Sử dụng các dữ liệu động học từ các thí nghiệm nuôi cấy theo mẻ batch-Culture và nuôi cấy liên tục continuous-culture, một quá trình nuôi cấy theo mẻ có bổ sung dinh dưỡng fed-batch-bổ
Trang 1TÓM TẮT:
Một quá trình lên men được phát triển và tối ưu hóa cho việc sản xuất Protease từ
Bacillus licheniformis PWD-1 Các công thức môi trường đã được xây dựng và các
thông số môi trường quan trọng đã được tối ưu hóa để tạo sự phát triển và hình thành sản phẩm Quy trình động lực tiêu thụ cơ chất, sinh khối, sản phẩm cũng như sự hình thành sản phẩm phụ đã được xác định dưới những điều kiện kiểm soát của một nồi phản ứng
sinh học (bioreactor) Sử dụng các dữ liệu động học từ các thí nghiệm nuôi cấy theo mẻ (batch-Culture) và nuôi cấy liên tục (continuous-culture), một quá trình nuôi cấy theo
mẻ có bổ sung dinh dưỡng (fed-batch-bổ sung cơ chất nền) đã được phát triển để sản xuất Proteolytic (Potease-enzym Proteolytic) có hoạt lực gấp 10 lần so với quá trình nuôi
cấy gián đoạn bình thường.Trong một giai đoạn của nuôi cấy liên tục, sự hình thành Protease được tách ra hoàn toàn Từ các thí nghiệm nuôi cấy liên tục một giai đoạn dẫn đến sự phát triển của quá trình lên men nuôi cấy liên tục 2 giai đoạn trong thùng khuấy bằng cách sử dụng điều kiện tối ưu cho sự phát triển ở giai đoạn đầu và sự hình thành Protease ở giai đoạn thứ hai Theo đó, cơ sở của sự sản xuất liên tục của enzyme trên quy
mô thí nghiệm đã được hoàn thành
Trang 2GIỚI THIỆU
Trong số các enzyme công nghiệp, protease chiếm phần lớn doanh số bán hàng trên toàn thế giới, chiếm 1,3 tỷ US $ vào năm 1998 (Godfrey T 2001 ET Consulting, thay mặt cho Biocatalysts Ltd http://www.biocatalysts.com), với nhu cầu ngày càng tăng đối với các ứng dụng trong ngành da, mỹ phẩm, tẩy rửa, pha chế và thực phẩm Chỉ có một nhóm nhỏ các enzyme proteolytic có khả năng thủy phân keratin-scleroprotein
(Scleroproteins hoặc protein dạng sợi ) không hòa tan của động vật có xương sống, tìm thấy trong lông vũ, tóc hoặc móng Vi khuẩn, actinomycetes (xạ khuẩn có khả năng tiết protease), và nấm men có khả năng sản xuất các enzyme proteolytic chuyên biệt có tên keratinase Keratinase đã được sử dụng thành công để xử lý và tinh chế sợi len (Cegarra
và cộng sự., 1992) để cải biến lông và các vật liệu khác như nguồn thức ăn chăn nuôi (Onifade et al., 1998 ; Pal et al., 1996; Raju et al., 1996) cũng như một thành phần hoạt chất trong các loại kem (Greff D 1996 Các chế phẩm thẩm mỹ có chứa một chất chống oxy hoá là Ceramide và protease Frande Demande FR 2729079 A1 trang 12) và dầu gội đầu (Tanaka M, Tomizawa N 1986 Dầu gội đầu có chứa enzyme keratindrapering JP
62164611 A2 21 Jul 1987 Showa 4 trang)
Để đạt được những enzyme có giá trị này với số lượng đủ cần phải vận hành một
