nhu cầu thuốc phòng và điều trị bệnh đặc biệt là các bệnh nhiễm khuẩn nên việc tìm ra các thuốc mới càng cấp thiết hơn

Trong khoá luận này chúng tôi tiến hành tổng hợp một số dẫnxuất ngưng tụ chứa N của tetracyclin gồm : Mét hợp chất oxim, một hợp chấtazometin và 3 hợp chất hydrazon sau đó sơ bộ thăm dò

Có được kết quả ngày hôm nay, tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo - GS.TS Trần Mạnh Bình, cô giáo - TS Phạm Thị Minh Thuỷ cùng toàn thể các thầy cô kĩ thuật viên.

Tôi còng xin chân thành cảm ơn sự tận tình giúp đỡ của thầy giáo - TS Đỗ Ngọc Thanh ( Phòng nghiên cứu trung tâm ) và cô giáo - TS Chu Thị Léc ( Tổ môn Vi nấm - Kháng sinh ) cùng các bộ môn, phòng ban, bạn bè trong trường đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận.

Hà Nội ngày 27/5/2002.

Sinh viên Nguyễn Quyết Chiến.

Các base azometin, các oxim và các hydrazon đã được các nhà khoahọc trên thế giới nghiên cứu từ lâu, không chỉ được sử dụng như một chấttrung gian để tổng hợp một số hợp chất dị vòng chứa N hay tổng hợp

- aminoceton mà chính bản thân nó cùng có một số tác dụng sinh học nhưkháng khuẩn, kháng nấm, điều trị lao, hủi, lợi tiểu Nhiều chất trong số đó

đã được dùng làm thuốc

Tetracyclin là một kháng sinh trong họ kháng sinh Tetracyclin, lànhững dẫn chất của octahydronaphtacen 4 vòng có tác dụng trên nhiều loạicầu khuẩn và trực khuẩn Gram(+), Gram(-) Hiện nay tetracyclin Ýt được sửdụng cho trẻ em vì dễ tạo phức chelat với canxi do đó làm vàng răng trẻ em,hơn nữa nó có vị rất đắng

Với định hướng kết hợp cấu trúc azometin ( CH = N ), oxim ( = N

-OH ), hydrazon ( - HC = N - NH - ) với tetracyclin nhằm hy vọng tổng hợp ramột số hợp chất mới có tác dụng sinh học và ứng dụng được vào thực tế điềutrị lâm sàng Trong khoá luận này chúng tôi tiến hành tổng hợp một số dẫnxuất ngưng tụ chứa N của tetracyclin gồm : Mét hợp chất oxim, một hợp chấtazometin và 3 hợp chất hydrazon sau đó sơ bộ thăm dò tác dụng kháng khuẩn,kháng nấm của những chất tổng hợp được

Vào khoảng năm 1850 khi trộn một hỗn hợp đồng phân tử benzadehyd

và anilin thì Laurent và Gerhard thu được một hợp chất có công thức C13H11Ngọi là benzoylanilid (Sau này người ta tìm ra công thức cấu tạo là C6H5 - CH

= N - C6H5 và gọi tên là benzylidenanilin hay benzalanilin ) Đây là chất đầutiên thuộc dãy anilin thế

Từ năm 1864 đến nay, nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục nghiên cứumột cách có hệ thống phản ứng của các aldehyd với amin bậc 1, bậc 2 thuộcdãy béo, dãy thơm và dị vòng

Ví dô: Amin bậc 1 ( 1 mol )

Tại Việt Nam còng đã có một số công trình nghiên cứu về vấn đề này(GS-Đặng Như Tại và cộng sự)

Tại Trường Đại học Dược Hà Nội cũng đã có một số luận án PTSnghiên cứu tổng hợp các azometin từ các aldehyd thơm và amin thơm làmchất trung gian tổng hợp các dẫn chất thuộc dãy -aminoceton

1.1.2 Một số azometin - oxim và hydrazon dùng làm thuốc:

R-CHO + H2N – R’ R – CH = N – R’ + H2O

CH3NH O

6

biếng ăn7

N O H

O N O H

Thuốcchống lao

1.2 Sơ lược về Tetracyclin [2]

Tetracyclin là một trong những dẫn xuất của octahydronaphtacen 4vòng Đây là một kháng sinh trong nhóm kháng sinh có tên là tetracyclin Cáctetracyclin được chia thành 2 nhóm:

+ Các tetracyclin thiên nhiên có nguồn gốc từ Streptomyces

10

5a5 4a4 3

2 6

Các tetracyclin đều ở dưới dạng bột kết tinh màu vàng, vị đắng Dạngbase rất Ýt tan trong nước, tan trong ethanol và các dung môi hữu cơ Ýt phâncực Dạng muối hydroclorid tan được trong nước Là những hợp chất lưỡngtính có thể tạo muối với acid và kiềm Đặc biệt các tetracyclin tạo ra nhữngchelat bền vững với một số kim loại nh Ca, Mg, Fe do đó răng trẻ em bịnhuộm vàng khi dùng tetracylin lâu ngày ( 2  3 tuần ) Theo một số tác giảcác tetracyclin đọng lại ở trong răng trong những giai đoạn đầu của sự calcihoá, có ái lực với Ca của xương, do đó trẻ em dưới 8 tuổi có thể bị háng menrăng, phụ nữ có mang dùng tetracyclin thì có thể giảm sự phát triển của xươngdài và các nụ răng của thai người Nói chung các tetracylin có hoạt phổ tác

dụng rộng, bao gồm nhiều loại cầu khuẩn và trực khuẩn Gram(+) và

Gram(-), xoắn khuẩn, Rickettsia, Trichomonas, Amip, giun kim, Chlamydia, Mycoplasma, không có tác dụng trên trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn lao, Proteus, Candida albicans Tuy vậy các tetracyclin có tác dụng mạnh yếu

khác nhau trên một số vi khuẩn Ví dô nh với tụ cầu, lậu cầu, màng não cầu

thì clotetracyclin có tác dụng tốt hơn tetracylin, oxytetracyclin nhưng đối vớitrực khuẩn lỵ thì nguợc lại.

Các tetracyclin khác nhau cũng có thời hạn bán huỷ khác nhau, có mức

độ liên kết với protein của huyết thanh khác nhau do đó có liều dùng và mụcđích điều trị cũng khác nhau Ví dụ như doxycyclin hấp thụ nhanh và gần nhưtrọn vẹn, bài xuất lại rất chậm nên duy trì nồng độ trong máu khoảng 24 (h),trong khi đó tetracyclin lại bài xuất rất nhanh trong nước tiểu, do đó khi dùngdoxycyclin chỉ nên dùng ngày 1 lần với liều lượng thấp và không nên dùngtrong trường hợp nhiễm khuẩn đường niệu và bệnh nhân bị thiểu năng thận.Hai trường hợp này thì nên dùng tetracyclin có tác dụng ngắn hạn do bài xuấtnhanh

1.3 Tính chất chung của các Oxim - Hydrazon - Azometin.

1.3.1 Tính chất vật lí [15].

* Oxim.

Được hình thành do sự kết hợp của hydroxylamin với aldehyd hoặcceton Oxim thường là các chất rắn kết tinh, có điểm chảy xác định, Ýt tantrong nước( Trừ acetoxim ), tan trong alcolethylic, ether, DMF Oxim của cácaldehyd thơm và các ceton không đối xứng RCOR’ tồn tại dưới 2 dạng đồngphân syn và anti Dạng syn ( cấu hình cis ) là dạng có nhóm OH ở cùng phíavới gốc R hoặc Ar liên kết với Cacbon trong nhóm còn dạng anti cócấu hình đối lập Điểm nóng chảy của oxim dạng anti cao hơn dạng syn

* Azometin

Là những chất có cấu trúc imin ( - CH = N - ) thường không bền dokhuynh hướng polyme hoá, ngưng tụ hoặc thuỷ phân Dạng mạch hở thườngkhông bền, không thể tách ra thành dạng tự do

Các azometin có cấu trúc thế thì bền vững hơn azometin có cấu trúckhông thế

Với các azometin thế ở N ( dãy N - alkyl hoá hoặc N - aryl hoá ) cấutróc R - CH = N - R’ thì gốc R là mạch hở thường là chất lỏng và kém bền,trong đó cấu trúc CH2 = N - R’ tồn tại ở trạng thái trimer hoá song cấu trúccủa nó là một dị vòng, các chất khác nhanh chóng bị trùng hợp hoá Với gốc

R thơm thì azometin là những chất rắn kết tinh, tồn tại dưới dạng đơn phân tử,

có tính kiềm, Ýt tan trong nước, tan trong alcol, cloroform, benzen, DMF ,không tan trong ether

