Môi trường nuôi cấy thực vật

Nguồn nitrogenMô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như ammonium và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như acid amin.. Là yếu tố khoáng

Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực

vật

Tạ Ngọc Ly

Các thành phần chính

- Đường:sucrose và glucose, 2%

- Các muối khoáng đa lượng

- Các muối khoáng vi lượng

- Các vitamin

- Các chất sinh trưởng

Chức năng của các khoáng chính

cây, đặc biệt trong quá trình phát triển của nhân, protein, diệp lục, amino acid và các

trưởng, các mô phát triển nhanh, quan trọng trong quá trình quang hợp, hô hấp.

Potassium – cần thiết cho phân chia tế bào,

mô phân sinh, tham gia chu trình C, Protein

Calcium – tham gia biệt hóa thành tế bào, phát triển lá

và rễ Đặc biệt trong chuyển hóa đường, amino acids

hô hấp, hoạt hóa photphate và vận chuyển photphate và tinh bột

hệ thống quang tông hợp, thành phần của

aminoacids và enzimes

và hocmon tăng tưởng, hỗ trợ quang tổng hợp và

hô hấp

Molybdenum – tham gia trong enzime phân hủy nitrate và amonium Trợ giúp trong qt chuyển hợp chất photphat vô

cơ sang phot phat hữu cơ

Zinc – tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và lục lạp Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon

Boron - tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và lục lạp Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon Copper – liên quan trong quang tổng hợp và hệ thống

hô hấp Hỗ trợ tổng hợp chlorophyll và sử dụng như 1 tác nhân phân giải

Nguồn nitrogen

Mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như ammonium và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như acid amin Tỷ lệ nitrogen dạng

ammonium và nitrat thích hợp tùy theo loài cây và trạng thái phát triển của mô.

Nitrat được cung cấp dưới dạng muối nitrat Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc NH4NO3 Ammonium cung cấp dưới dạng muối (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3.Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea Tổng nồng độ của NO3- và NH4+ trong môi trường thay đổi từ 3 đến 6 mM, thông thường khoảng 20

mM

trường từ 0,5 đến 3 mM

Nguồn ferric

Những môi trường cổ điển dùng sắt dưới dạng clorua sắt FeCl2, FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O,

Fe2(SO4)3, Fe(C4H4O6) Hiện nay, hầu hết các

phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na2-Ethylen diamin tetraacetat (Na2

- EDTA) Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng dần dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật.

Các muối khoáng vi lượng

Nguồn khoáng Vai trò trong thực vật

Nitrogen Thành phần của protein, acid nucleic và một số coenzymes Là

yếu tố khoáng được yêu cầu nhiều nhất cho thực vật Potassium Điều hòa áp suất thẩm thấu, là cation vô cơ đặc trưng

Calcium Sinh tổng hợp hợp vách tế bào, chức năng của màng tế bào, tín

hiệu nội bào Magnesium Cofactor của enzyme, thành phần của chlorophyll

Phospho Thành phần của nucleic acids, chuyển hóa năng lượng, thành

phần trung gian trong hô hấp và quang hợp Sulphur Thành phần của một số amino acid (như methionine, cysteine)

và một số cofactor

Sắt Thành phần của cytochrome trong chuỗi chuyển điện tử

Đồng Cofactor của enzyme, tham gia vào chuỗi chuyển điện tử

Kẽm Cofactor của enzyme, tham gia sinh tổng hợp chlorophyll

Molybden Cofactor của enzyme, thành phần của enzyme nitrate

reductase

Chất điều hòa sinh trưởng thường sử dụng

trong nuôi cấy mô thực vật

lượng phân tử

Dung dịch Stock

Auxin

p-chlorophenoxyacetic acid pCPA 186.6 auxin hòa tan trong Tất cả các

NaOH loãng hay trong dung dịch ethanol

2,4-Dichlorophenoxyacetic

Indole-3-acetic acid IAA 175.2 Indole-3-butyric acid IBA 203.2 1-Naphthaleneacetic acid NAA 186.2 2-Napthoxyacetic acid NOA 202.2

Cytokinin

6-Benzylaminopurine BAP 225.2 Tất cả các

cytokinin hòa tan trong NaOH loãng hay trong dung dịch ethanol

N-Isopenteylaminopurine 2iP 203.3 6-Furfurylaminopurine

Các hợp chất tự nhiên

Nước dừa (Coconut endosperm)

Nhũ tương cá (Fish emulsion)

Protein thủy phân(Protein hydrolysates) Nước ép cà chua(Tomato juice)

Nước chiết nấm men(Yeast extracts)

Khoai tây (Potato agar)

Than hoạt tính

Sử dụng như tác nhân khử độc, khử nước độc từ mô nuôi cấy Nồng độ hay dùng là 0,3% hoặc thấp hơn.

Than sử dụng cho nuôi cấy mô

– Khử sạch acid và phải trung tính

– Không sử dụng lại

Vấn đề lựa chọn môi trường

Phương pháp pha chế môi trường

Thành phần môi trường MS

Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS

nồng độ đậm đặc 20 lần (x20)

Tên hoá chất Nồng độ môi trường

nuôi cấy (mg/lít)

Nồng độ dung dịch stock (x20) (mg/lít)

Pha stock khoáng vi lượng

Tên hoá chất

Nồng độ môi trường nuôi cấy (mg/lít)

Nồng độ dung dịch stock (x100)

(mg/lít)

Nồng độ dung dịch stock(x1000)

Tên hoá chất

Nồng độ môi trường nuôi cấy

(mg/lít)

Nồng độ dung dịch stock (x200) (mg/lít)

Pha stock vitamin môi trường MS nồng độ

đậm đặc 500 lần (x500)

Tên hoá chất

Nồng độ môi trường nuôi cấy

(mg/lít)

Nồng độ dung dịch stock (x500) (mg/lít)

Pha môi trường làm việc (môi trường nuôi cấy)

Pha 1 lít môi trường MS cơ bản:

- Dùng ống đong, đong 500 ml nước cất hai lần vào becher

- Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hoàn toàn

- Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều

- Bổ sung 1 ml dung dịch stock vi lượng x1000, khuấy đều

- Bổ sung 5 ml dung dịch stock Fe-EDTA x200, khuấy đều

- Bổ sung 2 ml dung dịch stock vitamin x500

- Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục đích nuôi cấy

- Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ 1000 ml

- Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về pH=5,8

- Bổ sung 6-8 g agar

- Đun sôi cho tan agar, quấy đều Chia hỗn hợp môi trường vào các bình nuôi cấy, cần chia xong trước khi dung dịch môi trường MS nguội xuống 50oC Hấp khử trùng (đối với các thành phần bị biến tính ở nhiệt độ cao sẽ được lọc vô trùng và bổ sung vào môi trường sau khi hấp) Môi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25oC

Thời gian hấp tiệt trùng (ở 121oC) môi trường

nuôi cấy mô thực vật

Thể tích môi

trường trong bình

chứa (ml)

Thời gian hấp tối thiểu (phút)

Thể tích môi trường trong bình

chứa (ml)

Thời gian hấp tối thiểu (phút)

Chọn mô cấy

và chồi nách

cấy chìm vào môi trường

trường, mặt dưới đặt trên mặt thạch

chìm phân nửa vào môi trường