Ứng dụng kỹ thuật sắc ký trong nghiên cứu hóa sinh

Ứng dụng kỹ thuật sắc ký trong nghiên cứu hóa sinh

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT

SẮC KÝ TRONG NGHIÊN

CỨU HÓA SINH

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác nhau Các hợpchất này bao gồm những đại phân tử như protein, acid nucleic, lipid,… cũng nhưcác hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ Những hợp chất trên có thể hiện diện ở sốlượng nhỏ, dưới dạng vết (enzyme) hay ở số lượng nhiều (các protein cấu tạo).Người ta muốn biết các thành phần hóa học của tế bào, nhằm hiểu rõ các quy trìnhbiến đổi căn bản của nó, qua đó giúp cuộc sống ngày càng thêm tốt đẹp Muốn vậy,người ta phải tìm cách tách các tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học

Từ đó, kỹ thuật tách riêng các hợp chất ra đời với tên gọi sắc ký(chromatography) Ngày nay, sắc ký đã được sử dụng để tách tất cả các hợp chất dù

có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn

Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng vớinhiều kỹ thuật khác nhau như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc

ký ái lực

Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách các hợp chất mang điệntích theo trọng lượng phân tử của chúng Đến năm 1964, Moor gọi là “gelpermeation chromatography” hay gọi là sắc ký lọc gel

Năm 1906, sắc ký khí được biết đến nhưng đến 1952, kỹ thuật này mới pháttriển mạnh mẽ, nhất là trong thập niên 1960

Năm 1967, Horvath C là tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp

1.2.Định nghĩa sắc ký

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dừng để tách các thành phần củamột hỗn hợp Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chấtkhác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh vàmột pha động (Trong thí nghiệm của Tvest: pha tĩnh là canxi cacbonat, pha động làete dầu hoả) Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu Khi cácthành phần này di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng sẽ đượctách khỏi nhau theo thời gian Mỗi một thành phần đi qua hệ thống trong mộtkhoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợpđược chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do

sự phân bố khác pha nhau của các chất hòa tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắnhoặc lỏng Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạpdựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi trường động khí hoặc lỏng và đốivới môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua như giấy, gelatin hay gelmagnesium silicate,

Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học Sắc ký

là phương pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây là phươngpháp được đề nghị trong nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử

Các giai đoạn của quá trình sắc ký:

Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính:

a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch các sắc tố lên đầu cột canxicacbonat) Các chất được giữ trên pha tĩnh

b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động sẽkéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và

có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromatogram) Giai đoạnnày gọi là khai triển sắc ký Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua thì các chất có thểlần lượt bị kéo ra ngoài pha tĩnh (ví dụ: ra khỏi cột) Đó là quá trình rửa giải và

dung môi dùng được và dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ cuối cột gọi

là dịch rửa giải (eluate) Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta

có thể lấy từng phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấychất Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng thulấy các phân đoạn dịch rửa giải có các chất cần phân tích

c) Phát hiện các chất: Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu

có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử Trong sắc ký rửa giải cóthể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải điqua một bộ phận phát hiện gọi là detector đặt sau cột

1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

• Sắc ký lỏng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC)

• Sắc ký lỏng - rắn (liquid - song chromatography LSC)

• Sắc ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC)

• Sắc ký khí - rắn (gas - solid chromatography GSC)

1.3.2.Theo hiện tượng sắc ký

Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography): pha tĩnh là một chất rắn có khảnăng hấp phụ, đó là các phương pháp sắc ký lỏng - rắn và khí - rắn

Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh là chất lỏng không hoàlẫn được với pha động, chất lỏng này được bao trên bề mặt của một chất rắn gọi làgiá hay chất mang và phải là chất trơ, không tham gia vào sắc ký Sắc ký phân bốbao gồm sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký khí - lỏng

Sắc ký trao đổi ion (ion - exchange chromatography): pha tĩnh là chất nhựatrao đổi ion chớp chất cao phân tử có mang những ion có khả năng trao đổi với cácion cùng dấu của dung dịch hỗn hợp sắc ký)