hệ thống sản xuất với năng suất thể tích cao Để có thể đạt được nồng độ sản phẩm cao và năng suất tốt trong môi trường nuôi cấy tối ưu Tuy nhiên, năng suất tổng thể của quá trình như vậy vẫn còn giảm đáng kể do thời gian bổ sung cần thiết để làm sạch, khử trùng, và cuối cùng là đạt được các điều kiện tối ưu để hình thành sản phẩm Trongnuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất này, các thành phần môi trường tối ưu cho sự tăng trưởng
và hình thành sản phẩm được bổ sung bằng một cơ chế nhập liệu (fedding subtract) và
được điều chỉnh các thông số hoạt động theo từng giai đoạn của quá trình lên men Theo cách tương tự, cần phải phân biệt các giai đoạn tăng trưởng và hình thành sản phẩm bằng cách áp dụng các hệ thống bể khuấy liên tục hai giai đoạn và điều chỉnh thành phần và điều kiện môi trường tối ưu trong giai đoạn tương ứng
Trang 3Trong nghiên cứu này, một quy trình lên men liên tục được phát triển và tối ưu hóa để sản xuất một keratinase cụ thể từ Bacillus licheniformis PWD-1 Loại enzyme này
đã được sử dụng thành công trong sự biến đổi sinh học của lông vũ gia cầm thành thức ăn giàu đạm (Shih JCH 1991) Phương pháp làm giảm việc sử dụng các vi khuẩn có ích trong phân giải vật liệu keratinaceous trước đó Do đó, mục đích của nghiên cứu này là
cách thức để chứng minh và là chiến lược cho một sự phát triển nhanh chóng và tối
ưu hóa quá trình lên men để cung cấp đầy đủ các enzym tương tự.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chuẩn bị vi sinh vật và môi trường nuôi cấy
Bacillus licheniformis PWD-1 thu được từ American Type Culture Collection
(Bộ sưu tập các chủng vi sinh vật chuẩn của Mỹ-ATCC 53757)) Stock Culture (Môi
trường gốc-Chỉ số môi trường của một vi sinh vật được duy trì với điều kiện tối ưu) được duy trì dưới dạng spore suspensions (dạng bào tử tồn tại dạng huyền phù) ở 70 0C trong 15% Glyxerol Trước khi tiến hành thí nghiệm lên men thì môi trường agar đã được chuẩn bị để cấy bào tử vi khuẩn trên đĩa thạch Luria Broth vô trùng để thu nhận các khuẩn lạc sau 16 giờ ủ ở 50 ° C( Mục đích là nhân nhanh số lượng giống vi sinh vật) Các môi trường agar này được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C hoặc được sử dụng ngay
lập tức để cấy Preculture- giống vi sinh vật thuần khiết ( môi trường có chưa duy nhất
1 vsv)
Một môi trường tăng trưởng phức tạp đã được tối ưu hóa đã được sử dụng cho
Maillard (phản ứng giữa đường và aa các hợp phần tham gia phản ứng là P hoặc các
sản phẩm phân giải của chúng với glucid), dd A chứa: 14.52 peptone từ casein (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), 2.41 (NH4 ) 2SO4, 3,49 KH2PO4, và 3,25 Na2HPO4 ×
2H20 được phân vô trùng riêng khỏi dung dịch B: chứa 10 glucoza, 0,67 sắt citrat, 4,52 MgSO4 × 7H 2 O, 0,11 MnSO 4 x H2O và 26,9 dung dịch nguyên tố vi lượng
Trang 4www.dsmz.de/media/med027.htm) Cả hai dung dịch đều được hấp chín trong 30 phút
ở 121 ° C, làm nguội và trộn lại trong các bình lắc dưới dòng chảy tầng Môi trường được đưa vào buồng lên men sử dụng kỹ thuật kết nối vô trùng
