Hiểu quả cảu interferon alpha và interfrron gâm gà biểu hiện trên hệ thống pichia pastoris trong phòng và điều trị bệnh gumboro trên gà 3 tuần tuổi

23 3.4.2 Ph ng pháp ki m tra kháng th kháng virus Gumboro b ng ph n ng ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ..... là tác nhân kích thích các i th c bào MAF-macrophage activating fact

TR NG I H C C N TH KHOA NÔNG NGHI P & SINH H C NG D NG

TR N HOÀI LÊN

HI U QU C A INTERFERON ALPHA VÀ

INTERFERON GAMMA GÀ BI U HI N TRÊN

TH NG PICHIA PASTORIS TRONG PHÒNG VÀ

U TR B NH GUMBORO TRÊN GÀ 3 TU N TU I

Lu n v n t t nghi p Ngành: THÚ Y

n Th , 2013

Lu n v n t t nghi p Ngành: THÚ Y

Tên tài:

HI U QU C A INTERFERON ALPHA VÀ

INTERFERON GAMMA GÀ BI U HI N TRÊN

TH NG PICHIA PASTORIS TRONG PHÒNG VÀ

U TR B NH GUMBORO TRÊN GÀ 3 TU N TU I

TR NG I H C C N TH KHOA NÔNG NGHI P & SINH H C NG D NG

MÔN THÚ Y

tài: “Hi u qu c a interferon alpha và interferon gamma gà bi u hi n

trên h th ng Pichia pastoris trong phòng và u tr b nh Gumboro trên gà 3

tu n tu i” do sinh viên Tr n Hoài Lên th c hi n t i tr i ch n nuôi th c nghi m và

phòng thí nghi m virus h c, B môn Thú Y, Khoa Nông Nghi p & Sinh H c ng

I C M N

Xin chân thành c m n:

Xin kính dâng lên ông bà, cha m lòng bi t n sâu s c và s quý tr ng nh t, nh ng

ng i luôn c g ng t o m i u ki n t t tôi th c hi n c hoài b o c a mình

Cô H Th Vi t Thu ã t n tâm h ng d n giúp và t o u ki n t t cho tôihoàn thành t t lu n v n t t nghi p này

Cô Nguy n Th Bé M i c v n h c t p luôn ng viên nh c nh tôi trong su t 5

p th l p Thú Y K35, các anh ch em trong ngành Thú Y ã giúp , chia s và

ng viên tôi trong quá trình h c t p và th c hi n tài

Xin kính g i n quý Th y, Cô, các anh ch , ng i thân và b n bè tôi l i chúc s c

kh e, thành công và xin nh n n i tôi lòng bi t n sâu s c

n Th , ngày tháng n m 2013.Sinh viên th c hi n tài:

Tr n Hoài Lên

C L C

Trang ph bìa i

Trang ký duy t ii

I CAM OAN ii

I C M N iii

C L C iv

DANH M C CH VI T T T vii

DANH SÁCH B NG ix

DANH SÁCH HÌNH x

TÓM L C xi

Ch ng 1 T V N 1

Ch ng 2 C S LÝ LU N 3

2.1 Interferon .3

2.1.1 S l c v interferon 3

2.1.2 Phân lo i interferon 4

2.1.3 Ho t tính sinh h c c a interferon 4

2.2 Interferon gà .5

2.2.1 Phân lo i interferon gà 5

2.2.2 Interferon-alpha gà 6

2.2.3 Interferon -gamma gà 7

2.2.4 S bi u hi n c a interferon-alpha và interferon-gamma gà trên th ng Pichia pastoris 7

2.2.5 Các nghiên c u s d ng interferon-alpha và interpheron-gamma gà tái t h p trên gia c m 8

2.3 B nh Gumboro 9

2.3.1 Khái ni m v b nh Gumboro 9

2.3.2 c m hình thái, c u trúc c a virus Gumboro 9

2.3.3 C ch sinh b nh 10

2.3.4 Tri u ch ng và b nh tích 11

2.3.4.1 Tri u ch ng 11

2.3.4.2 B nh tích 12

2.3.5 Phòng b nh và u tr 13

2.3.5.1 Phòng b nh 13

2.3.5.2 u tr 14

2.4 Các y u t nh h ng n kh n ng nhi m b nh Gumboro trên gà 15

2.4.1 Gi ng gà 15

2.4.2 Tu i gà 15

2.4.3 Gi i tính gà 15

2.5 Tình hình nghiên c u ChIFN trong và ngoài n c 15

2.5.1 Trong n c 15

2.5.2 Ngoài n c 16

Ch ng 3 N I DUNG VÀ PH NG PHÁP THÍ NGHI M 19

3.1 N i dung thí nghi m 19

3.2 Ph ng ti n thí nghi m 19

3.2.1 Th i gian và a m 19

3.2.2 V t li u thí nghi m 19

3.3 Ph ng pháp thí nghi m 20

3.3.1 Ph ng pháp chu n b huy n d ch b nh ph m 20

3.3.2 Chu n huy n d ch virus Gumboro 20

3.3.3 Xác nh c l c c a virus Gumboro trên gà 3 tu n tu i 21

3.3.4 ánh giá hi u qu phòng và u tr b nh Gumboro c a rChIFN- và rChIFN- trên gà 3 tu n tu i 21

3.4 Ph ng pháp xét nghi m 23

3.4.1 Ph ng pháp ki m tra virus Gumboro b ng ph n ng k t t a khu ch tán trên th ch (Agar gel precipitation, AGP) 23

3.4.2 Ph ng pháp ki m tra kháng th kháng virus Gumboro b ng ph n ng ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) 24

3.5 Các ch tiêu theo dõi 27

3.6 Ph ng pháp x lý s li u 28

Ch ng 4 K T QU VÀ TH O LU N 29

4.1 Chu n và xác nh ELD50 trên phôi gà 29

4.2 K t qu kh o sát kh n ng gây b nh c a virus Gumboro trên gà 3 tu n tu i 30

4.3 K t qu ánh giá hi u qu phòng và u tr b nh Gumboro c a rChIFN-và rChIFN- trên gà 3 tu n tu i 31

4.4 K t qu theo dõi tri u ch ng lâm sàng gà thí nghi m 32

4.5 K t qu kh o sát b nh tích qua m khám 32

4.6 K t qu ki m tra virus Gumboro b ng ph n ng k t t a khu ch tán trên th ch AGP (Agar gel precipitation) 34

4.7 K t qu ki m tra áp ng mi n d ch v i virus Gumboro b ng ph n ng ELISA 34

4.8 K t qu theo dõi tr ng l ng c a gà thí nghi m tr c và sau khi gây nhi m IBDV 38

Ch ng 5 K T LU N VÀ NGH 41

5.1 K t lu n 41

5.2 ngh 41

TÀI LI U THAM KH O 42

Cyclic adenosine monophosphateComplementary deoxyribonucleic acidChicken embryo fibroblast

Chicken interferonCell line derived from kidney cells

of the African green monkey

ng tác viênDeoxyribonucleic acid

i ch ngEmbryo lethal dose 50%

Enzyme linked ìmmuno sorbent assayGuanylate-binding protein

Human leukocyte antigenInfectious bursal disease virusInfectious bronchitis virus

InterferonInterferon regulatory factorInternational unit

Macrophage activating factorMammalian interferonMarek’s disease virusMajor histocompatibility complexMessenger ribonucleic acidNegative control

Kháng thNatural killTurkey interferon

i th c bào

t t a khu ch tán trên th chVirus cúm gia c m

bào x phôi gàInterferon gàDòng t bào t t bào th n c a khxanh Châu Phi

Li u gây ch t 50% phôi

Ph n ng mi n d ch g n menProtein g n k t GuanylateKháng nguyên b ch c u ng iVirus gây b nh GumboroVirus gây viêm ph qu n truy nnhi m

u t u hòa interferon

n v qu c tTác nhân ho t hóa i th c bàoInterferon loài h u nh

Virus gây b nh Marek's

Ph c h p hòa h p t ch cRNA thông tin

Trung bình i ch ng âm

DANH SÁCH B NG

3.1 B trí thí nghi m xác nh ch s ELD50 a IBDV trên phôi gà…… 21

3.2 trí thí nghi m kh o sát c l c c a virus Gumboro trên gà 3 tu n tu i gà 22

3.3 trí thí nghi m ánh giá hi u qu phòng b nh Gumboro c a rChIFN- và rChIFN- trên gà 3 tu n tu i 22

3.4 trí thí nghi m ánh giá hi u qu u tr b nh Gumboro c a rChIFN- và rChIFN- trên gà 3 tu n tu i 23

