Nghiên cứu tối ưu môi trường thay thế rẻ tiền nuôi Lactobacillus plantarum để phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic

Probiotic là những vi sinh vật sống có ảnh hưởng tốt đến vật chủ bằng cách giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Vi khuẩn probiotic giúp hoàn thiện hệ tiêu hóa, giảm nhiều bệnh về tiêu hóa do vi khuẩn gây ra, giúp cải thiện tình trạng không hấp thụ thức ăn…Đặc biệt vi khuẩn probiotic không gây hại cho vật chủ.Với sự phát triển của khoa học công nghệ cũng như trình độ dân trí ngày càng được nâng cao nên probiotic đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi…Sử dụng probiotic trong dược phẩm và chăn nuôi có thể hạn chế được việc sử dụng kháng sinh, giảm tác động đến sức khỏe con người. Trong số các vi sinh vật được dùng để sản xuất probiotic thì các vi khuẩn lactic được sử dụng phổ biến như : Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus…Để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus thì chế phẩm MRS vẫn được coi là môi trường chuẩn. Tuy nhiên chế phẩm MRS rất đắt tiền làm cho sản phẩm vi khuẩn tạo thành có giá thành cao và khó được áp dụng rộng rãi. Với mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để thay thế cho môi trường MRS trong sản xuất sinh khối Lactobacillus plantarum chúng tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu tối ưu môi trường thay thế rẻ tiền nuôi Lactobacillus plantarum để phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic”.

LỜI MỞ ĐẦU

Probiotic là những vi sinh vật sống có ảnh hưởng tốt đến vật chủ bằngcách giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột Vi khuẩn probiotic giúp hoànthiện hệ tiêu hóa, giảm nhiều bệnh về tiêu hóa do vi khuẩn gây ra, giúp cải thiệntình trạng không hấp thụ thức ăn…Đặc biệt vi khuẩn probiotic không gây hạicho vật chủ

Với sự phát triển của khoa học công nghệ cũng như trình độ dân trí ngàycàng được nâng cao nên probiotic đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnhvực như thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi…Sử dụng probiotic trong dượcphẩm và chăn nuôi có thể hạn chế được việc sử dụng kháng sinh, giảm tác độngđến sức khỏe con người

Trong số các vi sinh vật được dùng để sản xuất probiotic thì các vi khuẩn

lactic được sử dụng phổ biến như : Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus…Để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus thì chế phẩm MRS vẫn được coi là môi trường chuẩn Tuy nhiên

chế phẩm MRS rất đắt tiền làm cho sản phẩm vi khuẩn tạo thành có giá thànhcao và khó được áp dụng rộng rãi Với mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu

rẻ tiền để thay thế cho môi trường MRS trong sản xuất sinh khối Lactobacillus

plantarum chúng tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu tối ưu môi trường thay thế rẻ tiền nuôi Lactobacillus plantarum để phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic”.

Khoa học giải thích cho ảnh hưởng có lợi của các vi khuẩn lactic có trong

sữa lên men được cung cấp lần đầu tiên vào năm 1907 bởi nhà sinh lý họcngười Nga, Eli Metchnikoff Metchnikoff đưa ra giả thuyết rằng cuộc sốngkhỏe mạnh và lâu dài của nông dân Bungari là do sự tiêu thụ các sản phẩm sữalên men Ông cho rằng các vi sinh vật trong sản phẩm sữa lên men có ảnhhưởng tốt đến hệ vi sinh vật kết, giảm hoạt động của vi khuẩn độc, nhờ đó kéodài tuổi thọ

Một điều thú vị là một vài năm trước bài thảo luận của Metchnikoff,

Henry Tissier đã phân lập ra Bifidobacteria từ phân của trẻ được nuôi bằng

sữa mẹ và nhận thấy chúng là một thành phần nổi bật của hệ vi sinh vật ruột.Như vậy tương tự như Metchnikoff, Tissier tin vào sự ảnh hưởng của

Bifidobacteria đến sức khỏe của những đứa trẻ được nuôi từ sữa mẹ và những

đứa trẻ được nuôi bằng sữa hộp

Mặc cho sự diễn ra chiến tranh Thế giới thứ nhất và sự ra đi củaMetchnikoff làm giảm sự quan tâm tới liệu pháp diệt khuẩn của ông, nhưngnền tảng cho khái niệm hiện đại về probiotic rõ ràng đã được thành lập Cáckiến thức có được thông qua những nghiên cứu đã thúc đẩy mạnh mẽ ngànhcông nghiệp các sản phẩm sữa Từ các quan sát từ sớm của Metchnikoff và

tục cho đến tận hiện tại Điều này hiển nhiên được thấy rõ qua thực tế ngày

hôm nay của thị trường thực phẩm sữa-probiotic khổng lồ đang tồn tại.[6] 1.2 Định nghĩa probiotic

Theo định nghĩa của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), probiotic là những visinh vật còn sống Khi được đưa vào cơ thể một lượng vừa đủ, chúng sẽ có lợicho sức khỏe Đường ruột có nhiều loại vi khuẩn tốt, xấu tạo thành một hệ

sinh thái đông đúc Những probiotic này có nhiệm vụ chiến đấu, ngăn chặn sự

xâm lấn của vi khuẩn có hại giúp cơ thể không bị mắc bệnh Do đó, dù không

phải là một chất bổ nhưng nó thật sự rất quan trọng [7]

1.3 Cơ chế tác động của probiotic

 Tác động kháng khuẩn của probiotic

Sở dĩ các vi khuẩn probiotic có khả năng kháng khuẩn là do trong quá trìnhtrao đổi chất đã tạo ra các sản phẩm có tính kháng khuẩn như axit hữu cơ (axitlactic và axit acetic), hydroperoxide, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, CO2,reuterin, bacteriocin Các sản phẩm trao đổi chất này chính là “vũ khí” kháng

khuẩn của probiotic [8]

- Khả năng kháng khuẩn của các acid hữu cơ

Các acid hữu cơ được sinh ra bởi vi khuẩn lactic chủ yếu là acid lactic vàacid acetic, các acid này góp phần làm giảm pH tiêu diệt các vi khuẩn có hại

như E.coli, Clostridium perfringens, Staphilococcus aurius Do nội bào vi

khuẩn có pH=7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trường acid bên ngoài,