Đối với một số môi trường nuôi cấy gián đoạn với cơ chất glucose, peptone từ casein và sunfat amoni được áp dụng ở các tỷ lệ nồng độ khác nhau để xác định tác động lên sự hình thành protease Ngoài ra, môi trường được cô đặc lên đến bốn lần để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự hình thành protease Đối với các thí nghiệm nuôi liên tục, môi trường này được pha loãng đầy đủ để tránh giới hạn oxy Đối với nuôi cấy fed-batch, dung dịch chiết suất glucose vô trùng (300 g / L-1) được chuẩn bị trong nồi hấp thể tích 5 l ở 121° C trong 60 phút
Pre-culture: môi trường được chuẩn bị trước để cho vào nuôi cấy chính
150ml dung môi vô trùng được đổ vào bình tam giác có nút đậy (1000mL) và được tiêm chủng với một khuẩn riêng (muỗng vòng) của Bacillus licheniformis PWD-1
từ đĩa thạch Luria Broth Các mẫu nuôi cấy này được ủ trong 6,5 giờ ở 50 ° C và được lắc quay 120 vòng / phút bằng máy lắc quay vòng (GFL 3033, ném 2,7 cm) Các tế bào được lắng cặn ở tốc độ 5000 vòng / phút trong 10 phút tại RT (Sorvall SS34 rotor) và được cho vào trong 30 mL dung dịch NaCl vô trùng (0.9%) Một thể tích phù hợp cho huyền phù tế bào này được sử dụng để cấy vào các môi trường chính
Nuôi cấy theo mẻ
Các bình lắc (300 mL, chứa 50 mL môi trường) được tiêm với tế bào tươi đem đi
đo mật độ quang học OD đạt 0.1 (600 nm so với nước) và ủ ở 50 ° C trong 20 giờ trên máy lắc quay ở 120 vòng / phút (ném 2,7 cm) Đối với các thí nghiệm lên men được kiểm soát, quá trình nuôi cấy theo mẻ được thực hiện trong một MBR-Mini Bioreactor (thể tích làm việc 1,8 lít), và trong Giovanolla Bioreactors (thể tích làm việc 15 lít) Các môi trường được duy trì ở pH 6,2 ± 0,1 bằng cách thêm NaOH (15%) hoặc H3PO4 (15%) Nhiệt độ được duy trì ở 50 ° C ± 0,2 đối với tất cả các quá trình lên men theo mẻ nngoại trừ các thí nghiệm thay đổi nhiệt độ Sự thông khí được đặt ở mức 0,5 vvm và tốc độ
Trang 5khuấy được điều chỉnh từ 400 đến 900 vòng / phút để duy trì nồng độ oxy không hạn chế trong môi trường (> 10% giá trị bão hòa) Oxy tinh khiết đã được sử dụng khi cần thiết
trong quá trình tăng trưởng ở pha log Để làm giảm bọt polypropylene glycol (PPG 2000)
đã được thêm vào ở pha log Các chỉ số của pH, nhiệt độ, tốc độ khuấy, và nồng độ oxy được kiểm soát và ghi lại trong suốt quá trình lên men
Fed-Batch Cultures –nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất
Fed-Batch được nuôi cấy trong một Giovanolla Bioreactor (thể tích bắt đầu 15 L) Môi trường tăng trưởng phức tạp tối ưu được áp dụng với nồng độ glucose bắt đầu là
12,5 g / L-1.Nồi lên men được tiêm đến mật độ quang phổ là 0,1 Sự thông khí được điều chỉnh đến 0,5 vvm và tốc độ của máy khuấy dao động từ 400 đến 1000 vòng / phút để giữ
oxy trên mức hạn chế Nhiệt độ được điều chỉnh đến 50 ° C ± 0,2 và chuyển sang 40 °
C sau pha log của sự nuôi cấy Độ pH được duy trì ở mức 6,2 ± 0,1 bằng NaOH 15% và H3PO4 15% cho mỗi lần nhập liệu Sự tạo bọt được kiểm soát bằng cách bổ sung