3.5 B trí thí nghi m m u huy t thanh trong xét nghi m ELISA 26

4.1 T l phôi gà ch t các n ng IBDV pha loãng 29

4.2 T l gà m c b nh và gà ch t các nghi m th c thí nghi m 30

4.3 l gà m c b nh và t l gà ch t các nghi m th c trong vi c phòng b nh Gumboro 31

4.4 l gà m c b nh và t l gà ch t các nghi m th c trong vi c u tr b nh Gumboro 31

4.5 T n su t xu t hi n tri u ch ng trên gà thí nghi m m c b nh 32

4.6 T n su t xu t hi n b nh tích trên gà ch t trong thí nghi m 33

4.7 t qu ki m tra virus Gumboro t b nh ph m b ng ph n ng k t a khu ch tán trên th ch (AGP) 34

4.8 T l gà áp ng mi n d ch v i virus Gumboro qua ph n ng ELISA 35

4.9 Giá tr S/P c a các m u huy t thanh tr c và sau thí nghi m phòng nh Gumboro 36

4.10 Giá tr S/P c a các m u huy t thanh tr c và sau thí nghi m u tr nh Gumboro 36

4.11 Hi u giá kháng th c a gà tr c và sau thí nghi m phòng b nh Gumboro 36

4.12 Hi u giá kháng th c a gà tr c và sau thí nghi m u tr b nh Gumboro 37

4.13 t qu tr ng l ng trung bình c a gà tr c và sau thí nghi m phòng b nh Gumboro 38

4.14 t qu tr ng l ng trung bình c a gà tr c và sau thí nghi m u tr b nh Gumboro 39

DANH SÁCH HÌNH

2.1 C u trúc interferon ng i 4

2.2 C u trúc c a virus gây b nh Gumboro 10

2.3 C ch sinh b nh c a virus Gumboro 11

3.1 M u th ch dùng làm ph n ng AGP 24

4.1 Gà rúc u vào cánh 32

4.2 Gà r , n m ph ph c 32

4.3 Xu t huy t c ùi 33

4.4 Xu t huy t c ng c 33

4.5 Xu t huy t tuy n c 33

4.6 Th n s ng 33

4.7 K t qu xét nghi m ELISA 34

4.8 Bi u hi u giá kháng th c a gà tr c và sau trong vi c phòng nh Gumboro 37

4.9 Bi u hi u giá kháng th c a gà tr c và sau trong vi c u tr nh Gumboro 37

4.10 Bi u tr ng l ng trung bình c a gà các nghi m th c trong trong vi c phòng b nh Gumboro……… ………… 39

4.11 Bi u tr ng l ng trung bình c a gà các nghi m th c trong trong vi c u tr b nh Gumboro……… 40

TÓM L C

tài: "Hi u qu c a interferon alpha và interferon gamma gà bi u hi n trên h

th ng Pichia pastoris trong phòng và u tr b nh Gumboro trên gà 3 tu n tu i" c th c

hi n t i tr i ch n nuôi th c nghi m và phòng thí nghi m virus h c, B môn Thú Y, Khoa Nông nghi p và Sinh h c ng d ng, tr ng i h c C n Th t tháng 08/2013 n 12/2013,

interferon gamma gà (ChIFN- ) bi u hi n trên h th ng Pichia pastoris (P pastoris) trong phòng và u tr b nh Gumboro trên gà 3 tu n tu i qua ba thí nghi m: ki m tra c l c c a virus Gumboro, ánh giá kh n ng phòng b nh Gumboro c a rChIFN- và rChIFN- trên gà

3 tu n tu i, và ánh giá kh n ng u tr b nh Gumboro c a rChIFN- và rChIFN- trên gà

3 tu n tu i Thí nghi m ki m tra c l c c a virus Gumboro g m 2 nghi m th c, nghi m th c virus (gà c gây nhi m v i virus Gumboro) và so sánh v i nghi m th c i ch ng K t qu virus Gumboro dùng trong thí nghi m là ch ng virus có c l c cao v i t l gà b nh là 100% và t l gà ch t là 36,67%, so v i nghi m th c i ch ng không có gà b nh và gà ch t Thí nghi m ánh giá kh n ng phòng b nh Gumboro c a rChIFN- và rChIFN- v i 4 nghi m th c: nghi m th c phòng b nh v i li u 100µg rChIFN- + 1µg rChIFN- (NT1); nghi m

th c phòng b nh v i li u 10µg rChIFN- + 1µg rChIFN- (NT2); nghi m th c i ch ng âm, gà

nhi m v i 0,2ml d ch virus Gumboro (10 5 ELD 50 ) và không c u tr (NT4) NT1 và

liên t c 3 ngày, sau ó 24 gi gây nhi m v i virus Gumboro K t qu , khi phân tích th ng kê

l gà b nh, có s khác bi t có ý ngh a gi a 2 NT s d ng rChIFN so v i 2 NT i ch ng và

2 NT i ch ng khác bi t có ý ngh a v i nhau Nh ng ch có NT i ch ng d ng khác bi t

có ý ngh a v i các NT còn l i khi phân tích th ng kê t l gà ch t u này cho th y, vi c s

ng rChIFN có tác d ng trong phòng b nh Gumboro và gi m c t l gà ch t Thí nghi m

nghi m th c u tr b nh v i li u 100µg rChIFN- + 1µg rChIFN- (NT1); nghi m th c i

ng, gà c gây nhi m v i 0,2ml d ch virus Gumboro (10 5 ELD 50 ) và không c u tr (NT3) NT1 sau 8 gi gây nhi m v i virus Gumboro gà c u tr v i d ch rChIFN- + rChIFN- + n c c t v a 0,2ml và ti p t c dùng liên ti p 5 ngày K t qu : t l gà m c

nh, NT1 khác bi t có ý ngh a th ng kê v i các nghi m th c i ch ng Nghi m th c i

ch ng âm và i ch ng d ng khác bi t có ý ngh a th ng kê t l gà ch t, ch có nghi m

th c i ch ng d ng là khác bi t có ý ngh a th ng kê v i các nghi m th c còn l i K t qu trên cho th y rChIFN c ng có tác d ng trong u tr b nh Gumboro và h n ch t l gà ch t Bên c nh ó, các NT s d ng rChIFN còn có tr ng l ng trung bình khác bi t có ý ngh a so

i NT i ch ng d ng, ch ng t rChIFN có kh n ng c i thi n t ng tr ng c a gà K t qu trên cho th y, khi s d ng k t h p 100µg rChIFN- + 1µg rChIFN- thì cho hi u qu trong phòng và u tr b nh Gumboro trên gà.

Ch ng1

T V N

Ngày nay, cùng v i s gia t ng dân s thì nhu c u v th c ph m c ng t ng theo

áp ng nhu c u ó c n ph i phát tri n ngành ch n nuôi, c bi t là ch n nuôi theoquy mô công nghi p Tuy nhiên khi phát tri n ch n nuôi theo quy mô công nghi pang g p ph i m t s khó kh n nh : giá th c n t ng cao, giá c a các s n ph m ch nnuôi b bi n ng và quan tr ng nh t là các d ch b nh Trong ó, b nh Gumboro là 1trong nh ng b nh nguy hi m, gây t n th t l n trên gà

nh Gumboro là b nh truy n nhi m c p tính c a gà do virus gây ra, c tr ng

i s t n th ng túi Fabricius, làm suy gi m kh n ng mi n d ch c a gà, làm gia t ngnguy c nhi m b nh và gi m kh n ng áp ng mi n d ch khi tiêm phòng B nh gây

n th t kinh t l n do t l gà m c b nh có th t i 100% và t l ch t có th t 50% (Nguy n Xuân Bình và ctv, 2005) B nh tích n hình: xu t huy t c ùi, c

20-ng c, s 20-ng và xu t huy t túi Fabricius, xu t huy t n i ti p giáp gi a d dày tuy n và dày c (Ph m S L ng và Nguy n Thi n, 2004).B nh Gumboro là b nh do virusgây ra, vì v y v nguyên t c thì không có thu c u tr (H Th Vi t Thu và Nguy n

c Hi n, 2012), do ó ChIFNs c xem là bi n pháp phòng và tr b nh có ti mng

Interferon (IFN) là m t nhóm các protein t nhiên c s n xu t b i các t bào

a h mi n d ch h u h t các ng v t nh m ch ng l i các tác nhân ngo i lai nhvirus, vi khu n, kí sinh trùng và t bào ung th Ngày nay, cùng v i s phát tri n c akhoa h c k thu t, các nhà khoa h c ã s n xu t c IFN tái t h p trên các h th ng

bi u hi n, trong ó có h th ng n m men Pichia pastoris Có kh n ng s n xu t ra 1

ng l n IFN tái t h p v i tinh khi t cao, ho t tính sinh h c g n gi ng v i IFN tnhiên, giá thành th p và d s d ng Hi n nay, Trung tâm Công ngh Sinh h c Thành

ph H Chí Minh ã s n xu t thành công ChIFN- tái t h p và ChIFN- tái t h p

bi u hi n trên h th ng P pastoris Sinh ph m này n c xác nh hi u qu phòng

và u tr in vivo các b nh do virus gây ra trên gà trong ó có b nh Gumboro.