H+ từ môi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bào giảm Vikhuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+ ra khỏi tế bào làm cho vikhuẩn mất năng lượng Mặt khác pH giảm thì ức chế quá trình đường phân làmcho tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lượng dẫn đến bị tiêu diệt Ngoài ra, cácanion của acid còn gây rối loạn sự thẩm thấu của màng tế bào Những nguyên

nhân này làm cho vi khuẩn bị chết [8]

- Khả năng kháng khuẩn của probiotic nhờ tiết ra độc tố bacteriocin

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được ribosome tổnghợp từ các chuỗi peptide hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+).Bacteriocin có tác dụng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây thối rữa và các

mầm bệnh phổ biến do vi khuẩn Listeria monocytogenes và Staphylococcus

aureus

Cơ chế tác động của bacteriocin rất đa dạng, nó có thể làm biến đổi các

enzyme, ức chế sự sản sinh bào tử, chúng xâm nhập vào tế bào làm mất lực đẩy

proton, làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào,

do đó tạo ra các lỗ thủng không thể khắc phục được dẫn đến tế bào bị phá vỡ

- Các lợi khuẩn probiotic còn có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng và vị trí

bám dính để ngăn chặn sự xâm nhập của hại khuẩn vào đường ruột Ngoài ra,

probiotic còn có tác động kháng độc tố của hại khuẩn [8]

Tác động trên mô biểu bì ruột

- Đẩy mạnh sự liên kết chặt chẽ giữa những tế bào biểu mô

- Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả của phản ứng viêm do sự

lây nhiễm vi khuẩn

- Đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy [9]

Tác động lên hệ miễn dịch

Probiotic được xem như là phương tiện phân

phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột Cụ

thể:

- Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để

làm giảm đáp ứng viêm

- Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng

- Cải thiện hệ vi sinh vật

đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón [9]

Tác động đến vi khuẩn đường ruột

Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn

đường ruột Khả năng sống sót của probiotic

được tiêu hóa ở những bộ phận khác nhau của hệ

tiêu hóa thì khác nhau giữa các giống Khi tập

trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng Hình 1.2 Tác dụng của probiotic

lên vi khuẩn đường ruột Hình 1.1 Tác động của probiotic lên

hệ miễn dịch

cho sự tiêu thụ thức ăn Tuy nhiên, các lợi khuẩn này chỉ lưu trú tạm thời ở đây,

và khi thức ăn đã được tiêu thụ thì số lượng vi khuẩn probiotic sẽ giảm xuống

Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đườngruột Chúng có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa, do đó sẽ gây cản trở chohoạt động tiết ra enzyme của vi sinh vật đường ruột Đồng thời tăng sự dungnạp đường lactose, giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thunhững loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vikhuẩn gây hại

1.4 Chức năng của probiotic

 Thủy phân lactose, tăng sự hấp thụ lactose

Suốt quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh enzyme thủy phân lactose thànhglucose và galactose

Các vi khuẩn đường ruột giúp chuyển hóa hầu hết lượng lactose không được

hấp thụ ở ruột non [9]

 Làm giảm một số bệnh đường tiêu hóa:

- Bệnh ung loét

Bệnh ung loét trong hệ thống tiêu hóa (do vi khuẩn Helicobacter pylori gây

ra) có liên quan đến chế độ ăn uống hàng ngày do ít sử dụng các sản phẩm sữalên men và rau quả, sử dụng quá nhiều sữa, thịt, tinh bột

Vi khuẩn lactic có thể ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh vàlàm giảm hoạt tính của enzyme urease cần thiết cho các vi sinh vật gây bệnh

lưu trú trong môi trường acid của dạ dày [9]

Bệnh tiêu chảy do vi sinh vật

Kích thích hệ thống miễn dịch sản xuất IgA đặc hiệu chống lại sự nhiễm visinh vật gây bệnh

Ngăn chặn sự bám dính và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh đường

ruột như Samonella, E.coli, Shingela [9]

Tác dụng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh

- Sinh các acid acetic, acid lactic, và các acid hữu cơ khác, làm giảm pHmôi trường gây ảnh hưởng bất lợi đối với một số vi sinh vật nhạy cảm với tínhacid

- Sinh các chất kháng sinh tự nhiên (Bacteriocin): Bacteriocin là cácpeptide, polypeptide, protein hoặc là những chất ít mang cấu trúc gen củaprotein và được cấu tạo từ các amino acid, cũng có thể bao gồm các amino acidhiếm như lanthionine hay beta-methyllanthionine

- Tranh giành nơi cư trú, tranh giành chất dinh dưỡng, ngăn chặn sự bámdính và phát triển của các vi sinh vật gây bênh

- Tạo ra những cản trở không gian ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh

vật gây bệnh [9]

Chống dị ứng thức ăn

Một phương pháp phòng chống dị ứng thức ăn là điều chỉnh hệ vi sinh vậtđặc biệt là hệ vi sinh vật đường ruột, vì đây là nguồn vi sinh vật chính kíchthích hệ thống miễn dịch

Qua các nghiên cứu, người ta thấy rằng ở những người ít bị dị ứng có số

lượng vi khuẩn Lactobacilli nhiều hơn và Clostridia ít hơn so với ở những

người thường bị dị ứng [9]

Tổng hợp một số vitamin

Các vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh nhiều vitamin khác nhau Việchấp thu các vitamin trong đường ruột khá kém, do đó việc các vi khuẩn có khảnăng sinh vitamin rất quan trọng Các vi khuẩn này sinh tất cả các loại vitamin

B (folic acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) và vitamin K

Theo các nghiên cứu, L.Brevis có khả năng tổng hợp vitamin D và vitaminK; B.longum tổng hợp vitamin B; B.bifidum và L.acidophillus tổng hợp được

các vitamin B như niacin, folic acid, biotin, B6 và vitamin K [9]

Giảm cholesterol

Vi khuẩn đường ruột chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu hơn

Theo các nhà nghiên cứu, các vi khuẩn probiotic khống chế làm chocholesterol khó hấp thu được vào máu thông qua các cơ chế chủ yếu sau:

- Hấp thụ một lượng cholesterol có mặt trong hệ thống ruột

- Tăng chuyển hóa cholesterol thành chất khác và giảm sự hấp thu của chấtnày vào cơ thể

- Giảm sự hấp thu cholesterol của ruột và tăng sự bài tiết của phân

- Giới hạn sự biến đổi cholesterol thành acid mật cho gan dự trữ

- Nếu hàm lượng chất béo cao trong các bữa ăn, gây ra sự tăng cholesterol,việc sử dụng bổ sung các vi khuẩn có lợi này là một phương pháp giúp cân

bằng mức lipid và chất béo, giữ hệ thống tim mạch mạnh khỏe [9]