polypropylen glycol khi cần thiết Các mẫu để đo các biến đổi quá trình có liên quan đã được thực hiện ở những khoảng thời gian đều đặn theo các quy trình động lực
Continuous Cultures-Nuôi cấy liên tục
Nuôi cấy liên tục được tiến hành trong một hệ thống với thể tích không đổi để đạt được trạng thái ổn định Pha cân bằng được xác định bằng sự biến đổi của mẫu vẫn không thay đổi trong của 3 lần kiểm tra mẫu, cách nhau vài giờ Đối với tỷ lệ pha loãng dưới 0,6 h-1, sự hình thành protease và / hoặc sporulation là các tham số thay đổi chậm nhất Trên giá trị này các tế bào đã được phát triển và đã không phát hiện có sự hình thành protease Nồng độ các chất chuyển hóa liên tục và nồng độ sinh khối tăng liên tục sau đó được dùng để xác định sự cân bằng
Các thí nghiệm đã được thực hiện trong một Infors HT Labfors Fermentor System Thiết lập thử nghiệm cho các thí nghiệm nuôi cấy liên tục hai giai đoạn được thể hiện trong Hình 1 Tương tự, việc thiết lập môi trường nuôi cấy liên tục một giai đoạn đã đạt được Trong nuôi cấy liên tục một giai đoạn thể tích làm việc là không đổi ở 300 mL Tốc
Trang 6độ dòng chảy qua bể đã được điều chỉnh để đạt được tỷ lệ pha loãng yêu cầu PH được điều chỉnh tới 6,2 ± 0,1 sử dụng NaOH 15% cho tỷ lệ pha loãng trên 0,7 h-1 Các môi trường nuôi cấy được duy trì ở 50,0 ± 0,2 ° C, được khuấy từ 600 đến 1000 vòng / phút
và được đun bằng khí nén ở 0,5 vvm để giữ nồng độ oxy ở mức không hạn chế Việc tạo bọt được điều khiển bằng việc bổ sung polypropylen glycol khi cần Trong suốt hai lần nuôi cấy, giai đoạn đầu tiên vận hành ở 300 mL với tốc độ pha loãng 0,7 h-1 Khối lượng làm việc của bể giai đoạn 2 được điều chỉnh từ 0 đến 6000 mL để có được thời gian cư trú trung bình bắt buộc để tạo ra sản phẩm
Hình 1 Sơ đồ thiết lập thí nghiệm các thí nghiệm nuôi cấy liên tục hai giai đoạn Các thùng chứa để bổ sung chất dinh dưỡng và xả cũng như máy lên men giai đoạn đầu đặt trên cân bằng Dữ liệu trọng lượng được đưa vào hệ thống máy tính và máy bơm định lượng được điều chỉnh theo hệ thống máy tính
Phương pháp phân tích
Mật độ quang phổ của môi trường lên men được đo ở 600 nm (OD600) và ở 25 °
C đối với nước bằng một Quang phổ kế V và tương quan với sinh khối tế bào khô Trong pha tăng trưởng log, một đơn vị hấp thụ bằng với khối lượng khô 0,48 g / l-1 tế bào Vào
Trang 7giai đoạn đầu của các tế bào tĩnh, tế bào trở nên ngắn hơn và nhỏ gọn hơn và một đơn vị hấp thụ bằng với khối lượng khô 0,72 g / L-1 tế bào Để xác định khối lượng tế bào khô, một lượng mẫu lên men phù hợp được lọc bằng chân không qua một màng lọc 0.22 m (Millipore) Bánh lọc được rửa sạch bằng dung dịch NaCl 0,9% và sấy khô ở độ cân bằng sấy (Sartorius) với khối lượng không đổi Nồng độ bào tử được xác định bằng cách đo mật độ quang học và đếm các bào tử dưới kính hiển vi trong buồng Thoma