Trên c s ó, chúng tôi ti n hành th c hi n tài: "Hi u qu c a interferon

alpha và interferon gamma gà bi u hi n trên h th ng Pichia pastoris trong

phòng và u tr b nh Gumboro trên gà 3 tu n tu i".

c mô t khi t bào b nhi m virus thì các t bào này s không b nhi m ti p và các bào lân c n s có th không b nhi m b i chính các virus y và các virus khác (Ph m

ng này có liên quan t i s t o thành trong t bào nhi m virus m t ch t c bi t và

t tên là interferon vi t t t là IFN (trích d n Ph m V n Ty, 2005)

Interferon (IFN) là m t nhóm các protein t nhiên c s n xu t b i các t bào

a h mi n d ch h u h t các ng v t nh m ch ng l i các tác nhân ngo i lai nhvirus, vi khu n, kí sinh trùng và t bào ung th Interferon thu c m t l p l n c aglycoprotein c bi t n d i cái tên cytokine (ch t ho t hoá t bào) Interferonóng vai trò quan tr ng trong c a ngõ mi n d ch c a c th Nó là m t ph n c a h

th ng mi n d ch không c hi u (non-specific immune system) và c kích ho t b igiai n u c a quá trình c m nhi m tr c khi h mi n d ch c hi u (specificimmune system) có th i gian ph n ng (trích d n H Nhân, 2007)

IFN có phân t l ng th p (t 18 kD n 24 kD) do t bào s n sinh ra sau khi

c kích thích b i virus ho c m t s ch t c m ng sinh IFN nh các ch tpolynucleotide t ng h p (poly IC, poly GC,…), ho c là các th thu c thích h p nhTheophyllin, Cofein, Dipyridamol,…M t s vacxin nh vacxin phòng b i li t, vacxin

i, vacxin ho gà,… có th kích thích t bào t ng h p IFN Nh ng glycoprotein này c

ch c nhi u lo i virus nhân lên trong t bào k c virus gây ung th IFN còn làm

ng tính nh y c m c a t bào ung th i v i các tia x dùng trong tr li u

Trong c th bình th ng b t c lo i t bào nào c ng có th ph n ng sinh IFN.IFN là y u t quan tr ng nh t t ng s c kháng không c hi u c a c th i v i cácvirus và các t bào ung th

Hình 2.1 C u trúc interferon ng i

(http://en.wikipedia.org/wiki/Interferon)

2.1.2 Phân lo i interferon

Theo Ph m V n Ty (2005), các INF c chia làm 2 type: type I và type II

Type I: g m IFN- và INF- IFN- có ít nh t 15 type ph có kh i l ng phân tkho ng 18 kDa Các gene mã hóa c a chúng có 85% tính t ng ng Ngu n t bàochính s n xu t IFN- là b ch c u n nhân IFN- là glycoprotein v i kh i l ng phân

20 kDa, là s n ph m n gene, t bào ch y u s n xu t IFN- là nguyên bào s i.Type II: là IFN- hay còn g i là IFN mi n d ch vì chúng ch y u là do t bào T

ho t hóa s n xu t nên th c ch t c ng là m t lymphokin IFN- là glycoprotein g m 2chu i gi ng nhau v i kh i l ng phân t 21 kDa và 24 kDa c mã hóa b i các gene

n KT c hi u, còn KT xu t hi n sau ch có tác d ng lâu dài ch ng tái nhi m

- IFN có tác d ng c ch s t ng sinh nhanh chóng c a t bào ác tính, u này

ng là do tác ng ng n c n quá trình t ng h p protein IFN – c dùng c ch

t ng sinh c a các t bào ung th , ví d ung th b ch c u t bào tua (t bào ác tínhlympho B có tua sinh ch t), u m ch (angioma) tr ,…

- IFN có vai trò ho t hóa t bào NK chúng phá h y t bào ích nhi m virus

- IFN có tác d ng t ng c ng s bi u hi n c a glycoprotein MHC – I và II trên b

t t bào, t o u ki n cho các t bào c a h th ng mi n d ch nh n di n KN virus

- IFN – v i t cách là lymphokin tham gia vào quá trình u hòa mi n d ch, thúc

y quá trình bi t hóa c a lympho T, NK, TB

- Có ý ki n cho r ng, IFN ng n c n s nhân lên c virus b ng cách h n ch s xâm

nh p c a virus vào t bào, c ch quá trình “c i áo” và s n y ch i gi i phóng virus

kh i t bào

• ch tác d ng:

- Khi virus ho c các tác nhân c m ng s n sinh IFN khác xâm nh p vào t bàoeukaryote, sau vài gi ho c th m chí sau m t ngày IFN s c hình thành IFN schui qua màng sinh ch t ra ngoài, g n vào th th dành cho nó trên m t t bào lân c n

- Có hai lo i th th c hi u dành cho IFN M t lo i dành chung cho c IFN –

và IFN – và m t lo i dành cho IFN – IFN tác ng nh m t hoocmon, nh AMPvòng tác ng vào nhân t bào c m ng b gene t bào t ng h p ít nh t 2 enzyme làkinaza và 2, 5 – oligoadenylat syntetaza C 2 lo i enzyme này u c ho t hóa nhARN kép do virus c m ng t o thành u ó có ngh a là các enzyme này ch c

ho t hóa khi có virus xâm nh p vào t bào Kinaza làm b t ho t m t enzyme c n cho

l p ráp ribosome, do ó c ch t ng h p protein Còn 2, 5 oligoadenylat syntetaza

ho t hóa enzyme ribonucleaza phá h y mARN c a virus và do ó c ng c ch luônquá trình t ng h p protein c a virus

2.2 Interferon gà

2.2.1 Phân lo i interferon gà

Type I: interferon gà (ChIFN) u tiên c t o dòng thành công là ChIFNtype I, v i ngu n gene t th vi n cDNA (Complementary deoxyribonucleic acid) các bào x phôi gà, g m ChIFN-α và ChIFN- Khi so sánh v i ChIFN t nhiên, ChIFNtái t h p này có kh n ng kháng virus cao h n C hai d ng c glycosyl hóa vàkhông glycosyl hóa c a ChIFN type I u ho t ng Tuy nhiên, ChIFN type I l i thi u

u t ho t hóa các i th c bào (Sekellick và ctv, 1994; Schultz và ctv, 1995) vàChIFN-α có ho t tính kháng virus cao g p 20 l n so v i ChIFN- , các protein c a 2nhóm gen ChIFN-α và ChIFN- u có tính b n v i nhi t và acid

Type II: ChIFN type II u tiên c t o dòng t th vi n cDNA các t bào T

c ho t hóa và các i th c bào c a gà, t tên là ChIFN-γ ChIFN- tái t h p nh y

m v i nhi t cao và pH th p, có th b b t ho t nhi t 60oC và pH = 2

là tác nhân kích thích các i th c bào (MAF-macrophage activating factor) s n xu tcác h p ch t nitrogen trung gian ho t hóa nh nitric oxide, nitrate, và nitrite; kh n ngnày không tìm th y ChIFN type I (Weining và ctv, 1996; Digby và Lowenthal, 1995;Song và ctv, 1997)

ChIFN- còn có kh n ng c m ng t ng h p protein g n k t guanylate (GBP –guanylate-binding protein) và c m ng t ng h p các y u t u hòa IFN (IRF-1 – IFN

regulatory factor 1) trên các t bào ích ng th i, ChIFN- có tác d ng c m ng s

bi u hi n các kháng nguyên MHC l p II trên b m t các i th c bào và các lo i t bàokhác gà (Weining và ctv, 1996; Digby và Lowenthal, 1995; Janardhana và ctv,2007)

Tuy nhiên, th hi n kh n ng kháng virus kém h n so v i (Song và ctv, 1997) Nghiên c u cho th y, ChIFN- không có kh n ng ng n ch n quátrình c m ng gây phá v c u trúc t bào ch c a virus sau khi xâm nh p (Weining vàctv, 1996)

ChIFN-N m 1979, Fleischmann l n u tiên phát hi n ra vi c k t h p 2 lo i IFChIFN-N type I và

