HƯỚNG DẪN THỰC HIỆN THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

ISO/TS 11133-2HƯỚNG DẪN THỰC HIỆN THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT... Các chỉ số chất lượng về sự phát triển của vi sinh vật • Độ vô trùng • Chỉ số phát triển của vi sinh vật

ISO/TS 11133-2

HƯỚNG DẪN THỰC HIỆN THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI

CẤY VI SINH VẬT

Lĩnh vực áp dụng

• Các nhà sản suất môi trường thương mại

• Đơn vị sản suất môi trường cung cấp cho

bên thứ 3

• Các PTN tự tổng hợp môi trường

Các chỉ tiêu cần kiểm soát

• Thể tích, độ dày của môi trường

• Màu sắc và sự đồng nhất

• Độ bền của gel agar/gelatin

• Độ ẩm

• pH

• Khả năng đệm

• Độ vô trùng

Các chỉ số chất lượng về sự phát

triển của vi sinh vật

• Độ vô trùng

• Chỉ số phát triển của vi sinh vật

• Sự biểu hiện ổn định tính chất sinh lý/sinh

hóa của VSV

• Khả năng kháng khuẩn

Kiểm soát độ vô trùng

• Số lượng mẫu:

• ít nhất 1 ống/đĩa hay 1% ở đầu lô pha chế

• ít nhất 1 ống/đĩa hay 1% ở cuối lô pha chế

• Ủ

• ít nhất là 18h/37oC

Chỉ số phát triển của VSV

• Chỉ số phát VSV của môi trường

• Chỉ số tăng trưởng (productivity - Pr)

• Chỉ số chọn lọc (Selectivity)

• Phương pháp xác định thông qua kỹ thuật

• Định tính

• Định lượng

Chỉ số tăng trưởng Pr

• Công thức tính

– No: Tổng số khuẩn lạc đếm trên MT tham chiếu

• No ≥ 100 CFU

– Ns: Tổng số khuẩn lạc đếm trên MT thử nghiệm – Pr MT không chọn lọc ≥0,7; Pr MT chọn lọc ≥0,1

No

Ns

 Pr

Chỉ số chọn lọc S F

Sf = Do - Ds

– Do: Số khuẩn lạc phát triển trên môi trường tham chiếu

ở độ pha loãng cao nhất

– Ds: Số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thử nghiệm

ở độ pha loãng cao nhất

Phương pháp đánh giá chỉ số phát

triển của môi trường VSV

• Khi nào cần đánh giá chỉ số phát triển?

• Một lô môi trường mới

• Thay thế loại MT cũ bằng MT mới có chức năng tương

đương

• Thay đổi nhà cung cấp

• Chủng phù hợp với môi trường (dùng cho xác định chỉ số Pr)

• Chủng không phù hợp với MT cần thử nghiệm (xác định Sf)

– Sử dung ít nhất 2 chủng

Mật đô vi sinh vật cho thử nghiệm

Productivity

• Thử nghiệm chỉ số tăng trưởng - Pr

– Thử nghiệm định lượng: 102cfu/đĩa

– Thử nghiệm định tính hay bán định lượng:

• 103 – 10 4 CFU/đơn vị cấy

– Thử nghiệm định tính cho MT lỏng:

• 10 – 100 CFU/đơn vị cấy

• Thử nghiệm chỉ số chọn lọc Sf

• 10 4 – 10 6 CFU/đơn vị cấy

Phương định lượng trên đĩa

• Thích hợp cho tất cả các loại môi trường agar

Cấy vào môi trường đối chứng /

kiểm tra

Ủ ở trong cùng điều kiện Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên

MT thử nghiêm / đối chứng

Phương pháp bán định lượng

• Chọn chủng VSV với mật độ 104-106

CFU/ml

• Que cấy vòng 1ul

• Góc giữa que cấy và mặt thạch: 20 – 30O

Cách cấy bán định lượng

A

1 2 3 4

B 5 6 7 8

C 9 10 11 12

D 13

14

15

16

Sinh khối xuất hiện kín đường cây: 1 Xuất hiện khoảng nửa đường: 0,5 Xuất hiện < 1/2 đường: 0

Chỉ số phát triển

- Chủng VSV mục tiêu: Gl ≥ 6

- Không phải VSV mục tiêu: có thể bị ức chế hoàn toàn

Cách cấy định tính

• Sử dụng để kiểm tra môi trường rắn

Các chủng VSV thử nghiệm khác nhau

-Điểm 0: VSV không mọc

- Điểm 1: VSV mọc yếu

- Điểm 2: VSV phát triển tốt

-Chỉ số chấp nhận:

Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng – định lượng

– Cấy

• Trích 10ml MT thử nghiệm và đối chứng

• Với VSV mục tiêu: cấy 10-100cfu

• Với VSV không phải mục tiêu: cấy >1000cfu

• Cấy hỗn hợp: cấy 10-100cfu VSV mục tiêu và >1000cfu VSV

không phải mục tiêu

(không sử dụng môi trường đối chứng)

– Ủ ở điều kiện sử dụng của MT

– Trích mẫu cấy trãi trên môi trường agar không chọn lọc

– Đếm khuẩn lạc xuất hiện

•

Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng – định lượng

• Diễn giải kết quả

– Môi cấy riêng lẻ và so với môi trường đối

chứng

• VSV mục tiêu: Pr ≥ 0,1

– Nuôi cấy hỗn hợp: đa số phải là VSV mục tiêu – Yêu cầu trên mỗi MT

• VSV mục tiêu: mật độ đạt > 106 cfu/ml

• VSV không mục tiêu: không quá 104 cfu/ml

Phương pháp kiểm soát môi trường

nuôi cấy lỏng – bán định lượng

• Qui trình

– Cấy

• Với VSV không phải mục tiêu: cấy >1000cfu – Ủ ở điều kiện thích hợp

• VSV mục tiêu: trãi 10 µl lên MT rắng chọn lọc đặc

trưng

Phương pháp kiểm soát môi trường

nuôi cấy lỏng – bán định lượng

• Diễn giải kết quả

– Với VSV mục tiêu: xuất hiện ít nhất 10 khuẩn lạc đặc trưng trên MT rắn chọn lọc

– Với VSV không mục tiêu: không nhiều hơn 10 khuẩn lạc trên TSA

Phương pháp kiểm soát môi trường

nuôi cấy lỏng –định tính

• Cấy trực tiếp VSV vào môi trường thử

nghiệm

• Diễn giải kết quả

• Đục nhẹ: 1

• Đục: 2

Môi trường đạt yêu cầu khi đạt độ đục là: 2