Sắc ký theo loại cỡ (size - exclusion chromatography): còn gọi là sắc ký trêngel Các phân tử cỡ lớn sẽ được loạt các phân tử nhỏ hơn sẽ được tách theo kíchthước do các phân tử nhỏ di chuyển chậm hơn

1.3.3.Theo kỹ thuật và phương tiện sắc ký

Phương pháp giữ pha tĩnh:

Sắc ký trên cột (column chromatography: CC) pha tĩnh được chứa trong mộtcột bằng kim loại hay thuỷ tinh

Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC): pha tĩnh được tráng đều

và giữ trên mặt phẳng của bản thuỷ tinh, nhựa hay nhôm Lớp mỏng pha tĩnhthường là: silicagel, nhôm oxit, cenlulose, chất nhựa trao đổi lớn và có chiều dàykhoảng 0,25 - 0,5mm

Sắc ký giấy (paper chromatography - PC) pha tĩnh (lỏng) được thấm trên mộtloại giấy lọc đặc biệt gọi là giấy sắc ký

Theo cách cho pha động chạy:

Sắc ký khai triển (development chromatography) cho pha động kép các chấtchạy và tách trên pha tĩnh (Sắc đồ nằm trên pha tĩnh)

Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy và kép các chấtlần lượt ra ngoài pha tính (ra khỏi cột, ra khỏi giấy)

Tốc độ di chuyển của một chất, peak và hình dáng peak

Tốc độ di chuyển của một chất

Tốc độ di chuyên của một chất có thể được đặc trưng bởi hệ số phân bố của nógiữa hai pha hoặc bởi các đại lượng về sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh (thờigian lưu, thể tích lưu)

a Thời gian lưu và thể tích lưu

Thời gian lưu là thời gian cần để một chất di chuyển qua cột sắc ký, khi rakhỏi cột nhờ thiết bị detector ghi nhận tín hiệu và xuất hiện rực trên sắc đồ (tính từlúc bơm mẫu đến khi xuất hiện peak)

Tm là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ di chuyểncủa nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của dung môi, thời gian này được gọi làthời gian chết tR càng lớn, chất càng bị lưu giữ mạnh và tốc độ di chuyển của nócàng nhỏ

b Sự kéo dài peak: là kết quả của sự di chuyển nhanh chậm khác nhau của các phân

tử của cùng một chất khi đi qua cột sắc khí Các lực ra chậm bao giờ cũng tù hơn

c Hiệu lực của cột: Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: số đĩa lýthuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H Ta có thể coi như cột sắc khí được chia thành

N lớp hay N tầng mỏng, ở mỗi một lớp sự phân bố chất tan vào hai pha đạt trạngthái cân bằng Những tầng mỏng giả định này được gọi là địa lý thuyết Nếu cột sắckhí có chiều dài là L thì: H = N/L Cột có N lớn là cột có hiệu lực cao 6

d Độ phân giải: Độ phân giải Rs là tỉ số khoảng cách giữa hai peak và độ rộngtrung bình

của peak

Rs = 0,75 hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều;

Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%;

Rs = l,5 hai pic tách hoàn toàn (chi xen phủ 0,3%)

Phương pháp này thường được sử dụng để tách các chất ưa nước như aminoacid, đường, Trong giấy, cellulose có dạng sợi, các sợi này khi nằm cạnh nhau sẽtạo thành mạng lưới với các lỗ rỗng to Khi ly giải, dung môi di chuyển dọc theo bềmặt sợi và các lỗ rỗng sẽ được phủ đầy dung môi Như thế, các chất tan bị phân tánnhiều trong lỗ rỗng khiến các vết sắc ký to hơn Bột giấy hấp thu nước, nước bị giữ

lại trong cấu trúc glucopyranose bằng cầu nối hydrogen, vì thế quá trình sắc ký xảy

ra theo cơ chế phân chia

Hình: Sắc ký giấy, các chất màu di chuyển theo dung môi lên giấy với các

(c) Những chất khác nhau sẽ được trải ra ở những điểm khác biệt trên bảng , tạothành một sắc ký đồ