II s t ng kh n ng kháng virus so v i tr ng h p t ng lo i IFN tác ng riêng r trênchu t D a vào phát hi n này, Sekellick và ctv (1998) ã th c hi n 1 nghiên c u trên

n h p ChIFN type I và type II (ChIFNs) ChIFN type I c thu nh n t h th ng tbào COS ChIFN type II c bi u hi n trong E coli K t qu nghiên c u trên t bào x

phôi gà (CEF − Chicken embryo fibroblast) cho th y, trong tr ng h p x lý b ng h n

p ChIFNs, s l ng v t tan (plaque) hình thành gi m i 8 l n và các plaque c ng cókích th c nh h n N ng ChIFNs khi tác ng ph i h p th p h n n ng c a cácChIFN khi tác ng riêng l 4 l n Qua ó cho th y, s k t h p gi a ChIFN type I vàChIFN type II ã làm t ng kh n ng kháng virus

2.2.2 Interferon-alpha gà

N m 1994, nghiên c u v t o dòng, bi u hi n và phân tích trình t ChIFN- l n

u tiên ã c Sekellick công b ChIFN- không có intron, mã hóa cho 1 proteindài 193 amino acid, trong ó n peptide tín hi u dài 31 amino acid và protein tr ngthành có chi u dài 162 amino acid Tr ng l ng phân t protein tr ng thành là18.957 Da (Sekellick và ctv, 1994) ChIFN- có kh n ng b n nhi t cao và trongmôi tr ng acid th p, gi c ho t tính 85oC trong vài phút ho c pH = 2 trong 24

gi (Weining và ctv 1996)

ChIFN- c s n xu t khi c th gà ph n ng l i s xâm nhi m c a virus, và

c s n xu t b i nhi u lo i t bào khác nhau (Pei và ctv, 2001) ChIFN- có c tínhkháng virus m nh và kh n ng kìm hãm s nhân lên c a nhi u lo i virus nh : Roussarcoma virus (Plachy và ctv, 1999), virus gây b nh Marek (MDV) (Jarosinski và ctv,2001), virus gây b nh Newcastle (NDV) (Marcus và ctv, 1999), virus cúm gia c m(AIV) (Sekellick và ctv, 2000; Xia và ctv, 2004), virus gây viêm mi ng m n n c(VSV) và SFV (Sekellick và ctv, 1994), virus gây viêm ph qu n truy n nhi m (IBV)(Pei và ctv, 2001)

Gene IFN- c t o dòng t nhi u loài gia c m khác nhau nh v t (Schultz vàctv, 1995), gà tây (Suresh và ctv, 1995), v i 50% và 82% t ng ng v thành ph namino acid v i ChIFN- (theo th t t ng ng), trong ó ChIFN- gà và TuIFN-

gà tây có ph n ng chéo loài (cross-reactive) (Suresh và ctv, 1995) Kh n ng kháng

(Jiang và ctv, 2011) ây là c s th nghi m s d ng ChIFN- u tr các b nh

do virus trên các loài khác nhau thu c h gà

2.2.3 Interferon gamma gà

N m 1995, Digby M.R và các c ng s ã t o dòng thành công gene mã hóa choChIFN- l n u tiên và bi u hi n protein này trên h th ng t bào COS (Digby và ctv,1995) K t qu nghiên c u cho th y: cDNA c a ChIFN- mã hóa cho m t protein dài

164 amino acid Trong ó, ph n peptide tín hi u ch a 19 amino acid, vì v y

ChIFN-tr ng thành dài 145 amino acid, t ng ng v i tr ng l ng phân t kho ng 16,8 kDa

ng t nh IFN- các loài khác, ChIFN- có 1 vài uôi cystein, khi c bi n ithành protein tr ng thành, ChIFN- ch còn 2 uôi cystein u C (Michalski và ctv,1999) K t qu so sánh v trình t amino acid cho th y: ChIFN- t ng ng 32% v iMaIFN- , ch t ng ng 15% v i ChIFN- (Digby và ctv, 1995) ChIFN- tái t

p nh y c m v i nhi t cao và pH th p, có th b b t ho t trong u ki n 60oC và

pH = 2 (Digby và ctv, 1995; Lowenthal và ctv, 1995)

2.2.4 S bi u hi n c a interferon-alpha và interferon-gamma gà trên h th ng Pichia pastoris

Hi n nay, vi c s d ng kháng sinh trong u tr các b nh do virus trên gia c m

ch a cho tác d ng h u hi u, do ó ChIFNs c xem là bi n pháp phòng tr có ti m

ng Vì t m quan tr ng nh v y nên IFN ã c u t nghiên c u và s n xu t quy mô th ng m i Tr c ây, khi dùng ph ng pháp c , m i t bào b ch c u chcho kho ng 100 – 1.000 phân t IFN Ngày nay, b ng k thu t tái t h p DNA, m i tbào vi khu n có th cho 200.000 phân t IFN, ngh a là hi u su t t ng 100 – 1.000 l n

Nh v y, c 3 lo i ChIFN-α, - , - ã c bi u hi n và s n xu t ra v i tinh khi tcao, và c ánh giá là có công hi u v i nhi u lo i virus gây b nh

ChIFN-α tái t h p (rChIFN-α) c t o ra u tiên b i Sekelick và ctv, (1994)

d ng t bào E coli Nh ng nghiên c u sau ó, ChIFN-α ã c nhân dòng và bi u

hi n vi khu n E coli (Plachy và ctv, 1999; Sekelick và ctv, 1994; Xia và ctv, 2004),

bào COS (Schultz và ctv,1995), Baculovirus (Ruttanapumma và ctv, 2005), bào t

B subtilis n và ctv, 2008) và g n ây là trong rau di p, cây thu c lá (Song và ctv,

2008, 2009) ChIFN- tái t h p (rChIFN- ) c nhân dòng và bi u hi n trên h th ng

bào COS (Digby và ctv, 1995) và trong vi khu n E.coli (Sekellick và ctv, 1998).

Khi nói v h th ng n m men, hi n nay có hai h th ng bi u hi n là

Saccharomyces cerevisiae (S cerevissiae) và Pichia pastoris (P Pastoris) T bào

m men là c coi là m t gi i pháp t t cho vi c bi u hi n protein c a eukaryote

i h ng ng d ng vào s n xu t l n Tuy nhiên, S cerevisiae là m t h th ngtruy n th ng còn có m t nh c m Bên c nh ó, P pastoris tuy m i c ng

ng n ây nh ng ã cho th y ti m n ng l n trong vi c s n xu t protein

t trong s các u m khi s d ng P pastoris làm h th ng bi u hi n là P.

pastoris có th phát tri n v i m t t bào cao h n nhi u l n so v i S cerevisiae và

có kh n ng t ng tr ng trong môi tr ng n gi n, r ti n Vì v y, có th bi u hi nprotein v i hàm l ng cao c trong nghiên c u phòng thí nghi m l n trong s n xu tquy mô công nghi p (Balamurugan và ctv, 2007).

P pastoris có kh n ng phát tri n pH t 3 t i 7 do ó có th u ch nh pH

gi m thi u t i a ho t ng c a protease i v i protein ti t ra (Romanos, 1995)

Ngoài ra, P pastoris là m t eukaryote, nên có th cung c p môi tr ng thích h p chorChIFN-α ti t ra, c ng nh th c hi n các bi n i sau d ch mã (x lý phân c t protein,

p cu n, hình thành c u n i disulfide, và glycosyl hóa) (Macauley-Patrick vàctv, 2005)

P pastoris s d ng methanol làm ch t c m ng bi u hi n protein, ây là m t hóa

ch t r ti n (Balamurugan và ctv, 2007) Bên c nh ó, do có kh n ng s d ngmethanol nh ngu n carbon chính nên trong môi tr ng nuôi c y ch a nhi umethanol, h n ch c vi c nhi m các loài vi sinh v t khác

2.2.5 Các nghiên c u s d ng interferon-alpha và interferon-gamma gà tái t h p trên gia c m

Theo Plachy (1999), 100 IU/ml ChIFN- c ch c s t ng sinh kh i u doRous sarcoma virus gây ra V i ch c n ng u hòa mi n d ch, ChIFN-α còn cdùng nh ch t b tr làm t ng hi u qu c a vaccine DNA i v i b nh c u trùng do

Eimeria acervulina gây ra (Min và ctv, 2001).