Ngăn chặn ung thư

- Kết hợp, ngăn chặn hoặc làm mất hoạt tính của các yếu tố gây ung thư

- Giảm hoạt tính của các enzyme ở phân, là nơi khơi nguồn của các mầmmống gây ung thư

- Kích thích hệ thống miễn dịch, ngăn chặn sự tạo thành khối u

- Các vi khuẩn có lợi có thể giảm các enzyme liên quan đến các tác nhângây ung thư (β-gulucoronidase, azoreductase, nitroreductase và β-glucosidase)

và do đó làm giảm nguy cơ gây ung thư ruột kết [9] 1.5 Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm Probiotic

 Về mặt sản xuất:

- Có thể phát triển nhanh chóng với số lượng lớn trong điều kiện lên men

đơn giản và rẻ tiền

- Có thể tồn tại trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí

- Có thể sống sót qua quá trình ly tâm, lọc, đông lạnh hoặc sấy lạnh màkhông bị giảm số lượng đáng kể

- Có khả năng hoạt hóa nhanh sau khi được sử dụng

- Có thể sống sót dưới những điều kiên biến đổi khác nhau trong chế biếnthực phẩm bao gồm các quá trình nhiệt độ cao trên 450C, cũng như chịu đựng

được nồng độ ethanol và sodium chloride cao [9]

 Khả năng sống sót trong ruột

- Khả năng chịu được các dịch tiêu hóa

Acid dạ dày và muối mật ảnh hưởng mạnh đến sự sống sót của vi sinh vật.Các chủng có khả năng phát triển và thực hiện quá trình trao đổi chất dưới sự cómặt của lượng mật sinh lý (lượng mật bình thường trong cơ thể người) thì cókhả năng sống sót tốt hơn trong suốt quá trình ở trong đường ruột

- Khả năng cư trú trong ruột:

Những chỗ cư trú gần các mô bào và màng nhầy trong hệ thống ruột khágiàu dinh dưỡng, đối với một số vi sinh vật gây bệnh đường ruột thì khả năngbám dính được xem là điều kiện tiên quyết đối với việc xâm chiếm và lâynhiễm

Khi các vi khuẩn có lợi có khả năng bám chặt vào các tế bào bên trongđường ruột, chúng sẽ có khả năng cạnh tranh và góp phần tiêu diệt vi sinh vật

có hại [9]

Đặc tính riêng

- Có khả năng sử dụng prebiotic (oligosaccharides, inulin, tinh bột) để pháttriển

- Khả năng tổng hợp hay sử dụng vitamine (Nhóm B, folate, vitamin K)

- Có khả năng ngăn chặn các mầm bệnh: Samonenella typhimurium, Clostridium pefringens, Escherichia coli…

- Có khả năng tổng hợp acid, hydrogen peroxide, các bacteriocin

- Probiotic là những thực phẩm chức năng y tế, nâng cao chất

therapeutically sử dụng để ngăn ngừa tiêu chảy, cải thiện khả năng sử dụnglactose và kháng khuẩn Chúng cũng có tiềm năng để ngăn ngừa bệnh ung thư

và giảm cholesterol Lactobacillus, Bifidobacterium và một số vi khuẩn có lợi

khác được đưa vào cơ thể và tạo ra hiệu quả bằng cách thay đổi thành phần của

hệ vi sinh vật đường ruột Chế phẩm sinh học probiotic có khả năng chốngnhiễm trùng do vi khuẩn và vius, chống ung thư, kích thích hoạt động của hệ

miễn dịch, làm giảm cholesterol… [10]

- Ứng dụng của probiotic trong điều trị các chứng bệnh dạ dày, viêm ruột kết (gọi chung là IBS): nguyên nhân của bệnh này là do hiện tượng không dung

nạp thức ăn, gây lên men và tạo ra các chất độc nhưng không có đủ các enzyme

để phân hủy hết các chất độc này và ảnh hưởng đến sức khỏe

Theo điều tra nghiên cứu thì sự ổn định của hệ vi sinh vật đường ruột phụthuộc vào nhiều yếu tố như : acid dạ dày, nhu động ruột, muối mật, pH trongmôi trường ruột và sự cạnh tranh dinh dưỡng của giữa lợi khuẩn và hại khuẩn.Thuốc kháng sinh có thể chữa được các bệnh do vi khuẩn gây ra Nhưng người

ta đã chứng minh rằng kháng sinh làm ảnh hưởng đến sự cân bằng hệ vi sinhvật đường ruột bằng cách ức chế quá trình trao đổi chất của cả lợi khuẩn và hạikhuẩn

Qua phân tích, các nhà khoa học đã kết luận rằng có sự thay đổi đáng kểtổng số vi sinh vật trong ruột của những người bị chứng bệnh IBS Trong đó,

lượng Lactobacillus và Bifidobacteria giảm rất nhiều so với người khỏe mạnh, thay vào đó là sự thống trị của các hại khuẩn như E.coli, Streptococus, Clostridium và hiện tượng đầy hơi cũng là hiện tượng phổ biến thường gặp ở

những người bị bệnh này

Khi sử dụng thuốc kháng sinh một thời gian sau sẽ xảy ra hiện tượng khángthuốc, gây vô hiệu hóa tác dụng của thuốc Nghiên cứu sử dụng chế phẩmprobiotic cho những người mắc chứng không dung nạp thức ăn này thì sau haituần bệnh thuyên giảm rõ rệt và không có sự thay đổi các thông số sinh hóacũng như huyết học trong suốt quá trình nghiên cứu

Khi thử nghiệm sử dụng chế phẩm men vi sinh với L.plantarum chiếm thành

phần chủ yếu cho các bệnh nhân IBS thì triệu chứng đầy hơi chỉ giảm được50% trong tổng số bệnh nhân Do đó, phải kết hợp sử dụng nhiều chủng vi sinh

vật probiotic thì mới giải quyết triệt để bệnh này [11]

 Trong thực phẩm

Sử dụng vi khuẩn để muối chua rau quả, ủ chua thức ăn gia súc, làm chinsinh học các loại quả: tạo được sinh khối vi khuẩn có ích, át cả vi sinh vật gâythối Gây chua, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm Chuyển rau quả về dạng