*Hydrazon

Phần lớn hydrazon thơm là chất kết tinh

Các hydrazon vừa mới điều chế thường có mầu vàng nhạt hoặc khôngmầu

Xác định điểm nóng chảy là một trong những cách để định tính các hợpchất carbonyl, tuy nhiên việc xác định điểm nóng chảy của các hydrazon cókhó khăn do nó dễ bị phân huỷ bởi nhiệt

Oxim của cyclohexanon khi hydro hoá với xúc tác đen platin trongdung dịch alcol - nước và hydrocloric tạo ra cyclohexyl hydroxylamin

Các aldoxim khi bị khử hoá cũng có thể tạo thành hydroxylamin vàamoniac

+ Các phản ứng alkyl hoá và acyl hoá

Oxim tác dụng với methyl iodua trong môi trường trung tính sẽ tạo radẫn xuất N-methyl

HO C6H5

C6H5

CN

Kết hợp với acid tạo muối

CH

R Cl(-)

(+)

- Cộng hợp các acid sulfurơ và các sulfit kiềm

C6H5 - CH = N - C6H5 + H2SO3 C6H5 - CH - N - C6H5

- Cộng hợp với acid cyanhydric : cho sản phẩm là nitril

R - CH = N - R’ + HCN R - CH - NH - R’

- Cộng hợp với các hợp chất cơ magie

Theo Busch và cộng sự, các hợp chất cơ magie có thể tham gia phảnứng cộng với các azometin là dẫn chất của aldehyd thơm với các amin thơm

- Phản ứng thuỷ phân các azometin thế

Các azometin N-alkyl bị thuỷ phân bởi dung dịch NaOH 30%, trongkhi đó các base azometin N-aryl thì bền vững trong kiềm và bị thuỷ phân dễdàng ở nhiệt độ lạnh với sự có mặt của acid vô cơ tạo aldehyd và amin tươngứng

Các azometin được tạo thành từ aldehyd thơm và amin thơm mới bền

vững, còn tạo thành từ aldehyd mạch hở và amin mạch hở thì thường không

bền, dễ bị trùng hợp ( đặc biệt nhiều chất dễ bị trimer hoá ) tạo hợp chất dị

+ Với sự có mặt của ZnCl2, arylhydrazon của một số lớn các hợp chất

carbonyl bị chuyển thành indol và amoniac Phản ứng được tiến hành bằng

cách nung chảy ở 180oC trên bình cách dầu

O R C NR'CH N C6H5

( azoic có màu )

+ Phản ứng khử hoá

Các hydrazon bị khử hoá tạo amin bậc nhất

Do đó dùa trên tính chất của nhóm carbonyl có thể ngưng tụ với cáchợp chất kiểu B - NH2 tạo sản phẩm kết tinh có điểm nóng chảy xác định.

1.4.2 Cơ chế phản ứng

Thực chất đây là phản ứng cộng hợp ái nhân vào nhóm carbonyl tạo rasản phẩm cộng trung gian rất không bền và bị tách nước ngay thành sản phẩmngưng tụ Cơ chế phản ứng được mô tả nh sau:

RR' NH2B+ -

Nhanh C

OH

RR' NH B

H2O-

-Đây là phản ứng thuận nghịch, cân bằng và tốc độ phản ứng phụ thuộcvào pH của môi trường Bước cộng hợp trong môi trường trung tính hoặc baseđều xảy ra nhanh và bước dehydrat hoá là bước quyết định tốc độ phản ứng.Bước dehydrat hoá luôn được xúc tác bởi acid nên thêm acid sẽ làm tăng tốc

độ phản ứng Nếu chỉ tính đến hợp chất carbonyl, phản ứng cộng hợp thuậnlợi khi [H+] cao, nhưng tác nhân B - NH2 trong môi trường [H+] lớn sẽ bịproton hoá tạo B - N+H3 làm mất đôi điện tử của nó Vì vậy điều kiện môitrường phản ứng tuỳ thuộc vào tính base của tác nhân B - NH2 và hoá tính củahợp chất carbonyl.

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng

a Yếu tố điện tử

Xét phản ứng cộng hợp ái nhân:

C O+

Nếu gốc B có khả năng hót điện tử sẽ làm giảm mật độ điện tử trên Nnên khả năng phản ứng của hợp chất giảm

+ Sù có mặt và vị trí của các nhóm thế trên nhân thơm cũng ảnh hưởng đến khả năng phản ứng.