N m 1999, Marcus và ctv th nghi m ho t tính c a rChIFN-α b ng ng u ng

i n ng 1.000 – 2.000 IU/ml trong 11 ngày và th y r ng cách u tr này c i thi n

c tình hình b nh Newcastle trên gà V i li u l ng này, các tri u ch ng nguy hi m

a b nh gi m th y rõ, ng th i tránh c tình tr ng lây lan và bùng phát b nh

Theo Pie và ctv (2001) th nghi m ho t tính c a d ch ChIFNs in vivo và thu

c k t qu kh quan ChIFN-α tái t h p (1.000 IU) b o v gà ch ng l i b nh truy n

nhi m do virus gây viêm ph qu n in vivo Bên c nh ó, gà u ng n c ch a 2.000 IU/ml làm gi m áng k s nhân lên c a virus Marek (Jarosinski và ctv, 2001)

ChIFN-α tái t h p v i n ng cao 104 IU có th làm gi m t ng ng h n 40%

và 100% virus cúm H9N2 in ovo và in vivo gà con 1 - 5 ngày tu i (Xia và ctv, 2004).

G n ây, Meng và ctv (2011) kh o sát tác ng kháng virus cúm H9N2 c aChIFN-α b ng ng u ng trên gà SPF (Specific pathogen free) 7 và 33 ngày tu i, v i

li u l n l t 0,5.104 IU và 104 IU K t qu cho th y, ChIFN-α ã c ch s nhân lên

và làm gi m áng k l ng virus trong c th c a c hai nhóm gà c phòng và tr

ng ChIFN-α khi so sánh v i nhóm gà i ch ng

N m 1997, Lowenthal xác nh ho t tính in vivo c a ChIFN- trên gà con 7 ngày

tu i b nhi m Eimeria b ng cách tiêm vào b ng 5.000 IU/ngày K t qu cho th y, so

i nhóm i ch ng không c tiêm ChIFN- , kh i l ng gà c a nhóm thí nghi m

ng u, không có tri u ch ng s t gi m kh i l ng do tác ng xâm nhi m c a virus

2.3 B nh Gumboro

2.3.1 Khái ni m v b nh Gumboro

B nh Gumboro hay còn g i là b nh viêm túi Fabricius truy n nhi m (Infectiousbursal disease - vi t t t là IBD), là m t b nh truy n nhi m c p tính do virus thu c chi

Avibirnavirus h Birnaviridae gây ra, có tính lây lan m nh và x y ra ch y u gà con.

nh ch bi u hi n tri u ch ng lâm sàng giai n 1-12 tu n tu i, nh ng rõ nh t giai n 3-6 tu n tu i Trong giai n này t l gà m c b nh có th t i 100% và t l

ch t t 20 - 50% (Nguy n Xuân Bình và ctv, 2005)

c tr ng c a b nh là t n th ng túi Fabricius, làm gi m kh n ng áp ng mi n

ch c a gà, làm gia t ng nguy c nhi m b nh và gi m kh n ng áp ng mi n d ch dotiêm phòng (H Th Vi t Thu và Nguy n c Hi n, 2012) B nh tích n hình: xu thuy t c ùi, c ng c, s ng và xu t huy t túi Fabricius, xu t huy t n i ti p giáp gi a dày tuy n và d dày c (Ph m S L ng và Nguy n Thi n, 2004)

2.3.2 c m hình thái, c u trúc c a virus Gumboro

Virus Gumboro c x p vào gi ng Birnavirus h Birnaviridae, có 20 m t tr n

i ng kính 55-60nm, có d ng kh i v i nhi u góc c nh D i kính hi n vi n t

có th quan sát th y t p h p virus Gumboro gi ng nh t ong trong nguyên sinh ch t bào b nhi m, x p u c nh nhau Trong nguyên sinh ch t c a m t t bào có th

ch a vài t p h p virus nói trên Virus Gumboro c li t kê vào hàng th 18 trong h

th ng phân lo i virus gây b nh thu c h Birnaviridae cho ng i và ng v t (Lê V n

B gene IBDV (Infectious bursal disease virus) là RNA s i ôi g m 2 phân n

A và B Phân n B dài kho ng 2.800 bps mã hóa m t lo i protein duy nh t là VP1(VP – viral protein) có ho t tính RNA polymerase Phân n A dài 3.200 – 3.400 bps(tùy ch ng virus) mã hóa cho các protein: (i) VP2 quy t nh tính kháng nguyên vàtính c c a virus; (ii) VP3 là thành ph n c u t o capsid; (iii) VP4 có ho t tínhprotease trong vi c c t r i ti n protein t o nên các protein c l p và (iv) VP5 có vaitrò trong u hòa t ng h p RNA virus và trong ti n tri n gây b nh (Van den Berg,2000)

Hình 2.2 C u trúc c a virus gây b nh Gumboro

Virus Gumboro

tiêu hóa

i th c bào, lympho B(virus nhân lên c c b )

Xâm nh p h tu n hoàn l n th nh t

Túi Fabricius và các c quan khác (virus nhân lên

nh, tiêu di t t bào lympho B, và các t bào có

th m quy n mi n d ch, phá h y túi Fabricius)

Xâm nh p h tu n hoàn l n th hainhi m trùng huy t (viremia)

Phá h y, gây b nh tích các c quan (túi Fabricius,

nh quanh h u môn gà dính y phân, tiêu ch y phân nhi u n c và có màu h i

tr ng, gà bi ng n, suy nh c, lông xù, run, l và cu i cùng ch t Gà b m t n c

và thân nhi t gi m vào giai n cu i c a b nh

Di n bi n b nh r t nhanh, gà con ch t sau 1-2 ngày sau khi xu t hi n nh ng d u

hi u u tiên, n ngày th 3-4 gà b t u ch t nhanh h n k t lúc b t u có gà ch t,

Xâm nh p qua ng tiêu hóa

Gi i phóng

Theo h tu n hoàn

Xâm nh p các c quan thích ng

n ngày th 4 thì t l ch t t n nh cao và n ngày th 8-9 thì d ng l i N ukhông có nguyên nhân nào k phát thì b nh ch kéo dài 7-9 ngày (Lê H ng M n và

Ph ng Song Liên, 1999)

Sau khi virus v a m i xâm nh p vào túi Fabricius gà ã có nh ng bi u hi n nh : vùng h u môn co bóp nhanh, m nh không bình th ng, gà có ph n x mu n ingoài nh ng không th c hi n c ây là tri u ch ng giúp ta phát hi n b nhGumboro s m (Lê V n N m, 2004)

M khám ngày u m i phát b nh th y túi Fabricius s ng to và có d ch nh y

tr ng, ngày th 2 sau khi phát hi n b nh m khám th y túi Fabricius s ng , th n

nh t màu, s ng có nhi u d ch nh y bên trong n ngày th 3 thì túi Fabricius xu thuy t l m t m ho c t ng v t, ti n m xu t huy t thành v t C ùi và c ng c xu thuy t v t ho c en N u b nh kéo dài n ngày th 5, 6, 7 túi Fabricius teo nh l i,

ùi và c ng c b m tím (Nguy n Xuân Bình và ctv, 2000)

Ngoài b nh tích n hình túi Fabricius và h c , virus Gumboro còn gây b nhtích m t s c quan khác nh : lách s ng nh , ôi khi còn th y n t màu xám nh trên

m t Gan b s ng nh trên b m t và có th b ho i t rìa gan Th n b s ng n ng,trên b m t có nh ng m xu t huy t, ôi khi có ho i t phân b u kh p và các ng

giai n 48-96 gi sau khi nhi m, các t bào bi u mô b m t niêm m c túiFabricius t ng kích th c T 72-96 gi sau khi nhi m h u nh 100% các nanglympho c a túi Fabricius u có b nh tích nh trên (Lê V n Hùng, 1996).

2.3.5 Phòng b nh và u tr

2.3.5.1 Phòng b nh

V sinh phòng b nh: gi i h n ng i ra vào tr i và ph i th c hi n nghiêm ng t vsinh, sát trùng khi ra vào tr i Tiêm phòng cho àn gà gi ng t o mi n d ch th ngcho gà con Trong các tr i gà ph i tách bi t hoàn toàn gà h ng th t, gà h ng tr ng

th ng ph m, gà gi ng các l a tu i khác nhau tránh b nh Gumboro truy n ngang.Virus Gumboro có th t n t i trong chu ng gà t i 122 ngày, ây là ngu n b nh

ti m tàng và nguy hi m nh t Do ó, phòng b nh Gumboro ph i th c hi n bi npháp phòng t ng h p: t ng c ng công tác v sinh ch n nuôi thú y, gi úng nguyên

c kh trùng, tiêu c, v sinh th c n, n c u ng, h th ng ch t th i c bi t là ph i

áp d ng tri t "t t c cùng vào, t t c cùng ra" (Lê V n N m, 2004)

nh k tiêu c, v sinh chu ng tr i, x lý tr i nh k m i tháng và sau m i tnuôi b ng Chloramin 0,5% trong 10 phút N u chu ng nuôi gà tr c ó ã b b nh thì

lý m i tu n 1 l n và sau 2-3 tháng m i c b t gà m i v nuôi (Nguy n XuânBình và ctv, 2000)

Phòng b nh b ng vaccine: hi n nay các n c trên th gi i và n c ta ang s

ng 2 lo i vaccine

Vaccine vô ho t hay còn g i là vaccine ch t

Lo i vaccine này th ng dùng cho gà mái lúc gà t 18-20 tu n tu i và có th

nh c l i trong lúc

Vaccine vô ho t có b tr d u dùng cho gà tr ng thành, gà b m th ng t o

mi n d ch cho gà vào 7 ngày sau khi tiêm và l ng kháng th t cao nh t vào ngày

th 21 n ngày th 30, mi n d ch này có th truy n cho con sau khi n (Nguy n NhThanh và ctv, 1997)

Nh ng vaccine thu c nhóm này ch a virus vaccine ch ng nh : Standard, MB,

SL, BB khi s d ng s không gây t n th ng i th c ng nh vi th c u trúc túi

Fabricius, nh ng m t s l ng l n virus vaccine l i b trung hòa b i kháng th thng.