“chín sinh học” do đó mà hiệu suất tiêu hóa tăng Một số chủng dùng để sản

xuất sữa chua đặc như: Lactobacillus bulgaricus, Strepticoccus faecalist…Một

số chủng được thêm vào sữa bột: Lactobacillus, Bifidobacterium…Tại những

nước phát triển, đã có nhiều ứng dụng bổ sung probiotic vào nhiều loại thực

phẩm như sữa chua ăn, phomat, kem, sản xuất nước ép trái cây probiotic …[12]

 Trong mỹ phẩm

Xu hướng probiotic đang ngày càng thịnh Dòng thực phẩm probiotic sẽngày càng phong phú Trong các cuộc nghiên cứu gần đây, các nhà vi sinh vậthọc của mỹ phẩm Biotherm còn phát hiện tinh chất PTP là một thành phần tựnhiên có tác động mạnh lên tế bào da, chúng kích thích và điều chỉnh tế bào da

tương tự như các probiotic đã thực hiện trên tế bào ruột.[13]

Trong nuôi trồng thủy sản

Trong nuôi trồng thủy sản, probiotic còn là chế phẩm xử lý môi trường.Thay cho mục đích chủ yếu là kích thích sự gia tăng của các vi sinh vật có lợitrong ao nuôi

Một thành phần khác cũng được thấy trong chế phẩm probiotic đó là tậphợp các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như : amylase, protease, lipase , một

số vitamin thiết yếu hoặc acid amine và chất khoáng…nhằm kích thích hoạttính ban đầu của vi sinh vật trong chế phẩm và xúc tác cho sự hoạt động củaenzyme trong môi trường Hiện nay, việc sử dụng chế phẩm sinh học là giảipháp ưu việt nhất để có được năng suất, chất lượng, sự bền vững của thủy sản

nuôi [14]

 Trong bảo vệ môi trường

Do có tác dụng tiêu diệt các vi sinh vật gây thối (sinh ra các loại khí như

H2S, SO2,NH3…) nên khi phun chế phẩm probiotic vào rác thải, cống rãnh,

chuồng trại chăn nuôi…sẽ khử mùi hôi một cách nhanh chóng Đồng thời số

lượng ruồi, muỗi, ve,các loại côn trùng khác sẽ giảm số lượng đáng kể [15] 1.7 Tình hình nghiên cứu các sản phẩm probiotic:

1.7.1 Những nghiên cứu ở nước ngoài

Trên thế giới đã có khá nhiều các nghiên cứu về việc sử dụng probiotictrong nhiều lĩnh vực như nuôi trồng thủy sản, thực phẩm như:

- Maeda và Nagami (1989) đã trình bày phương pháp kiểm soát sinh họctrong nuôi thủy sản Đến 1992 hai ông và Liao đã công bố về hiệu quả của

giống vi khuẩn tách từ bùn trong bể nuôi ấu trùng tôm sú P.monodon [21]

- Griffith (1995) thông báo nhờ việc đưa probiotic vào nuôi tôm giống ởEcuador trong năm 1992 mà các trại nuôi tôm giống giảm được thời gian nghỉ

để làm vệ sinh ở các bể nuôi từ 7 ngày trong 1 tháng đến 21 ngày trong 1 năm,

sản lượng tôm giống tăng 35% và giảm các chất diệt khuẩn đến 94%.[21]

- Ở châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi

tôm, đặc biệt ở Thái Lan [21]

- Năm 2004, Kyung Young Yoon và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu để xácđịnh sự phù hợp của nước ép cà chua cho sản xuất đồ uống probiotic nước ép cà

chua bởi các vi khuẩn lacic [22]

- Năm 2005, Kyung Young Yoon và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất nước

bắp cải probiotic từ 3 loại vi khuẩn lactic (L.plantarum, L.casei, L.delbruekii D7) và kết luận cả 3 vi khuẩn này có khả năng phát triển tốt trong môi trường

lên men nước bắp cải mà không cần bổ sung thêm chất dinh dưỡng [22]

- Năm 2006, NILAY DEMIR và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ

vi khuẩn L.plantarum đến đặc tính của nước cà rốt lên men [22]

- Năm 2009, Lavinia BURULEANU cùng cộng sự đã nghiên cứu ảnh

hưởng của probiotic đến acid lactic của nước quả lên men [22]

- Giáo sư Minoru Shirota đã nghiên cứu và phát triển chủng L.casei Shirota,

để từ đó ứng dụng đưa vào sản phẩm sữa chua uống lên men Yakult [23]

- Năm 2010, Z.E.Mousavi cùng các đồng sự đã nghiên cứu lên men nước ép

lựu từ vi khuẩn L.plantarum, L.casei, L.acidophilus Kết quả cho thấy các

chủng trên đều thich hợp sản xuất probiotic nước ép lựu

Như vậy, chúng ta thấy việc sử dụng các chủng vi sinh vật probiotic trongnhiều lĩnh vực đã và đang được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới

1.7.2 Những nghiên cứu trong nước

Các sản phẩm probiotic đã bắt đầu được người tiêu dùng biết đến trong thờigian gần đây, tuy nhiên các sản phẩm này còn rất mới mẻ và nhất là các sảnphẩm sử dụng trong thực phẩm còn chưa được nghiên cứu nhiều, chủ yếu mớiđược nghiên cứu trong chăn nuôi như:

Trần Quốc Việt của bộ môn dinh dưỡng và thức ăn chăn nuôi – Viện chănnuôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung probiotic vào khẩu phần đếnkhả năng tiêu hóa thức ăn, tốc độ sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và tỷ lệ

mắc bệnh tiêu chảy ở lợn con và lợn thịt [24]

Viện công nghệ sinh học – Công nghệ dược phẩm của Đại Học Bách Khoa

Hà Nội đã nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sử dụng phối hợp prebiotic và

probiotic trong thực phẩm chức năng”.[24]

Hiện nay trên thị trường đã có nhiều sản phẩm probiotic do Việt Nam sảnxuất như: sữa chua bổ sung probiotic, men vi sinh, chế phẩm chăn nuôi bổ sungprobiotic…

1.8 Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic

Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu

thuộc Lactobacillus và Bifidobacterum, ngoài ra Enterococcus và Streptococus

cũng được sử dụng ít hơn Những vi khuẩn này thường cư trú trong ruột [9]

Lactobacillus Bifidobacterium khuẩn lactic

us inulinus Streptococus thermophilus

Bacillus cereus Escherichia coli Propionibacteriu

m freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces boulardii

Bảng 1.1.Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người [9]

1.8.1.Chủng Bifidobacterium

Bifidobacterium có chủ yếu trong ruột kết của người và động vật, nhất là ở

trẻ mới sinh được nuôi bẳng sữa mẹ Số lượng của chúng trong ruột kết khá ổnđịnh cho đến khi về già thì số lượng giảm đi

Một số đặc tính chung của các loài thuộc Bifidobacterium:

- Gram (+), kỵ khí, không chuyển động, không sinh bào tử

- Có nhiều hình dạng: que cong ngắn, hình gậy, hình chữ Y

- Sinh acid lacic, không tạo CO2 trừ quá trình phân giải gluconate

1.8 2 Các chủng vi khuẩn Lactic

 Đặc điểm chung

- Về mặt hình thái, vi khuẩn lactic có dạng lưỡng cầu, tứ cầu, lien cầu vàdạng que, đứng đơn lẻ hoặc tạo thành chuỗi.

