1 phút

+ Giai đoạn kéo dài (elongation) hay tổng hợp: nhiệt

độ được tăng lên 72oC giúp cho enzyme DNA polymerase

sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian này kéo dài 30 giây đến 1 phút

4 Điện di sản phẩm khuyếch đại

Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid Các đại phân tử này tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường

5 Phân tích kết quả

- Mẫu tôm bố mẹ

+ Nếu kết quả của phép thử PCR bước 1 là dương tính thì tôm mẹ đó khó sống được sau sinh sản và sẽ có biểu hiện đặc trưng của bệnh do virus đốm trắng Ngược lại, nếu âm tính thì tôm mẹ này có thể tạo ra đàn

postlarvae nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức thấp hay chưa nhiễm virus đốm trắng

+ Nếu kết quả phép thử PCR bước 2 dương tính thì tôm bố mẹ đó có thể sinh ra đàn post nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức thấp Ngược lại, nếu âm tính thì tôm mẹ sinh ra đàn postlarvae là tốt nhất

5 Phân tích kết quả

- Mẫu tôm postlarvae

+ Nếu kết quả PCR bước 1 là dương tính thì đàn

postlarvae cho khả năng mắc bệnh đốm trắng cao, cần loại

bỏ không nên đem nuôi thịt Ngược lại, nếu âm tính thì có thể đàn postlarvae này có mức cảm nhiễm virus đốm trắng còn thấp hay chưa nhiễm virus gây bệnh đốm trắng, có thể nuôi thịt được nhưng cần quản lý môi trường nuôi tốt,

tránh sốc các yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH, oxy

hòa tan và khí độc …

+ Nếu kết quả PCR bước 2 dương tính thì đàn

postlarvae này có thể sống trong 13 tháng không biểu hiện bệnh virus đốm trắng khi điều kiện môi trường tốt Ngược lại, nếu âm tính thì đàn postlarvae này có nguy cơ nhiễm bệnh virus đốm trắng thấp nhất

6 Ưu nhược điểm của kỹ thuật PCR

- Ưu điểm: phương pháp PCR cho kết quả nhanh

(trong ngày) và có độ tin cậy cao Kết quả thu được mang tính khách quan, trung thực khi người phân tích kết quả tốt, đồng thời nó cũng có thể định lượng được số lượng virus trong mẫu đem phân tích đơn giản hơn các phương pháp khác

6 Ưu nhược điểm của kỹ thuật PCR

- Nhược điểm: phương pháp này cũng có những hạn chế đáng kể đòi hỏi sự thận trọng khi sử dụng: sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuyếch đại bản sao của phương pháp này Các sai sót gây ra do Taqpolymerase trong qua trình tổng hợp

và kích thước của trình tự cần khuyếch đại phải dưới 1,5

kb

Bộ kit phát hiện

bệnh đốm trắng ở tôm, do Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử

ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM

nghiên cứu và làm

ra

Một số ứng dụng của PCR trong

vi sinh vật

bệnh nhiễm trùng