Nh ng lo i vaccine này r t an toàn và c s d ng r ng rãi, nh ng kh n ng

áp ng mi n d ch c ng nh kh n ng b o h th p Vì v y, ph i dùng nh c l i thêm

2-3 l n m i áp ng mi n d ch Lo i vaccine này ch dùng nh ng n i an toàn ch a

có b nh N u b nh ã n ra thì vaccine lo i này không có kh n ng b o h

Vaccine ch a virus v i c l c trung bình

Vaccine thu c nhóm này ch a virus vaccine ch ng nh : D78, Gumboral, C.T.,Izovac ch a ch ng 165 PV khi s d ng s không gây h i n c u trúc c a túi Faricius

nh ng l i có kh n ng v t qua s trung hòa v i kháng th th ng gà con, áp ng

mi n d ch t t và r t an toàn Vì th chúng c s d ng khá r ng rãi k c nh ng vùng

an toàn c ng nh không an toàn d ch b nh

Vaccine ch a virus v i c l c cao

Là lo i vaccine ch a virus vaccine s ng còn c l c khá cao, khi s d ng có kh

ng gây t n th ng túi Fabricius, gây m t m i t m th i cho àn gà

N u nh ng n i b nh Gumboro x y ra liên ti p và ó virus c ng c gây

nh v i t l ch t cao thì bu c ph i dùng m t trong nh ng lo i vaccine b o h sau

nh : vaccine 228E (Nobilis Gumboro 228E), TAD Gumboro vac Forte ch ng L.C-75Cevac IBD-L ch a các ch ng 2512 và G16, Medivac - Gumboro A N u nh ng c

b nh Gumboro ch a x y ra l n nào ho c m i m c nh thì không nên dùng lo ivaccine này, vì chính vaccine s gây thành b nh

Vaccine có c l c y u an toàn cho mi n d ch ng n, th ng c s d ng àn

gà con không có kháng th th ng Vaccine có c l c cao cho mi n d ch t t h n, có

kh n ng kh c ph c hi n t ng trung hòa kháng th th ng, nh ng có th làm t n

th ng túi Fabricius Vaccine có c l c trung bình th ng c s d ng nh t (Mai

Tr ng H ng H nh, 2010)

2.3.5.2 u tr

B nh Gumboro là b nh do virus gây ra, vì v y v nguyên t c thì không có thu c

u tr Nên t ng c ng s c kháng cho gà b ng vi c qu n lý ch m sóc, nuôi d ng,cung c p y ch t n gi i có th làm gi m t l ch t Trong tr ng h p b nh kphát các b nh do vi khu n c n s d ng kháng sinh u tr (H Th Vi t Thu vàNguy n c Hi n, 2012)

Hi n nay trên th tr ng Vi t Nam ã có thu c h tr u tr các b nh do virustrên gia súc và gia c m c a công ty Navetco S n ph m có tên th ng m i làNavetinterferon, thành ph n chính c a s n ph m là interferon alpha S n ph m ckhuy n cáo s d ng u tr các b nh trên gia c m nh cúm, Marek, Gumboro,…

Tuy nhiên, theo lý thuy t, ChIFN có tính c hi u loài cao, do ó vi c s d nginterferon alpha (s n ph m navetinterferon) cho c gia súc và gia c m thì hi u qu nh

th nào c n ph i c nghiên c u ánh giá

2.4 Các y u t nh h ng n kh n ng nhi m b nh Gumboro trên gà

2.4.1 Gi ng gà

Theo Lê V n N m thì gà ri Vi t Nam có s c kháng khá t t i v i b nhGumboro trong cùng m t u ki n ch n nuôi Gà Rôtri chuyên d ng c lai t o t

gà ri Vi t Nam và gà Rôt c a Hungari có s c kháng t t nh t i v i b nh Gumboro

so v i các gi ng gà khác nh : Leghorn, Plymouth - Rock, gà lai gi a Rôtri vàLeghorn, Tam Hoàng Tuy nhiên, tác gi ch a phát hi n ra s khác nhau v m n

m i v i b nh Gumboro gi a gà siêu th t và gà siêu tr ng (Lê V n N m, 2004)

2.4.2 Tu i gà

Theo các tài l u tr c ây thông báo thì gà 3-6 tu n tu i d m c b nh Gumboro,

nh ng Lê V n N m ã quan sát và th y ngoài l a tu i 3-6 tu n th lâm sàng thì b nh

ã n ra gà 8 ngày tu i và 96 ngày tu i, nói cách khác giao ng tu i gà b nh

th ng có biên l n Ngoài th lâm sàng ra, b nh ngày nay khá ph bi n th n và

gà th ng b b nh d i 3 tu n tu i

2.4.3 Gi i tính gà

Sau th i gian nghiên c u t n m 1982 n n m 1997, Lê V n N m ã k t lu n

gi a gà tr ng và gà mái không có s khác bi t nhau v m n c m i v i m m b nh,

ng nh là t l m c b nh và t l ch t b nh Gumboro (Lê V n N m, 2004)

2.5 Tình hình nghiên c u ChIFN trong và ngoài n c

2.5.1 Trong n c

Cho n nay ch a có nhi u nghiên c u trong n c v tác d ng kháng virus in

vitro c a ChIFN- i v i các virus gây b nh trên gia c m

N m 2000, Vi t Nam ph i h p v i các nhà khoa h c Ucraina ã s n xu t th

thành công IFN – t i vi n vaccine Nha Trang theo công ngh dùng phage c a E Coli

làm vect , do ó vi c chi t IFN d dàng h n (Ph m V n Ty, 2005)

N m 2003, vi n vaccine Nha Trang c ng b t u nghiên c u s n xu t thu c nh

i làm t IFN phòng ch ng b nh cúm và các b nh ng hô h p do virus gây ra(Tuy t Qu nh, 2004)

N m 2010, Nguy n Ng c n et al ã th ho t tính kháng virus in vitro arChIFN-α trên v bào t Bacillus subtilis K t qu th nghi m cho th y rChIFN- có

kh n ng kháng IBDV và NDV tùy thu c vào li u Ho t tính kháng virus th hi n s

c ch t o ho i t trên môi tr ng t bào CEF

2.5.2 Ngoài n c

N m 1976, công trình u tiên u tr viêm gan B mãn tính b ng IFN c aGreenberg và ctv Các tác gi ã dùng IFN c a t bào b ch c u do Kari Cantell Ph nLan cung c p u tr cho 4 b nh nhân viêm gan B v i k t qu kh quan (trích d nBùi i, 2002)

N m 1980, Walterr Gillbert và Charles Wiesmann nghiên c u thành công s n

xu t IFN ng i b ng con ng tái t h p trong t bào E Coli (Nguy n Khu t Thanh,

2006)

T i Hungary, ng i ta ã dùng IFN u tr các b nh nhi m virus và b nh ung

u ng i n n m 1987, Hoofnagle ã thành công trong vi c dùng IFN u trviêm gan C, m ra kh n ng ng d ng r ng rãi trong u tr các b nh nhi m virus vàung th trên ph m vi th gi i (Tuy t Qu nh, 2004)

N m 1982, Trung Qu c s n xu t IFN b ng ph ng pháp công ngh sinh h c(Ph m V n Ty, 2005)

N m 2001, Mo et al ã kh o sát tác ng in vitro và in vivo c a rChIFN- i

i IBDV và NDV Trong nghiên c u này, rChIFN- cDNA c t ng h p b ng

ph ng pháp RT-PCR, sau ó s n ph m c bi u hi n trên h th ng t bào E coli.