Hiện nay, sắc ký giấy đang dần được thay thế bằng sắc ký lớp mỏng Do phầnlớn các chất hữu cơ không có màu, nên sắc ký giấy sẽ không cho thấy được vị trícủa mẫu chất trong quá trình dung môi di chuyển đi lên giấy

Nhược điểm sắc ký giấy: Trong giấy, cellulose ở dạng những sợi dài nằm songsong kề nhau một cách tự nhiên, và một hệ thống mạng như thế chắc chắn có các lỗhỗng Khi dung môi giải ly di chuyển (mang theo các chất tan, solute) dọc theo bềmặt của sợi, các lỗ rỗng này sẽ được dịp phủ đầy dung môi, và các chất tan có dịpkhuếch tán vào các lỗ rỗng này, khiến các chất tan càng lúc càng to dần so với vếtchấm tạo mức xuất phát ban đầu Còn nếu sợi cellulose được nén chặt quá dòngchảy sẽ rất khó di chuyển

2.2.Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựachủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp cácdung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagelhay oxid alumin) Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳngnhư tấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic Do chất hấp thu được tráng thành mộtlớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng

Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu(silicagel, alumin, ) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấmnhôm, hay tấm plastic Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bộthay một lọai polymer hữu cơ

Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khácnhau Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ một viquản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên cao hơn mộtchút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình

Hình: Bình sắc ký lớp mỏng

Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theotấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển càng cao nhờtính mao quản

Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực củadung môi

Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnhmuốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chấttrong dung môi

Ưu điểm:

-Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích

-Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phântích

-Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớpmỏng

Các bước thực hiện sắc ký lớp mỏng:

-Chuẩn bị ống vi quản: ống thủy tinh có đường kính trong ống nhỏ, khỏang 2mm, một đầu được vót nhọn, dài 10-20cm Sử dụng ống vi quản để chấm nhiềulọai mẫu dung dịch khác nhau, chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch vi quản bằngdung môi hữu cơ như aceton

1 Chuẩn bị tấm bản mỏng: tấm bản mỏng thương mại 20x20cm, dùng kéo cắtbản với kiách thước cần thiết, tấm bản phải vừa bình giải ly Dùng bút chì vạch nhẹnét xuất phát và mức tiền tuyến dung môi

-Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp mẫu lên bảnmỏng, còn mẫu là dung dịch quá sễt, có thể pha loãng mẫu Với mẫu là chất rắnphải hòa tan trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5% Nhờ một vi quản đểdung dịch mẫu lên bề mặt tấm sắc ký lớp mỏng một cách thận trọng, tránh khôngcho làm lũng bề mặt của lớp mỏng Mỗi vết chấm trên bản không chứa nhiều hơn12ug (10ug là tối ưu) mẫu chất

-Sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dung dịch giải

ly

-Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên: Sau khi bình đã bão hòa dung môi,người ta đặt tấm mỏng vào bình khai triển để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phíadưới đáy bình Cạnh đáy của tấm lớp mỏng nậgp trong dung môi giải ly khỏang0.5-1cm Các vết mẫu không được ngập trong dung môi giải ly, vì như thế dungmôi sẽ khuếch tán vào trong dung môi

-Hiện hình các vết sau khi giải ly: Các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấybằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếumuốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (Phát hiện bằng tia tửngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng này nhận ra các hợp chất có thể hấpthu tia UV, các hợp chất có màu tối sẫm trên nền sáng; đèn chiếu tia UV 366nm ánhsàng này phát hiện nhữgn hợp chất có phát huỳnh quang, các vết sẫm của chất mẫu

có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu) hay dùng phương pháp hóa học (Bằngcách dung thuốc thử hiện hình như hơi iod, 2,7-fluorescein phát hiện đa số hợp chấthữu cơ, ninhydrin phát hiện aminoacid hay amin, 2,4-dinitrophenylhydrazin pháthiện aldehyde hay caton, clorur antimony phát hiện steroid hay vitamin haycarotenoid,…)

- Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số dichuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảngdịch chuyển của dung môi:

Trong đó:

a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi củavết, tính bằng cm

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l

Hình: Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng

2.3.Sắc ký cột:

Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh là những hạt

có kích thước tương đối lớn (50-150um), được nạp trong cột thủy tinh Mẫu chấtcần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở

để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phái trên cao.Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặngay ống dẫn ra của cột Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm,hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưuđiểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượngmẫu tương đối lớn

Các bước thực hiện sắc ký cột:

-Lựa chọn chất hấp thu :pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phâncực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau Vơí 2 phân tửkhông phân cực, phân tử naò có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnhhơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn

so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy

có tính phân cực

- Lựa chọn dung môi:Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môiphù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A) Chuẩn bị 4-6 tấm bảnmỏng 2,5x10cm Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5ul dd(A) Mỗibản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiệnbằng đèn UV hay thuốc thử Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nàophù hợp Từ kết quả đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môiphân cực và một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate

-Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá,cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột Cho chất hấp

thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏnhẹ vào thành cột Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2cm trong cột,thì mở nhẹ khoá ở bên dưới để cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một bechertrống để bên dưới cột, dung môi này dẽ được rót lại lên đầu cột Sau khi nạp xong,cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồngnhất

-Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký Nếu mẫu ở dạngrắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởiđầu sắc ký Thực hiện nạp mẫu lên cột như sau:

+Mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cộtxuống sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột

+Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột Muốn nạp mẫu, sử dụng mộtpipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất hấp thutrong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theothành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu

+Mở khoá bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫuđược thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấpthu đầu cột bị khô

+Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, đồng thời dùngdung môi này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột

+Mở khoá cho dung môi chảy ra Lặp laị vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấmsâu vào chất hấp thu, dung môi trong suốt không lây màu của chất mẫu

+Sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoángchất hấp thu để bảo vệ mặt cột

+Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành giải ly trên cột

2.4 Sắc ký trao đổi ion

Sự trao đổi ion là sự gắn kết có tính chất thuận nghịch giữa các phân tử cómang điện tích Trong sắc ký cột nhồi, pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mangđiện tích Giả sử cho đi ngang qua cột một hỗn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiềulọai chất tan (solute) khác nhau, chất tan nào có mang điện tích ngược dấu với điệntích của nhóm chức, thí dụ chất tan S, chất tan dễ đuổi đối ion C ra thế chỗ vào, đểgắn vào pha tĩnh, và như thế chất tan sẽ bị giữ lại trong cột, trong khi đó những chấtkhác của hỗn hợp mẫu chất ban đầu sẽ không bị giữ lại nên đi ra khỏi cột kỹ thuậtnày tách riêng được hợp chất S ra khỏi hỗn hợp ban đầu

RG- + S+ -Æ RG-S+ + C+

Hoặc RG+ +S- -Æ RG+S- + C-

Trong đó: R là pha tĩnh hay gọi là nhựa (resin), G là nhóm chức mang điệntích được cố định trên pha tĩnh hay còn gọi là nhóm chức họat động của nhựa C làđối ion của G S là chất hữu cơ có mang điện tích trái dấu với G

Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymercarbohydrate

Các bước trong sắc ký trao đổi ion:

-Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột: Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bêndưới cột Nhựa trao đổi ion đã đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa

và thể tích dung môi sao cho có thể rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo ra nhữngbọt khí nằm giữ các hạt nhực Để yên 5-10 phút cho các hạt nhựa lắng xuống, rótđầy cột bằng dung dịch đệm, mở khóa để cho hạt nhựa lắng xuống Khi nhồi cộthoàn tất, cần cân bằng cột bằng chách cho dung dịch đệm chày qua cột, cuối cùngkiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột

-Nạp mẫu chất lên đầu cột: dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạpvào cỗt, lọc bằng tờ giấy lọc hay ngang qua một lớp celite Lượng mẫu tùy vàolượng nhựa cũng như khả năng trao đổi của nhựa Đầiu quan trọng nhất là làm sao

để cho tất cả các cấu tử quan trọng của mẫu chất được hấp thu hết vào nhựa, tức làchú ý số lượng mẫu hơn là thể tích của mẫu Để nạp mẫu lên cột: mở khóa để hạmức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại dùng pipethút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa

ở trên đầu cột Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa

-Khi tất cả mẫu đã được gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm banđầu chảy qua, nối cột với bình cung cấp dung dich giải ly

-Giải ly bằng cách tắng dần nồng độ dung dịch giải ly: hỗn hợp mẫu đang gắnvào nhựa trao đổi ion trong dung dịch đệm có nồng độ thấp Để có thể tách mẫuchất ra khỏi nhựa thường, cần phải gia tăng lực ion của dung dịch đệm bằng cáchcho thêm NaCl Khi có thêm NaCl trong dung dịch đệm, ion của dung dịch đệm sẽcạnh tranh với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy những nhóm chức họat động cảunhựa, đẩy hợp chất ra khỏi nhựa, rồi theo dòng chảy đi ra khỏi cột

Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là những hạt mang sẵn mộtđiện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mangđiện tích trái dấu với chúng Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cộtcarboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi iondương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương Ngược lại, nếuhạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)),gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế,những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu

bị giữ lại cột

Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, nhữngion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích Ví dụ, trong sắc

ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịchtách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do

đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo

độ lớn về điện tích

2.5.Sắc ký gel

Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng nàyđược phủ đầy dung môi dùng làm pha động Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất cótrọng lượng phân tử khác nhau cò thể tách riêng được hay không là tuỳ vào kíchthước lỗ rỗng Các phân tử có kích thước lớn hơn lỗ rỗng, không thể chui lọt vàobên trong lỗ rỗng, nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột cácphân tử có trọng lượng phân tử (TLPT) nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ toàn phầnhay bán phần lọt vào lỗ rỗng, tuy rằng cuối cùng rồi cũng theo dòng chảy đi ra khỏicột nhưng sẽ chậm trễ hơn Dòng chảy pha động khiến các phân tử lớn không thểchui vào lỗ rỗng của mạng gel, nhanh chóng đi xuyên qua cột, ra khỏi cột, trong khiphân tử nhỏ ra khỏi cột lâu hơn vì còn chui vào và đi ra khỏi lỗ rỗng của gel Nhưvậy, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khi đi ngang qua cột sắc ký gel, sẽ

ra khỏi cột lần lượt theo trình tự TLPT lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử nhỏ đi rakhỏi cột sau

Sắc ký gel phải thực hiện trong cột hình ống trụ bằng thuỷ tinh, gồm các bướcsau:

Nhồi gel vào cột: các hạt gel trương nở hiện diện ở dạng huyền phù trongdung môi phù hợp cho vào cột Huyền phù được chỉnh sao cho thật sệt nhưng khirót vẫn chảy vào cột thành dòng dễ dàng Cân bằng cột bằng cách cho dung môigiải ly chảy ngang qua cột, lượng dung môi có thể tích bằng 2-3 lần thể tích cột.Kiểm tra sự chặt chẽ của cột bằng cách cho một lượng mẫu thử vào đầu cột mẫu

thử thường được chọn là dextran blue 2000, có màu xanh dương để có thể đượcquan sát bằng mắt thường sự di chuyển của mẫu trong cột

Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel: dung dịch mẫu cần phân tách phải đượclọc bỏ những hợp chất còn ở dạng rắn, cặn Dung dịch mẫu hoà tan vào dung dịchđệm, đặt lên đầu cột giống như sắc ký cột

Triển khai sắc ký gel: triển khai giải ly rất đơn giản, chỉ sử dụng kỹ thuật dungmôi đơn nồng độ (nghĩa là sử dụng một loại dung môi hay hỗn hợp hai dung môi,khi bắt đầu cho tới khi kết thúc quá trình giải ly chỉ sứ dụng một loại dung môi đó).giải lycó thể bằng trọng lực nhưng rất tốt khi sử dụng bơm đẩy từ đầu cột hứngdung môi giải ly trong những lọ nhỏ, mỗi lọ có một thể tích nhất định Các chất tan

sẽ ra khỏi cột theo thứ tự TLPT giảm dần

Ứng dụng: kỹ thuật này dùng để tách các đại phân tử có nguồn gốc sinh họcnhư: protein, polysaccharide, acid nuleic, enzyme, Người ta ứng dụng vào việcđóan TLPT của một hợp chất chưa biết