- Khả năng sinh tổng hợp của các vi khuẩn lactic thuộc dạng yếu

- Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Để sinhtrưởng bình thường, ngoài nguồn carbon, chúng còn cần nito dưới dạng các acidamine, một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng

 Vai trò của các chủng vi khuẩn lactic:

- Sinh ra các acid lactic, tạo ra nhiều chất chống vi khuẩn khác nhau nhưacid hữu cơ, diacetyl, hydrogen peroxide và các bacteriocin nên ngăn cản được

sự hiện diện và phát triển của các vi khuẩn gây bệnh

- Phòng ngừa và ngăn chặn rối loạn tiêu hóa, giúp cân bằng hệ vi khuẩnđường ruột, khôi phục lại cân bằng vi khuẩn tự nhiên trong cơ thể

- Chuyển lactose thành acid lactic, hạn chế dị ứng do cơ thể không dung nạpđược lactose

- Một số vi khuẩn lactic có khả năng bảo vệ chống sự phân hủy và đột biến

DNA in vitro và in vivo [9] 1.9 Tổng quan về Lactobacillus plantarum

1.9.1 Đặc điểm chung của Lactobacillus plantarum

- Có cấu trúc hình que, bộ gen lớn nhất trong số các vi khuẩn lactic

- Là một loài vi khuẩn không gây bệnh, Gram

(+), không có khả năng di động, không sinh bào

tử, khuẩn lạc tròn và trơn, màu trắng sữa, thường

có trong nước bọt và đường tiêu hóa của người

- Có hoạt tính probiotic, có khả năng sinh

acid lactic và thường được sử dụng trong quá

trình lên men thực phẩm

- L plantarum là loài vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, có nghĩa là nó có thể sinh

trưởng và phát triển trong cả điều kiện có oxi và trong điều kiện không có oxi

- L.plantarum có thể sống trong điều kiện môi trường có nhiệt độ từ 30°C

đến 40°C và khoảng pH khá rộng từ 6,2 - 7 Tuy nhiên nó cũng có thể tồn tại ở

Hình 1.3 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum

pH thấp của dạ dày và tá tràng ( pH khoảng 2-3), chống lại những tác động củacác acid dịch mật trong ruột non khi ăn uống, và có thể lưu trú trong đường tiêuhóa bằng cách gắn vào niêm mạc ruột và đại tràng Vì vậy có thể sử dụng nó để

điều trị bệnh viêm ruột kết, đầy hơi, khó tiêu [16]

- Tính chất đặc trưng duy nhất của L plantarum là khả năng dị hóa arginine

và sinh ra NO L plantarum không có khả năng phân giải amino acid nào ngoại

trừ tyrosine và arginine Có đến 6 con đường chuyển hóa arginine khác nhau vàđều sinh ra NO Việc sinh ra NO giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như

Candida abicans, E.coli, Shigella, Helicobacter pylory, các amip và kí sinh

trùng

1.9.2.Vai trò của L.plantarum

- Bằng cách ngăn chặn sự bám dính của E.coli vào màng nhầy, L.plantarum làm giảm độc tố do E.coli tiết ra

- Lactobacillus plantarum làm giảm đáng kể vi sinh vật kị khí Gram (-), Enterobacteriaceae, Clostridia

- Nghiên cứu gần đây cho thấy L.plantarum có khả năng phân hủy acid mật

làm giảm cholesterol.[16]

1.9.3 Các hoạt tính của Lactobacillus plantarum

 Hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum

- Từ xa xưa con người đã biết ứng dụng lên men lactic để muối chua rau, củ,quả Quá trình lên men lactic chủ yếu là nhờ sự hoạt động của vi khuẩn sinhacid lactic Người ta đã phân lập các sản phẩm như nem chua, xúc xích, rau, củ,quả muối chua điển hình là dưa chuột muối chua sau đó nuôi trên môi trường là

chế phẩm MRS và đã cho kết quả có sự hiện diện của vi khuẩn Lactobacillus plantarum

Đối với quá trình lên men chua thì các nguyên liệu tươi sống rất khó khửtrùng Trong nghiên cứu này người ta đã chứng minh được rằng, chính vì có sựcạnh tranh dinh dưỡng giữa vi khuẩn lactic với các hệ vi sinh vật tạp nhiễm Do

đó Lactobacillus plantarum có khả năng tạo ra bacteriocin để ngăn chặn sự cạnh tranh của các vi khuẩn tự nhiên Bacteriocin do L.plantarum sản xuất có

khả năng ức chế sự sinh trưởng, sinh sản và quá trình trao đổi chất của các vikhuẩn khác loài cũng như nấm men Sử dụng bacteriocin kết hợp với điều khiểncác yếu tố khác trong lên men sẽ cho chất lượng lên men tốt hơn.Ngoài ra,

L.plantarum còn có khả năng sinh acid làm giảm pH môi trường để ức chế các

vi khuẩn khác [17]

- Trong một nghiên cứu khác, người ta đã chứng minh được L.plantarum có

thể sinh trưởng và phát triển trên môi trường dinh dưỡng MRS, đồng thời có

khả năng ức chế sự phát triển của hại khuẩn Samonella Sau 2h thử nghiệm hoạt tính này, người ta nhận thấy L.plantarum làm số lượng tế bào Samonella giảm

rất nhiều [18]

- Ngoài ra, L.plantarum còn có khả năng diệt các vi khuẩn gây nhiễm trùng

ở đầu họng của bệnh nhân viêm phổi phải đặt ống nội khí quản [19]

 Khả năng kháng dịch mật của L.plantarum

Nghiên cứu này được thực hiện tại trung tâm CRDC năm 2007 Trongnghiên cứu này người ta sử dụng mật lợn thay thế cho dịch mật người Khả

năng chống chịu muối mật của L.plantarum được đánh giá bằng cách bổ sung các nồng độ khác nhau của mật vào môi trường chế phẩm MRS L.plantarum