Để nhanh chóng ước lượng nồng độ glucose trong quy trình fed-batch, các dải thử nghiệm (Diabur-Test 5000, BoehringerMannheim) đã được sử dụng.Glucose và các hợp chất acid hữu cơ trong môi trường lên men đã được phân tích thông qua HPLC (hệ thống HPLC của Merck-Hitachi LaChrom A Biorad Aminex HPX-87H Cột và cột Biorad Cation K + được sử dụng với dung dịch acid sulfuric 0.005 mol / L-1 ở tốc độ dòng chảy không đổi 0,6 ml / phút-1 ở nhiệt độ hoạt động 60 ° C với 20 L L Khối lượng mẫu Đối với việc xác định glucose chỉ sử dụng tín hiệu RI detector (máy dò VR-7490 RI), trong khi các tín hiệu RI và UV (máy dò UV L-7400 UV ở 210 nm) được sử dụng để tính nồng
độ axit hữu cơ
Hoạt tính proteolytic được xác định bằng cách sử dụng một biến đổi của bài kiểm tra mô tả bởi Tomarelli (Tomarelli và cộng sự, 1949) Phép thử được dựa trên quá trình tiêu hoá proteolytic của azo-casein màu và azo-keratin Sự tương quan của hoạt động proteolytic bằng cách sử dụng azo-casein và azo-keratin làm chất nền là tuyến tính trong suốt quá trình lên men, cho thấy rằng enzym tiết ra chỉ là keratinase Su-pernatant (phần nổi của dịch lên men) của môi trường lên men đã được pha loãng với dung dịch phosphat (pH 7,5, 55 mM) Năm mươi microliters của mẫu pha loãng được trộn với dung dịch azocasein 100 o L (20g / L-1 trong dung dịch đệm phosphate pH 7.5,5 mM) trong một Eppendorf và ủ ở 60 ° C trong 15 phút trong bồn nước Các axit azopeptide mới xuất hiện
và axit azoamino được tách ra bằng cách kết tủa chất nền chưa tiêu hóa với 400? L axit trichloroacetic (5%) Sau khi ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 13000 rpm, 200 L L trên bề mặt được kết hợp với 200 ?L NaOH (1 M) trong cuvette nhựa nhỏ (đường 1 cm) Giải pháp màu kết quả được photometrically đọc tại 430 nm đối với một mẫu tham khảo chứa
Trang 810 LL của một chất ức chế protease serine cụ thể (giải pháp bão hòa của PMSF phenyl-metyl-sulfonyl "trong isopropanol ở nhiệt độ phòng) Theo cách này, một "đơn vị tùy ý" (U *) của hoạt động proteolytic được xác định là sự gia tăng của một đơn vị hấp thụ ở tốc
độ 430 nm / phút, nhân với khối lượng cuvette ở microliters ở nhiệt độ 60 ° C và pH 7,5 0.55 mol / l phosphate đệm, xem xét tất cả các pha loãng
KẾT QUẢ
Batch Culture
Bacillus licheniformis PWD-1 tăng trưởng theo cấp số nhân trong 2,5 giờ đầu tiên nuôi cấy (Hình 2),không tìm thấy pha tiềm phát (pha lag) Sản lượng sinh khối đang phát triển trên glucose Yxgr, được xác định là 0,48 g / g-1 (tổng nồng độ sinh khối Xtot được phân tách thành một sinh khối đang phát triển Xgr và sinh khối bào tử Xsp) Tốc độ tăng trưởng cụ thể tối đa được xác định là 1,47 h-1, tương ứng với thời gian phát điện là 28 phút Acetate được tiết ra song song với sự tiêu thụ của glucose Sản lượng acetate tạo thành trên sinh khối đang phát triển được xác định là 0,29 g / g-1 Acetate đã được sử dụng lại khi glucose đã được sử dụng hết, nhưng đáng ngạc nhiên không thấy sự tiêu thụ acetat Ở giai đoạn này, sinh lý tế bào thay đổi từ que dài thành tế bào nhỏ hơn và mật độ dày hơn Quá trình chuyển đổi này có thể được quan sát bởi mật độ quang giảm Mật độ quang học tăng trở lại, khi các tế bào bắt đầu thụ tinh Sự hình thành protease bắt đầu song song với sự hình thành bào tử sau 4 giờ, khi acetate đã được ghi nhận lại và tiếp tục tăng thêm 7 giờ Sự kích hoạt hóa học đạt đến tối đa 8000 U * / mL-1 11 giờ sau khi tiêm