Nhược điểm: đắt tiền, khó tẩy rửa, chọn lọc ligand (phối tử), gắn kết ligandlên giá thể hoạt hóa thường gặp nhiều khó khăn

Ưu điểm: phát triển phương pháp tinh sạch trên protein A (protein A làantigen cho IgG), bước bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng nguyên thủycòn họat tính với dạng biến tính

Sử dụng sắc ký ái lực cho tương tác giữa kháng nguyên kháng thể: ta có thểtinh sạch một kháng nguyên bằng cách cho mẫu đi qua cột có chứa giá thể liên kếtvới kháng thể để thu nhận protein Ngược lại, một giá thể có liên kết với một khángnguyên chuyên biệt sẽ bắt giữ kháng thể chuyên biệt cho kháng nguyên đó Ứngdụng nhiều nhất là gắn kết protein A vào gel để gắn kết với các globulin miễn dịch

2.7 Sắc ký tương tác kỵ nước

Sắc ký tương tác kỵ nước là phuơng pháp bổ sung khá tốt cho các kỹ thuậtphân tách khác Trong những năm gần đây, phương pháp này trở nên thông dụngnhư là bước đầu tiên trong quá trình sắc ký

Loại hạt Macro-Prep có dẫn xuất là nhóm kỵ nước, có thể là gốc methyl hay butyl Các gốc này hấp dẫn các gốc kỵ nước khác có trên bề mặt protein Khi chomẫu protein vào trong điều kiện nồng độ muối cao ép các phần kỵ nước lại gầnnhau và đính với nhau Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách giảm dần nồng

t-độ muối cho đến khi các phần kỵ nước đi lại vào trong dung dịch

Đặc điểm: Phân tách các phân tử theo tính kỵ nước của phân tử Các nhóm kỵnước khác nhau đựợc cố đinh trên bề mặt giá thể Dưới điều kiện nồng độ muối cao(thấp) các phần kỵ nước trên

phân tử tương tác các nhóm cố định Các phân tử gắn kết được rứa giải bằngcách giảm áp lực ion và vì vậy hòa tan các phân tử ra khỏi giá thể

Ưu điểm: Là bước cho phép cô mẫu, công suất cao, nhanh, mẫu được thu nhậntrong nồng độ muối thấp

Nhược điểm: một số protein có thể bị tủa ở nồng độ muối cao, khó nâng cấpquy mô lớn

2.8 Sắc ký khí

Sắc ký khí là phương pháp được dùng để tách các chất ở thể khí bay hơi, vớipha động là chất khí, gọi là khí mang (carrier gas) Sắc ký khí còn áp dụng cho cácchất khí, lỏng, rắn dễ bay hơi và bền nhiệt độ cao, có TLPT M<500

Sắc ký khí rắn (GSC - gas solid chromatography): pha tĩnh rắn là một chất hấpphụ, đây là sắc ký khí hấp phụ và sắc ký khí lỏng (GLC - gas liquidchromatography): pha tĩnh lỏng được bao hay gắn trên một chất mang rắn (solidsupport) đây là sắc ký khí phân bố

Sử dụng phương pháp sắc ký khí có khả năng tách được hoàn toàn những chấthữu cơ tương tự, ví dụ như o-; m-; p-xilen không thể tách được bằng phương phápchưng cất phân đoạn nhưng tách được khá đơn giản bằng sắc ký khí, cũng như sửdụng đề tách những hỗn hợp rất phức tạp như khí thải ô tô chứa trên 300 hợp chất.Với việc ra đời của nhiều loại detector nhiều phương pháp mới xuất hiện như: sắc

ký khí - khối phổ (GS - MS), sắc ký khí - hồng ngoại (GC - IR) đã làm tăng khảnăng phân tích của sắc ký khí