được nuôi ở 370C trong 48h Kiểm chứng với môi trường chế phẩm MRS khôngchứa dịch mật Vi khuẩn sống sót được theo dõi bằng cách đo OD ở bước sóng600nm

Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ mật lợn từ 0,1% đến 1% thì

L.plantarum vẫn sinh trưởng và phát triển được nhưng ở nồng độ cao thì vi

khuẩn bị ức chế [20]

 Khả năng chịu acid của L.plantarum

Khả năng chịu acid của L.plantarum được kiểm tra bằng cách ủ vi khuẩn

trong môi trường chế phẩm MRS ở các giá trị pH từ 2 đến 6, điều chỉnh pHbằng HCl Sau đó, nuôi vi khuẩn ở 370C trong 48h Lượng vi khuẩn sống sót

được đánh giá bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 600nm kết hợp đếmkhuẩn lạc.

Kết quả cho thấy, L.plantarum có thể sống sót trong môi trường có pH từ

2-3 nhưng đạt lượng sinh khối lớn nhất ở môi trường có pH 6,5

Như vậy, L.plantarum đã được chứng minh là hội tụ đầy đủ ba hoạt tính

quan trọng của một vi sinh vật được dùng làm probiotic đó là: khả năng khángkhuẩn, khả năng kháng dịch mật và khả năng chịu acid Do đó, có thể kết luận

L.plantarum có hoạt tính probiotic [20]

1.9.4 Ứng dụng của L.plantarum

- Nó quan trọng trong việc bảo vệ các chất chống vi sinh vật và chống lạimột cách hiệu quả các vi sinh vật gây bệnh nội bào và ngoại bào

- L.plantarum có khả năng giúp tiêu hóa các chất xơ có trong củ hành, tỏi,

lúa mì, trứng, lúa mạch đen và trong men bia Do đó chúng giúp đỡ những vấn

đề về tiêu hóa như đầy hơi, khó tiêu…

- Ngoài ra, L plantarum còn có khả năng giảm nhất định một số triệu chứng

phụ trong quá trình điều trị bằng thuốc kháng sinh [9]

- Gần đây L plantarum đã được dùng để gắn kháng nguyên mảnh C của độc

tố uốn ván (đã làm mất độc tính) dùng làm vaccine chống uốn ván

PHẦN 2:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 Quy trình thực hiện đề tài

2.2 Đối tượng nghiên cứu, dụng cụ và thiết bị

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Hoạt hóa giống vi khuẩn bằng môi trường

MRS trên đĩa petri

Cấy chuyển vi khuẩn từ đĩa Petri sang môi

Nuôi cấy giống trên môi trường tối ưu và so

sánh với môi trường MRS

Trong đề tài này em sử dụng chủng Lactobacillus plantarum được nuôi cấy

và bảo quản tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc khoa Hóa, trườngĐại học Bách khoa Đà Nẵng

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

2.2.2.1 Dụng cụ

Trong quá trình thí nghiệm thường dùng các dụng cụ như: cốc đong, ốngđong, micropipette, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, que cấytrang, que cấy ria, đầu côn, effpendoft

2.2.2.2.Thiết bị

Một số thiết bị thường dùng như:

- Nồi hấp tiệt trùng Autoclave - Tủ cấy vô trùng

- Cân phân tích và cân kỹ thuật - Máy lắc nước

- Lò vi sóng

Các thiết bị chính được trình bày ở phần phụ lục 1

2.2.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường dinh dưỡng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độngsống và hoạt tính của vi sinh vật Vì vậy, để đảm bảo những yêu cầu tối thiểucho sự sinh trưởng cũng như hoạt tính của vi sinh vật thì trong thành phần môitrường cần có các nguyên tố như carbon, nito, hidro, oxy, các chất vô cơ như

canxi, phospho, lưu huỳnh, sắt và các nguyên tố vi lượng [1]

- Môi trường nhân giống cấp 1: là môi trường MRS (do Deman và cộng sự

tìm ra năm 1960) dạng chế phẩm có thành phần như sau: [28]

Pepton từ Casein 10g/l Cao thịt bò 10g/l

Diamon citrate 2g/l MgSO4.7 H2O 0,2g/l

- Môi trường thử nghiệm dùng để nhân sinh khối: gồm 3 môi trường như

trong bảng 2.1 dưới đây

Bảng 2.1 Thành phần của 3 môi trường thử nghiệm [2]

Môi trường 1:(1000ml) Môi trường 2:(1000ml) Môi trường 3:(1000ml)

Đường kính 20g/l Đường kính 20g/l Nước dừa 10%

K 2 HPO 4 1g/l K 2 HPO 4 1g/l Cao nấm men 10g/l

MgSO 4 0,5g/l MgSO 4 0,5g/l

Cao nấm men 5g/l

Do môi trường dinh dưỡng dùng để nuôi cấy vi sinh vật có chứa hàm lượngchất dinh dưỡng cao, thích hợp cho nhiều loài vi sinh vật sinh trưởng và pháttriển Vì vậy để đảm bảo cho môi trường nuôi cấy chỉ chứa loài vi sinh vậtmong muốn thì sau khi chuẩn bị môi trường cần phải thanh trùng và làm nguộitrước khi cấy giống

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp hoạt hóa Lactobacillus plantarum

2.3.1.1 Hoạt hóa vi khuẩn L.plantarum

Do giống vi khuẩn được pha trộn với glycerol và bảo quản lạnh đông, vì vậy

có hoạt tính rất yếu Vì thế để đạt được hoạt tính tốt vốn có của giống thì cầnphải tiến hành hoạt hóa giống theo các bước sau đây:

+ Pha loãng giống về nồng độ 10-7 bằng nước muối sinh lý vô trùng hoặcnước cất vô trùng

+ Hút 100µl giống pha loãng nhỏ vào đĩa petri đã chứa môi trường MRS vôtrùng (thành phần được nêu ở mục 2.2.3)

+ Dùng que cấy trang để cấy trải đều giống lên đĩa

+ Sau đó nuôi ở 300C trong 48 giờ, quan sát hình thái và đánh giá xem giống

gốc có thuần khiết không [2]

2.3.1.2 Cấy chuyển giống vi khuẩn từ đĩa petri sang môi trường lỏng trong bình tam giác

Để đồng nhất lượng giống khi cấy vào các môi trường thì giống được nuôitrên đĩa petri không phù hợp Do đó, phải tiến hành cấy chuyển vi khuẩn từ đĩa

petri sang dạng lỏng trong bình tam giác [2]