Nhóm thế loại I ( ankyl, -OH, -OCH3 ) gây hiệu ứng +I, +M làm tăngmật độ điện tử trên N nên tham gia phản ứng cộng ái nhân AN dễ hơn anilin.Nhóm thế loại II ( -CHO, -NO2, -COOH ) cản trở phản ứng xảy ra

Nếu gốc R có khả năng hót điện tử ( -I, -M ) sẽ làm điện tích dương

trên C của nhóm carbonyl tăng nên, làm tăng khả năng phản ứng cộng hợp ái

nhân của hợp chất

Nếu gốc R có khả năng đẩy điện tử và khả năng này tăng lên theo số

lượng nguyên tử C sẽ làm điện tích dương phần trên C của carbonyl giảm dẫn

tới khả năng tham gia phản ứng cộng ái nhân càng giảm

Hiệu ứng liên hợp ( +M ) làm phân tử aldehyd thơm khó tham gia phản

ứng cộng ái nhân hơn formaldehyd Mặt khác sự có mặt và vị trí của các

nhóm thế trên nhân thơm cũng ảnh hưởng đến khả năng phản ứng của hợp

chất

 Các nhóm thế loại I gây hiệu ứng +I, +M làm tăng mật độ điện

tử trong nhân thơm và làm giảm điện tích trên C của nhóm carbonyl, làm khả

năng phản ứng kém hơn benzaldehyd

 Các nhóm thế loại II gây hiệu ứng -I, -M làm giảm mật độ điện

tử trên nhân thơm và làm tăng tính phân cực của liên kết carbonyl, phản ứng

cộng ái nhân dễ dàng xảy ra hơn

b Yếu tố không gian

Hiệu ứng không gian gây ra bởi các nhóm thế cũng ảnh hưởng nhiềuđến khả năng phản ứng Trong phản ứng cộng ái nhân của nhóm carbonyl,gốc R càng cồng kềnh thì càng gây hiện tượng án ngữ không gian, giảm khảnăng phản ứng.

Mặt khác yếu tố không gian của phân tử amin cũng ảnh hưởng nhiều vìbước cộng hợp từ hợp chất carbonyl có cấu trúc tam giác phẳng ( I ) khi cộnghợp sẽ hình thành sản phẩm cộng hợp tứ diện ( II ) và các nhóm thế phải thulại gần nhau hơn, vì vậy sự cộng hợp lại càng khó khăn

B + +

-Vậy phản ứng xảy ra thuận lợi nhất tại một pH nhất định chứ khôngphải trong môi truờng acid hay base mạnh Tại vị trí pH tối ưu này aldehydđược hoạt hóa mạnh đồng thời vẫn còn phần lớn thành phần ái nhân ở dạng tự

do không bị proton hoá Nói chung thường trong vùng trị số pK của tác nhân

* Tỷ lệ chất tham gia phản ứng: Đây là phản ứng đồng mol giữa

aldehyd và amin, do đó khi dư:

+ Aldehyd: Aldehyd sẽ bị oxh tạo acid tương ứng Đặc biệt aldehydthơm rất dễ bị oxy hóa:

Ar - CHO Ar - COOH

+ Amin: Sẽ cho sản phẩm phụ

v

pHpH

a

b

C%

* Dung môi là rất quan trọng đối với phản ứng Nếu các chất phản ứng

là chất rắn phải hoà tan trong dung môi ( Hoặc hỗn hợp dung môi ) phù hợp

để chúng có thể trộn đều Ngoài ra dung môi còn ảnh hưởng đến tính phâncực của liên kết còng như tính ái nhân ( Mật độ điện tử ) trên N làmphản ứng thuận lợi hoặc khó khăn.Phản ứng cộng hợp aldehyd với amin bậc Inếu chọn dung môi alcol sẽ làm sự phân cực của liên kết tăng giúpphản ứng được thuận lợi hơn

Phần 2 Thực nghiệm và kết quả

2.1 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm

2.1.1 Nguyên liệu

a Hoá chất

Tetracyclin hydroclorid, natri carbonat

Hydroxylamin hydroclorid, semicarbazid, thiosemicarbazid,paranitroanilin; 2,4-dinitrophenylhydrazin

Ethanol tuyệt đối, methanol, cloroform, dimethylformamid

Acid acetic khan, acid sulfuric đậm đặc

b.Dụng cụ, máy móc

Bình cầu 3 cổ dung tích 250ml, bình cầu cổ mài 100ml, sinh hàn hồilưu, nồi đun cách thuỷ, máy khuấy từ có bộ phận nhiệt, cốc có mỏ dung tích100ml, 200ml, bản mỏng sắc ký Silicagel Kieselgel 60F254 ( MERCK )