Hình: Sơ đồ của một máy sắc ký khí

1 Khí mang

Khí mang là một khí trơ như nhờ, hen, ngon, hidro trong đó hai là khí mangphổ biến nhất Khí được chứa trong bom khí có gắn van giảm áp và điều chỉnh Khímang cần có độ tinh khiết cao và phải không tương tác với mẫu, chỉ mang mẫu điqua cột: Tín hiệu đetectơ có phụ thuộc vào sự khác nhau về tính chất giữa khí mangvàchất cần phân tích

2 Bộ bơm mẫu

Thường dùng bơm tiêm đề bơm trực tiếp mẫu qua một vách polime siliconchịu nhiệt cao vào cột hoặc vào phòng đun nóng mẫu để mẫu lỏng có thể bay hơinhanh chóng Yêu cầu cần 15 thiết là mẫu phải có đủ áp suất hơi để có thể được làmbay hơi trong phòng mẫu Nhiệt độ phòng mẫu có thể cao hơn nhiệt độ trong cộtmột chút để quá trình bay hơi được thực hiện dễ dàng

3 Cột sắc ký

Cột được đặt trong lò có thể điều chỉnh nhiệt độ trong quá trình thực hiện Cộtthông dụng nhất trong phân tích là những ống bằng thép không rỉ (đồng, thép) hoặcbằng thuỷ tinh dài từ 1 đến 10 m và có đường kính từ 2 đến 4 mm Chúng được uốncuộn tròn cho khớp với phòng lò Cột được nhồi bằng những phần tử rắn hoạt độngnhư một pha tĩnh (GSC): đó là những hạt nhỏ xếp gắn trên mặt trong cột hoặc phatĩnh được tẩm trên các hạt nhỏ đó Trong sắc ký khí lỏng (GLC), pha tĩnh được giữtrên chất mang, đó là những hạt chất rắn nhỏ, bền nhiệt, trơ về mặt hoá học, có lỗ cỡ

1 - 5 μm, bề mặt riêng lớn từ 1 - 10 m2/g Pha tĩnh phải chịu nhiệt, hoá lỏng ở nhiệt

độ phân tích, trơ về hoá học Thường hay sử dụng các polyme xốp hoặc gelaluminosilicat khử nước

4 Detector

Yêu cầu về detector rất nghiêm ngặt: Mọi hợp phần có trong 0,1 μl mẫu phảiđược phát hiện ở mức 1% cho nên phải nhanh chóng phát hiện được 0,002 μl (cókhối lượng cỡ 10-6g) mẫu Các detector hiện nay đo được những lượng nhỏ hơn

đến mấy bậc Hiện nay trong phương pháp GC người ta sử dụng những loại detectorsau:

Detector dẫn nhiệt (TCD): Việc vận hành của detector dựa trên sự cân bằngnhiệt cửa một dây dẫn nung nóng Khi có chất cần phân tích đi qua thì độ dẫn điệncủa hỗn hợp khí sẽ thấp đi, dây sẽ nóng lên, xuất hiện một tín hiệu điện Detectordẫn nhiệt thích hợp với nhiều chất cần phân tích

Detector ion hoá ngọn lửa (FID): Khi đốt cháy các hợp chất hữu cơ trong ngọnlửa, chúng sẽ tạo ra các ion Các điện cực ở gần ngọn lửa sẽ phát hiện ra sự có mặtcủa các ion bằng sự xuất hiện một dòng điện nhỏ chạy qua mạch điện Có thể đođược những dòng ngay cả khi chứng chỉ xấp xi bằng 10-12

2.9 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

- Áp dụng cho phân tích mẫu dạng lỏng, rắn có TLPT M>2000 - Các thành phầnchính của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bình chứa dung môi

Thường làm bằng thuỷ tinh, đôi khi làm bằng thép không rỉ, trong phương pháp rửagiải thông thường chỉ cần một bình chứa dung môi, trong phương pháp rửa giảigradient thường dùng 2, 3, 4 bình chứa các dung môi khác nhau và hệ dung môi rửagiải là hỗn hợp của các loại dung môi trên trộn lẫn với nhau theo ti lệ đã được xácđịnh Cần loại các hạt và các khí hoà tan trong dung môi