Dùng que cấy lấy khoảng hai khuẩn lạc to, rõ nhất ở đĩa petri vừa hoạt hóarồi khuấy vào bình tam giác chứa 100ml môi trường MRS vô trùng Sau đónuôi cấy ở 300C trong 48h

2.3.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào

2.3.2.1.Phương pháp trải đĩa đếm khuẩn lạc

Phương pháp đếm khuẩn lạc là phương pháp cho phép xác định số lượng visinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Tế bào sống là tế bào có khả năng phânchia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Trong phương pháp này cầnthực hiện pha loãng thập phân sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thíchhợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn đểhạn chế sai số khi đếm và tính toán Các thao tác được thực hiện trong điều kiện

vô trùng [3]

2.3.2.2 Phương pháp đo mật độ quang

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa theo định luật Lambert-Beer, độlớn của tín hiệu hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích, các chất khácnhau sẽ hấp thụ tốt ở các bước sóng khác nhau

Để có kết quả chính xác, cần phải chuẩn bị mẫu trắng cho từng mẫu Mẫutrắng có thành phần môi trường giống với mẫu thật, nhưng không cấy giống vi

khuẩn Mỗi mẫu phải tiến hành đo 3 lần rồi lấy kết quả trung bình [4]

2.3.2.3.Phương pháp chọn lọc môi trường thích hợp nhất trong 3 môi trường thử nghiệm

Cho đến nay, môi trường MRS vẫn được xem là môi trường chuẩn để nuôi

cấy vi khuẩn lactic, trong đó có Lactobacillus Tuy nhiên, do chứa các thành

phần đắt tiền nên hiện nay giá thành của chế phẩm MRS vẫn rất cao Vì thếmục tiêu của đề tài là tìm ra môi trường có thể thay thế MRS để nuôi cấy

Lactobacillus.

Để tìm ra môi trường thay thế, cần trải qua các bước sau:

Bước 1: Cấy đồng nhất một lượng giống vào các môi trường thử nghiệm

Để đánh giá chính xác hiệu quả tạo sinh khối L.plantarum của các môi

trường thì nhất thiết phải cấy cùng một lượng giống vào các môi trường và sau

đó nuôi cùng một điều kiện Hay nói cách khác, giữa các môi trường thửnghiệm thì các yếu tố về giống và điều kiện nuôi cấy đều giống nhau, chỉ khác

về thành phần môi trường Các thí nghiệm này được bố trí song song

Phương pháp tiến hành:

- Chuẩn bị 3 bình tam giác chứa 3 môi trường thử nghiệm như đã nói ở mục2.2.3 với thể tích mỗi môi trường là 100ml, điều chỉnh pH của cả 3 môi trường

về 6,5

- Thanh trùng môi trường bằng nồi hấp áp lực cao Autoclave

- Chuẩn bị giống Lactobacillus plantarum ở dạng lỏng trong bình tam giác

- Dùng micropipet với đầu côn vô trùng hút 1ml (tỷ lệ giống là 1%) giốngphân phối vào mỗi bình tam giác

- Sau khi cấy giống, đem các bình tam giác đi nuôi cấy lắc ở 300C, 200vòng/phút

Bước 2: Xác định mật độ tế bào trong từng môi trường

- Để xác định mật độ tế bào trong các môi trường, sử dụng phương pháp đomật độ quang Nguyên tắc của phương pháp này là dựa theo định luật Lambert-Beer, các môi trường nghiên cứu có nồng độ sinh khối vi khuẩn khác nhau sẽcho giá trị OD khác nhau ở cùng bước sóng 600nm

Dựa vào kết quả OD thu nhận được ở các thời điểm khác nhau của cùng mộtloài vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng có thể xây dựng được đường congsinh trưởng Từ đó biết được mức độ sinh trưởng và phát triển của vi sinh vậttrong các môi trường thử nghiệm, đồng thời có thể khảo sát sự ảnh hưởng của

yếu tố thời gian đến sự sinh trưởng và phát triển của L.plantarum

Bước 3: Xây dựng đường cong sinh trưởng của L.plantarum trong từng môi trường

- Để xây dựng đường cong sinh trưởng của L.plantarum trong từng môi

trường, tiến hành lấy mẫu và đo OD tại các mốc thời gian nuôi cấy khác nhau,các mốc thời gian cách nhau 12 tiếng đồng hồ

Bước 4: So sánh kết quả và chọn ra môi trường tốt nhất trong 3 môi trường trên

- Sau khi đã xây dựng được đường cong sinh trưởng của L.plantarum trong

3 môi trường thử nghiệm, so sánh mức độ sinh trưởng của nó trong từng môitrường để tìm ra môi trường tốt nhất trong 3 môi trường thử nghiệm

2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

Sau khi chọn ra môi trường dinh dưỡng tốt nhất trong 3 môi trường thửnghiệm, tiến hành tối ưu hóa môi trường bằng phương pháp “Quy hoạch thựcnghiệm” và tìm điều kiện tối ưu bằng cách sử dụng phần mềm Excel Solve.Với

mục đích là thu sinh khối vi khuẩn L.plantarum, do đó hàm mục tiêu là sinh

khối vi khuẩn, các biến là các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành sinh khối vikhuẩn

Muốn tối ưu hóa môi trường bằng quy hoạch thực nghiệm thì phải tiến hành

từ quy hoạch trực giao cấp 1 Nếu phương trình hồi quy tương thích với thực

nghiệm thì dừng lại, còn không thì phải làm tiếp các cấp quy hoạch tiếp theo[5]

PHẦN 3:

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Với mục đích của đề tài là tìm ra môi trường tối ưu nuôi cấy vi khuẩn

L.plantarum để thay thế môi trường MRS và quy trình thực hiện đã nêu ở phần

2, kết quả thu được như sau:

3.1.Kết quả hoạt hóa chủng L.plantarum

Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum được bảo quản ở phòng thí nghiệm

Công nghệ sinh học thuộc trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng bằng phươngpháp lạnh đông ở -200C Sau quá trình hoạt hóa trên môi trường MRS trên đĩapetri ở 300C, thời gian nuôi cấy là 48h Kết quả hoạt hóa được trình bày ở hình3.1

Hình 3.1 Kết quả hoạt hóa L.plantarum từ effpendoft sang

môi trường dinh dưỡng MRS với độ pha loãng 10 -7

Kết quả quan sát ban đầu cho thấy chủng khảo sát vẫn giữ được một số đặc tính

cơ bản của chủng L.plantarum như:

- Về màu sắc: khuẩn lạc màu trắng sữa

- Về đặc tính mép khuẩn lạc: trơn nhẵn, bờ tròn đều, không có răng cưa

- Về đặc tính bề mặt: bề mặt lồi, trơn nhẵn, không nhăn

- Không sinh bào tử

3.2 Quan sát hình thái vi khuẩn L.plantarum dưới kính hiển vi

Làm tiêu bản để quan sát L.plantarum, vi khuẩn được nhuộm màu với xanh

metylen

Dưới kính hiển vi, có thể quan sát được hình thái vi khuẩn L.plantarum có

dạng hình que, không di động

3.3.Kết quả cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường lỏng

Nhận xét: Do L.plantarum là loài vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, có thể sống trong

điều kiện có hoặc không có oxi Nên trong quá trình nuôi cấy lắc vừa được cungcấp oxi và tác động lắc của thiết bị, vi khuẩn phân bố đều trong môi trường Sau48h nuôi cấy lắc, giống được bảo quản ở tủ lạnh 40C lúc này vừa thiếu oxi vừakhông có lực lắc nên sinh khối vi khuẩn lắng xuống đáy bình

3.4 Kết quả khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus

plantarum trên các môi trường thử nghiệm

Hình 3.3 Cấy chuyển L.plantarum từ môi trường MRS trên

đĩa thạch sang môi trường MRS lỏng

Để khảo sát và so sánh mức độ sinh trưởng và phát triển của L.plantarum

trên 3 môi trường thử nghiệm, ta xây dựng dựng đường cong sinh trưởng của vikhuẩn trên từng môi trường Cứ 12h tiến hành lấy mẫu và đo OD một lần, tiếnhành đo OD ở bước sóng 600nm và mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần rồi lấy kếtquả trung bình Kết quả đo OD trung bình của từng thời điểm lấy mẫu đượcthống kê ở bảng 2.1 ở phụ luc 2 và hình 3.4

Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng của L.plantarum trên 3 môi trường thử

nghiệm

Dựa vào kết quả của đồ thị đường cong sinh trưởng của L.plantarum ở hình

3.4 ta thấy :

- Lượng giống ban đầu cấy vào 3 môi trường tương đối đồng đều, sinh khối

vi khuẩn tăng và giảm khá rõ theo từng giai đoạn

- Trong cả 3 môi trường thì ở thời điểm 36h lượng sinh khối đạt được là tối

đa Do đó thời gian nuôi cấy tối ưu cho L.plantarum là 36h

- Nhìn chung thì đường cong sinh trưởng của L.plantarum trên cả 3 môi

trường có phân rõ các giai đoạn sinh trưởng và phát triển như sau:

+ Giai đoạn tiền phát: là giai đoạn từ khi bắt đầu cấy giống (thời điểm 0h)cho đến thời điểm 12h sau khi cấy giống Thời gian này vi khuẩn đang tập thíchnghi với môi trường nên sinh khối chỉ tăng nhẹ

+ Giai đoạn tăng sinh (pha logarit): đây là giai đoạn vi khuẩn sinh trưởng vàphát triển mạnh nhất, lượng sinh khối tăng vượt bậc và đạt lượng lớn nhất ở 36h+ Giai đoạn cân bằng và suy vong: đây là giai đoạn mà sinh khối vi khuẩnkhông những không tăng mà còn giảm nhẹ Sau ngưỡng cao nhất ở thời điểm36h, sinh khối vi khuẩn giảm dần Tuy nhiên, đối với môi trường 2 thì saungưỡng 36h,sinh khối không tăng, không giảm tức là lượng tế bào sinh ra bằngvới lượng tế bào chết đi.

Tuy nhiên để có kết quả chính xác độ chênh lệch về sự sinh trưởng và pháttriển của vi khuẩn giữa các môi trường, em kết hợp phương pháp đo OD vàphương pháp đỗ đĩa đếm khuẩn lạc Tiến hành đếm khuẩn lạc tại các thời điểm12h và 36h Các bước tiến hành như sau: đầu tiên cấy giống vào các môitrường, nuôi cấy lắc ở 300C, 200vòng/phút, đến thời điểm đo OD và đếm khuẩnlạc thì thực hiện đổ đĩa đếm khuẩn lạc trước rồi hút mẫu đi đo OD, phần còn lạicủa dịch nuôi cấy tiếp tục nuôi cấy lắc ở 300C, 200vòng/phút

- Đỗ đĩa đếm khuẩn lạc tại thời điểm 12h: sau khi nuôi cấy lắc 12h, dùngmicropipet hút 100µl, pha loãng 10-3 rồi dùng que cấy trải trang đều dịch lênkhắp mặt đĩa petri chứa môi trường MRS, sau đó nuôi trong tủ ấm 300C trong48h Phần còn lại của dịch nuôi cấy đem đi nuôi cấy lắc tiếp Kết quả số khuẩnlạc của các môi trường như sau:

Nhìn vào hình 3.5 ta thấy, sau 12h nuôi cấy thì lượng khuẩn lạc trên môitrường 3 nhiều hơn so với hai môi trường còn lại Kết quả đếm khuẩn lạc nhưsau:

Môi trường 1 : 245 khuẩn lạc, mật độ thưa thớt nhất nhưng khuẩn lạc to, rõnhất

Môi trường 2 : 264 khuẩn lạc, kích thước lớn môi trường 3 nhưng nhỏ hơnmôi trường 1

Môi trường 3 : 283 khuẩn lạc, mật độ dày hơn một chút, nhưng kích thướcnhỏ hơn hai môi trường còn lại

Tại thời điểm sau 12h nuôi cấy, lúc này là giai đoạn cuối pha tiền phát,chuẩn bị bước vào pha logarit, lượng sinh khối tạo ra chưa nhiều nên mật độ tếbào vi khuẩn trong 3 môi trường chênh lệch nhau không nhiều Do lượng môitrường MRS đổ vào các đĩa là khá đồng đều nên đĩa nào khuẩn lạc có mật độthưa thớt hơn thì kích thước lớn hơn và ngược lại, đĩa nào khuẩn lạc mọc dàyhơn thì kích thước lại nhỏ hơn

MT3

Hình 3.5 Kết quả trải đĩa đếm khuẩn lạc của 3 môi trường thử

nghiệm tại thời điểm 12h sau khi cấy giống (độ pha loãng 10 -3 )