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm

a Nguyên tắc và sơ đồ phản ứng

Chuyển tetracyclin hydroclorid thành tetracyclin base dưới tác dụngcủa natricarbonat Sau đó thực hiện các phản ứng ngưng tụ loại nước giữaceton ( ở đây là tetracyclin base ) với một amin trong môi trường khan nước

( M = 481 )

B NH2

b Điều kiện phản ứng

Môi trường khan nước, sử dụng ethanol tuyệt đối

Nhiệt độ phản ứng duy trì ở nhiệt độ sôi của dung môi bằng đun hồi lưucách thuỷ có theo dõi bằng nhiệt kế, chất xúc tác là acid acetic khan hoặc acidsulfuric đậm đặc

Theo dõi quá trình phản ứng bằng SKLM, hệ dung môi làcloroform :methanol với tỷ lệ thích hợp

Cân chính xác khoảng 0,53g Na2CO3 ( 0,005 mol ) cho từ từ vào dịchlọc thu được ở trên và khuấy cho đến khi hết sủi bọt Tetracyclin base lắngxuống, để yên khoảng 20 phót

Lọc qua phễu Buchner, tủa thu được mang sấy khô trong tủ sấy chânkhông Sản phẩm mang làm các phản ứng ngưng tụ

*Kết quả:

Tetracyclin base có màu vàng sáng.

Khối lượng tủa sau sấy : 4,00g

Hiệu suất phản ứng: 90%

SKLM bản mỏng Silicagel, hệ dung môi triển khai cloroform :methanol( 6:4 ), dung môi hoà tan là ethanol, soi đèn tử ngoại được vết rõ Rf = 0,64

2.3 Tổng hợp Oxim, Azometin và Hydrazon của Tetracyclin

2.3.1 Tổng hợp oxim của tetracyclin ( Chất I )

tủ sấy chân không

*Kết quả

Sản phẩm dạng bột màu vàng trắng, có khối lượng 1,55g

OH 2

HN C S

NH2

HN C S

NH2

( M = 481 )

( M = 627 ) ( M = 91 )

OH 2

HN C

tủ sấy chân không

NO2 NO2

NO2( M = 481 )

* Tiến hành:

Trong bình cầu 3 cổ 100ml có lắp sinh hoàn hồi lưu hoà tan hoàn toàn2g 2,4 - dinitrophenylhydrazin ( 0,01mol ) trong 10ml ethanol tuyệt đối nóng,thêm từ từ vào bình phản ứng 5ml acid sulfuric đặc Sau đó thêm từ từ vàobình phản ứng dung dịch của 2,2 g tetracyclin base( 0,005 mol ) đã hoà tantrong 10ml ethanol tuyệt đối nóng Lắc đều hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưucách thuỷ có khuấy trong 60 phót, theo dõi phản ứng bằng SKLM Làm lạnhhỗn hợp bằng nước đá Kết tinh 2,4 - dinitrophenylhydrazon tetracyclin bằngcách cọ đũa thuỷ tinh vào thành bình, rửa tủa bằng nước cất đến hết acid, lọclấy tủa bằng phễu Buchner Tinh chế lại trong ethanol tuyệt đối Sản phẩmmang sấy khô ở nhịêt độ 400C trong tủ sấy chân không

Bảng 2: Độ tan của các chất tổng hợp được

2.4.2 Sắc kí líp mỏng

Dùng bản mỏng với chất hấp thụ là silicagel Kieselgel 60F254 MERCK với hệ dung môi là cloroform : methanol với tỷ lệ thích hợp Pháthiện vết bằng soi đèn tử ngoại bước sóng  = 365nm hoặc hơi iod bão hoà.Kết quả thu được trong bảng 3

- 6000 cm-1 tại phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội với

sự giúp đỡ của TS Đỗ Ngọc Thanh Hình ảnh các phổ IR được in trong phầnphụ lục Qua đó chúng tôi nhận thấy mỗi chất tổng hợp được đều có các dảihấp thụ đặc trưng tại vùng tương ứng với những nhóm chức của cấu trúc dựkiến tổ hợp được Kết quả phân tích quang phổ hồng ngoại được ghi chi tiếttrong bảng 4