ki m tra tác ng kháng virus c a IFN tái t h p, hai th nghi m c ti n hành:(i) t bào CEF c v i 3 hàm l ng rChIFN- (0, 100, 300 g/gi ng) trong 15 gi

tr c khi thêm vào 33 PFU (plaque forming unit) IBDV, (ii) gi l ng c nhChIFN- (350 g/gi ng), các pha loãng IBDV theo b c 10 thêm vào sau 15 gi

t qu ghi nh n rChIFN- có tác ng ng n c n s hình thành ho i t t bào doIBDV theo ph ng th c ph thu c li u c p, s l ng ho i t gi m i khi t ng hàm

ng rChIFN-

M t nghiên c u khác trong n m 2001, Pei et al mô t ho t tính kháng virus gây

nh viêm ph qu n truy n nhi m (IBV) trong u ki n in vitro và in vivo c a

tách t t bào lách gà t nhiên và rChIFN- type I C 2 lo i interferon u ng n c n snhân lên c a IBV ch ng Beaudette trên t bào th n gà (CKC – chicken kidney cell) theo

ph ng th c ph thu c li u c p B ng cách quan sát s thành l p c a h p bào, th y r ngIFN li u 100 IU/ml ã làm gi m 50% s nhân lên c a virus

Nh ng n m sau ó, nhi u nghiên c u in vitro v rChIFN- c th c hi n.Trong ó, các k t qu cho th y ho t tính kháng virus c a rChIFN- nh ng n c n ssao chép c a virus gây b nh Marek c l c cao (vvMDV – very virulent Marek’s

disease virus) (ch ng RB-1B) (Jarosinski et al., 2001), virus cúm H9N2 (Wei et al.,

2006) trên t bào CEF

M t b c ti n m i vào n m 2008, Song et al nghiên c u t o rChIFN- bi u hi n

trong rau di p (Lactuca sativa L.) S n ph m ban u cho th y tính kh quan trong

mi ng có m n n c (VSV) trên t bào CEF Sau khi x lý v i protein chuy n gene,CEFs c gây nhi m virus v i 100 TCID50 K t qu cho th y rChIFN- có kh n ng

m ng ho t tính kháng virus c a t bào M t n m sau ó, Song et al ti p t c bi u

hi n rChIFN- trong cây thu c lá (Nicotiana tabacum), ho t tính sinh h c c a protein

thu c là 5,01.103 IU/g mô Tuy nhiên, nhóm tác gi ngh c n có nh ng nghiên

u xa h n v rChIFN- trong cây th c n ch n nuôi chuy n gene

Khi ki m tra vai trò c a ChIFN- và t bào CEF khác nhau v gene Mx631 trong

vi c kháng IBDV, O'Neill et al (2010) ã ch ng minh ChIFN- có ho t tính kháng virus m nh trong vi c làm gi m hi u giá virus, không ph thu c vào ki u gene Mx, cho th y Mx631 không ph i là y u t quy t nh kháng IBDV trên t bào CEF.

Cùng n m 2010, Kuri et al ã gây nhi m virus gây s t thung l ng Rift (RVFV –

Rift valley fever virus) trên t bào CEF và ki m tra ho t tính kháng virus này c arChIFNs, c bi u hi n và tinh s ch trên h th ng E coli Trong th nghi m, 104

bào nuôi c y ban u c qua êm 5% CO2 và 37°C, sau ó x lý tr c 7 gi v icác n ng rChIFNs khác nhau tr c khi gây nhi m virus K t qu rChIFNs c ch nhân lên c a virus theo ph ng th c ph thu c li u th nghi m t 1 n 25 IU/ml

Trong m t nghiên c u m i ây, Jiang et al (2011) ã so sánh kh n ng b o v t

bào c a rChIFN- trên t bào ph i s c p c a gà, v t và gà tây tr c khi gây nhi m v ivirus H1N1 (A/turkey/Virginia/SEP-4/2009) và virus H5N9 (A/turkey/Wisconsin/1968)

i vi c x lý tr c v i 1.000 IU/ml rChIFN- trong 18 gi , rChIFN- ã làm gi m áng

s nhân lên c a virus trong 2 lo i t bào ph i s c p c a gà và gà tây, m c gi m ít

n t bào ph i v t C th , s t ng sinh c a virus gi m x p x 200 l n trên t bào gà và

gà tây, kho ng 30 l n trên t bào v t sau 48 gi gây nhi m Các s li u này ch ng t r ngrChIFN- có th làm gi m s nhân lên c a virus và có ho t tính sinh h c trên các loài gia

m khác

Tuy nhiên, khi ánh giá ho t tính kháng virus c a rChIFN- và m i liên h v iNS1 (nonstructural protein 1 – protein c cho là ng n c n s t ng h p IFN) c a

virus, Penski et al (2011) cho r ng c rChIFN- và IFN do virus c m ng ch a th

hi n y kh n ng b o v t bào kháng l i virus cúm gây b nh cao, trong nghiên

u này là 2 subtypes H5N1 và H7N7

Bên c nh ó, nhóm nghiên c u c ng nh n m nh NS1 c a virus không óng vaitrò chính trong vi c ng n c n s t ng h p IFN su t giai n nhi m gà

B ng vi c s d ng k thu t mi n d ch hu nh quang gián ti p và RT-PCR, Hou el

al (2011) ã ánh giá tác ng kháng NDV và VSV c a rChIFN- c bi u hi n trên

th ng P pastoris K t qu cho th y các t bào CEF c x lý v i rChIFN- ítnhi m virus h n so v i i ch ng không x lý rChIFN-

H n n a, tác ng kháng virus t l v i n ng rChIFN- th nghi m, v i n ng 1.000 IU/ml cho hi u qu c ch sao chép virus cao h n 100 IU/ml, cao nh t

20.000 IU/ml, nh ng n 50.000 IU/ml rChIFN- ã th hi n tính c nh t bào cotròn, tách kh i b m t nuôi c y.

ng gà thí nghi m là 222 con (ngu n: mua t m t tr i gà gi ng t nh V nh Long).

D ch rChIFN- và rChIFN- (Trung tâm công ngh sinh h c Thành ph HChí Minh) Hàm l ng protein thô 900µg/ml

Kháng th kháng virus Gumboro, virus Gumboro (ngu n: Navetco)

D ng c và thi t b

Máy p tr ng, t c y vô trùng, máy ly tâm l nh, t s y, ng tiêm y t , ngnghi m vô trùng, g ng tay, kh u trang, giá ng ng nghi m, bông gòn, bình tr l nh,type ng huy t thanh, micropipet, ng falcon, chày c i, dao m , kéo, èn c n, apetri, d ng c c l th ch, lam, parafilm

3.3 Ph ng pháp thí nghi m

3.3.1 Ph ng pháp chu n b huy n d ch b nh ph m

M c tiêu: o c huy n d ch b nh ph m ch a virus gây b nh Gumboro s

ng cho các thí nghi m sau

Quá trình gây nhi m cho gà: nuôi 12 gà t 5 ngày tu i n 3 tu n tu i (không

ch ng ng a vaccine Gumboro) Gà c cho u ng 0,2 ml d ch virus Gumboro (ngu nNavetco) H ng ngày theo dõi bi u hi n b nh c a gà sau khi gây nhi m Khi gà xu t

hi n nh ng tri u ch ng c tr ng c a b nh Gumboro nh gi m n, tiêu ch y phân

tr ng, xù lông, rúc u vào cánh, ti n hành m và thu m u b nh ph m: túi Fabricius,lách, gan, tuy n c

Chu n b huy n d ch b nh ph m: các m u b nh ph m nh túi Fabricius, lách,

gan, tuy n c c c t nh nghi n trong c i s sau ó pha v i n c sinh lý có khángsinh penicillin (1000UI/ml) và streptomycin (1000µg/ml) v i t l 1:1, cho vào tube

nh a 10ml em ly tâm nhi t 40C, trong 15 phút v i v n t c 4.000 vòng/phút.Thu d ch n i và b c n, d ch n i ti p t c c ly tâm l n 2 nhi t 40C, trong 15phút v i v n t c 4.000 vòng/phút B o qu n huy n d ch -800C gây nhi m trênphôi

3.3.2 Chu n huy n d ch virus Gumboro

M c tiêu: xác nh hàm l ng virus gây ch t 50% phôi gà thí nghi m tính li ugây nhi m cho gà 3 tu n tu i

Chu n b phôi gà p 10 ngày tu i: ch n mua tr ng t nh ng àn gà b m kh e

nh ch a phòng vaccine Gumboro Tr ng gà mua v c sát trùng b ng c n 700,sau ó a vào máy p 370C, o tr ng hàng ngày tránh b ch t phôi Tr ng sau khi

p c 7 ngày em soi lo i nh ng tr ng không phôi và tr ng có phôi ch t Ti p

c p tr ng cho n ngày th 10, em soi và ánh d u bu ng khí và v trí tiêm (cách

xa phôi và m ch máu)