Hệ thống bơm

Bơm dùng trong phương pháp phải tạo được áp suất cao (3000 - 6000 psi haykhoảng 250 - 500at), lưu lượng bơm khoảng 0,1 đến 10 ml/ph, phải trơ với cácdung môi Hệ thống bơm này phải có khả năng bơm pha động qua cột ở áp suất cao

mà không bị ngắt quãng hoặc tạo nhịp sóng có thể làm sai lệch các lực thu được Có

nhiều kiểu bơm đã dùng trong các máy HPLC; nhưng kiểu phông xoay chiều hiệnnay được dùng phổ biến nhất

Hệ bơm mẫu (hệ tiêm mẫu)

Mẫu được bơm vào cột nhờ hệ thống van mẫu Người ta bơm mẫu vào vòng mẫuvới thể tích thường là từ 10 đến 20 μl

Cột sắc ký: Kiểu cột thường phụ thuộc vào phương pháp dùng để tách, nhưngthường là những cột bằng thép không gỉ, có cỡ lỗ chính xác đường kính từ 3 đến 4túm và dài từ 10 đến 30cm (những cột dùng cho SEC đường rộng hơn và dài đến100cm) Loại cột này có hiệu lực rất cao, có số (ra lý thuyết lên đến 100.000 đĩa cho1m chiều dài cột)

Detector : Là bộ phận phát hiện các chất khi chứng ra khỏi cột và ghi nhận các tínhiệu ghi trên sắc ký đồ Hiện đang sử dụng các loại detector sau: Detector tử ngoại(UV): Dùng đèn thuỷ ngân cho vạch 254nm Nhiều chất hấp thụ ở bước sóng này.Detector tử ngoại và khả kiến (UV-VIS): Dùng phổ quang kế lựa chọn bước sóng từ

195 đến 750 nm Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất Detector điện hoá vàdetector huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao dùng trong phân tích vết.Dùng detector điện hoá có thể phát hiện được những lượng picrogam (10-12g) Các phương pháp sắc ký hiệu nâng cao

2.9.1 Sắc ký phân bố hiệu nâng cao

Gồm hai loại: Sắc khí lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết

- Sắc ký lỏng - lỏng (LLC): Pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các hạtchất mang, tức là được hấp phụ trên chất mang

- Sắc ký pha liên kết (BPC): Pha tĩnh được gắn hoá học với chất mang tạo ra liênkết siloxan nối nhóm cơ - silic với silicagen

2.9.2 Sắc ký hấp phụ hiệu nâng cao (sắc ký lỏng - rắn LSC)

Pha tĩnh là chất rắn mà trên bề mặt có chứa các nhóm hiđroxil phân cực, pha động

là một dung môi không phân cực

2.9.3.Sắc ký trao đối ion hiệu nâng cao (IEC)

Pha tĩnh rắn chứa các nhựa trao đổi lớn dưới dạng bột mịn, pha động thường làdung dịch nước

2.9.4 Sắc ký lỏng hiệu nâng cao trên gel (sốc ký loại cỡ SEC)

Phương pháp này được ứng dụng chủ yếu cho các chất có phân tử lượng lớn Chấtnhồi cho SEC là những hạt xốp của silicagent hay các polyme có kích thước nhỏ( 10 μm) Pha tĩnh là dung môi nằm trong các lỗ xốp của hạt, pha động là dung môichảy giữa các hạt Chỉ những phân từ nhỏ mới khuếch tán vào lớp xốp, khi rửa giảicác phân tử sẽ lần lượt ra theo cỡ từ lớn đến nhỏ

2.10 So Sánh Giữa 2 Kỹ Thuật Sắc Ký Lỏng Cao Áp (HPLC) và Sắc Ký Khí (GC)

Độ bay hơi Không yêu cầu bay hơi,

mẫu phải tan được trongpha động

Mẫu phải bay hơi được

Độ phân cực Tách được cả 2 loại hợp

chất phân cực và khôngphân cực

Mẫu phân cực và khôngphân cực

Độ bền nhiệt Phép phân tích được thực Mẫu buộc phải tồn tại ở