Dung d ch tiêm: pha loãng huy n d ch virus Gumboro thành nh ng n ng l chnhau 10 l n t 10-1 n 10-8

Cách tiêm: dùng kim dùi 1 l bu ng h i th t và 1 l ã c ánh d u t o

bu ng h i gi Huy n d ch virus Gumboro c tiêm vào màng nhung ni u c a tr ng

có phôi, dùng parafin hàn ch tiêm và bu ng h i th t, ti p t c p tr ng 370C Soi

tr ng hàng ngày phát hi n phôi ch t

B trí thí nghi m: phôi gà c chia ng u nhiên thành 8 nhóm, m i nhóm 5 phôi,

c tiêm v i 0,2ml huy n d ch virus Gumboro v i pha loãng theo b c 10 t 10-1

n 10-8

B ng 3.1 B trí thí nghi m xác nh ch s ELD 50 a IBDV trên phôi gà

pha loãng virus S l ng phôi c tiêm Li u tiêm (ml/phôi)

3.3.3 Xác nh c l c c a virus Gumboro trên gà 3 tu n tu i

M c tiêu: ánh giá c l c c a virus Gumboro trên gà 3 tu n tu i

B trí thí nghi m: gà 3 tu n tu i c b trí ng u nhiên thành 2 nghi m th c,nghi m th c i ch ng không tiêm truy n virus ch cho u ng 0,2ml PBS và nghi m

th c còn l i c gây nhi m v i 0,2ml d ch virus Gumboro qua ng u ng, m inghi m th c v i s gà là 30 con Theo dõi t l gà s ng, ch t ánh giá c l c c avirus Gumboro Tr c khi ti n hành thí nghi m, chúng tôi ti n hành l y huy t thanh gàthí ngh m ki m tra kháng th th ng kháng virus Gumboro b ng ph n ngELISA, nh ng gà c dùng thí nghi m ph i có k t qu âm tính

B ng 3.2 B trí thí nghi m kh o sát c l c c a virus Gumboro trên gà 3 tu n tu i Nghi m th c S gà TN Li u/con ng c p

th c phòng b nh v i li u 100µg rChIFN- + 1µg rChIFN- và 10µg rChIFN- + 1µgrChIFN- 2 nghi m th c phòng b nh gà c cho s d ng d ch rChIFN- +rChIFN- m i ngày, dùng liên t c 3 ngày, sau ó 24 gi gây nhi m v i virusGumboro Ghi nh n t l gà b nh, t l gà ch t và tr ng l ng gà các nghi m th c

ng 3.3 B trí thí nghi m ánh giá hi u qu phòng b nh Gumboro c a

rChIFN-và rChIFN- trên gà 3 tu n tu i

Nghi m th c l ng

(con) Li u/con ng c p

ngày c p (1 ngày 1 l n)

tr b nh v i li u 100µg rChIFN- và 1µg rChIFN- Sau khi gây nhi m v i virus

Gumboro 8 gi gà c u tr v i d ch rChIFN- + rChIFN- và ti p t c dùng liên

ti p 5 ngày Ghi nh n t l gà b nh, t l gà ch t và tr ng l ng gà các nghi m th c

ng 3.4 B trí thí nghi m ánh giá hi u qu u tr b nh Gumboro c a

rChIFN-và rChIFN- trên gà 3 tu n tu i

Nghi m th c l ng

(con) Li u/con ng c p

ngày c p (1 ngày 1 l n)

100µg rChIFN- + 1µg

rChIFN: interferon gà tái t h p

Trong th i gian th nghi m, gà c ch m sóc, nuôi d ng trong cùng u ki n

nh nhau Trong su t quá trình thí nghi m, theo dõi bi u hi n c a gà sau khi gâynhi m, ghi nh n s gà b nh, s gà ch t và cân tr ng l ng gà t ng thí nghi m Ti nhành m khám nh ng gà ch t, ghi nh n b nh tích và thu l y m u b nh ph m (túiFabricius, tuy n c, lách, gan) ki m tra virus Gumboro qua ph n ng AGP Nh ng

gà còn s ng thì l y huy t thanh và ki m tra kháng th kháng virus Gumboro b ng ph n

ng ELISA

3.4 Ph ng pháp xét nghi m

3.4.1 Ph ng pháp ki m tra virus Gumboro b ng ph n ng k t t a khu ch tán trên

th ch (Agar gel precipitation, AGP)

Nguyên lý: k t h p c hi u gi a kháng nguyên hòa tan và kháng th t ng

ng s hình thành ph c h p kháng nguyên kháng th Ph c h p kháng nguyên kháng th t n m t m c nh t nh thì có s bão hòa, lúc này s x y ra hi n

-ng k t t a

N u thi u 1 trong 2 thành ph n này thì s k t t a không x y ra S k t t a bi u

hi n b ng ch t c n màu tr ng xám trông r t rõ r t S k t h p này òi h i u ki nnhi t , pH thích h p và môi tr ng có ch t n gi i

Chu n b th ch

Hòa tan 1,6g agarose vào 100ml n c sinh lý 0,85%, un cho th ch tan Sau ó,

th ch lên lame m t l p dày kho ng 3mm gi lame nhi t 4 - 100C/10 phút cho

th ch ông l i

Dùng d ng c c th ch b ng kim lo i có ng kính 3mm, c m i l 7 c m,

t l gi a và 6 l xung quanh, m t lame c 2 c m

Ti n hành

L gi a m i c m cho kháng th chu n (xét nghi m ch n oán kháng nguyên),các l xung quanh b trí theo chi u kim ng h , 1 l v trí 12 gi cho kháng nguyênchu n (huy n d ch virus Gumboro) làm i ch ng d ng, 1 l cho kháng nguyên âmtính làm i ch ng âm, 4 l còn l i cho huy n d ch c n ch n oán Sau ó cho vào

m 370C t 6-24 gi , em ra c k t qu

c k t qu

N u th y gi a kháng th và huy n d ch c n ch n oán xu t hi n v ch k t t a

gi ng nh kháng th chu n và kháng nguyên chu n thì k t lu n ph n ng d ng tính

Ng c l i n u gi a kháng th và huy n d ch c n ch n oán không xu t hi n v ch k t

a thì ph n ng âm tính

Ng c l i ch n oán m u huy t thanh c a gà có kháng th kháng virusGumboro, có th làm ph n ng ng c l i b ng cách cho kháng nguyên chu n vào lchính gi a, 1 l v trí 12 gi cho kháng th chu n (kháng th kháng virus Gumboro)làm i ch ng d ng, 1 l kháng th âm tính làm i ch ng âm, các l còn l i chohuy t thanh c n ki m tra N u th y gi a kháng nguyên chu n và huy t thanh c n ch noán xu t hi n v ch k t t a màu tr ng gi ng nh gi a kháng nguyên chu n và kháng

th chu n thì k t lu n ph n ng d ng tính Ng c l i, gi a các l huy t thanh c n

ch n oán và kháng nguyên c n ch n oán không xu t hi n v ch k t t a nào thì k t

lu n ph n ng âm tính

Hình 3.1 M u th ch dùng làm ph n ng AGP

3.4.2 Ph ng pháp ki m tra kháng th kháng virus Gumboro b ng ph n ng ELISA (Enzyme linked ìmmuno sorbent assay)

Nguyên lý: thu t ELISA là ph n ng huy t thanh h c d a vào ph n ng mi n

ch h c gi a kháng nguyên và kháng th chu n Kháng nguyên ho c kháng th trong

u huy t thanh d ng tính s c g n k t v i kháng nguyên ho c kháng th ã

c g n s n trong gi ng Thành ph n không g n k t s b r a trôi, ph n gi l i ti p

c k t h p v i Conjugate (ch t k t h p) có enzyme peroxidase Ph n ng chuy n màu(t màu xanh lá cây sang màu xanh d ng) khi có s tham gia c a c ch t

i m u xét nghi m Máy c b c sóng phù h p s xác nh l ng kháng th ho ckháng nguyên b gi l i trong gi ng.

1 L y a 96 gi ng ã c ph kháng nguyên ( a kèm theo trong b kit)

2 Cho 100µl d ch i ch ng âm không pha loãng vào gi ng A1, A2

3 Cho 100µl d ch i ch ng d ng không pha loãng vào gi ng A3, A4

4 Cho 100µl d ch m u ã pha loãng vào các gi ng t ng ng v i th t m u trêna

ng 3.5 B trí thí nghi m m u huy t thanh trong xét nghi m ELISA

b c sóng 650nm khi so sánh các m u th nghi m v i giá tr trung bình c a i

ch ng d ng S t ng quan n ng kháng th trong các m u th nghi m c xác