và sau đó giảm trong khi các tế bào giữ bào tử Năng suất tối đa của quy trình lô đã được xác định là 800 U * mL-1 h-1, không xem xét công việc chuẩn bị và làm sạch máy lên men
Trang 9Hình 2 Trong quá trình lên men theo thời gian của B licheniformis PWD-1 để tạo
ra keratinase dưới sự kiểm soát, thời gian chuyển đổi mật độ quang học (OD- ), sinh khối bào tử ( ), Glucose ( ) Và hoạt động proteolytic (Prot Act Điều kiện trong một lò phản ứng sinh học MBR-Mini
Tỷ lệ hình thành protease tối đa xảy ra song song với tốc độ bào tử bào tử tối đa (Hình 3) và theo tỷ lệ hình thành sinh khối tối đa với độ lệch tm=3,75 giờ (thời gian trưởng thành) Ngoài ra, cả hai tỷ lệ này cũng giảm tốc song song cho đến khi tỷ lệ hình thành sản phẩm trở nên âm tính Vào thời điểm này, hoạt tính proteolytic bắt đầu giảm khi tế bào vẫn tạo ra được bào tử Tỷ lệ hình thành protease tăng tuyến tính với tốc độ bào tử miễn là protease được hình thành Hiệu suất giả thuyết của hoạt động proteolytic
từ sinh khối spore Yprot / xsp được xác định đến 5050 U * / mg-1 Nhân giá trị này với nồng
độ sinh khối spore (Xsp) có trong hoạt động proteolytic tối đa (1.6g / L-1) cho phép hoạt động proteolytic tối đa thực tế khoảng 8000 U * / mL-1 Glucose được tiêu thụ hiệu quả ở quá trình nuôi cấy gián đoạn với nồng độ bắt đầu khoảng 20g / L-1 Hệ số năng suất sinh khối tổng thể YX giảm mạnh khi nồng độ glucose trên 20g / L-1 được áp dụng do sự gia tăng acetate
Tối đa đối với quá trình nuôi cấy gián đoạn sử dụng nồng độ bắt đầu glucose lên đến 10g / L-1 và giảm khi bắt đầu nồng độ glucose cao hơn Việc lên men theo lô sử dụng nồng độ trung bình 35 g / L-1 glucose cho thấy các giai đoạn trễ khác biệt trước khi
Trang 10tăng trưởng tế bào Nồng độ tối đa là 3,2 g / L-1 acetate trong quá trình lên men, trong khi sản lượng sinh khối tổng thể trên glucose giảm 35% so với các thí nghiệm sử dụng nồng độ bắt đầu glucose 10g / L-1 Hoạt tính proteolytic tối đa là 46 U * / mL-1 cũng rất thấp và không phát hiện bào tử nào trong quá trình lên men
Hình 3 Tiến trình thời gian của tỷ lệ tổng lượng sinh khối hình thành (rXtot- ),
bào tử tạo thành(rXsp- ), sự tạo thành protease (rprot ) Trong suốt quá trình lên men gián đoạn của Bacillus licheniformis PWD-1
Lên men theo mẻ với nồng độ nitơ khác nhau
Áp dụng môi trường tăng trưởng phức tạp tối ưu như môi trường cơ bản, casein peptone và nồng độ amoni sulfat đã thay đổi theo một thiết kế thống kê tổng hợp trung tâm để xác định tác động lên sự hình thành protease Ammonium sulfate được áp dụng trong các nồng độ từ 0,5 đến 5,5 g / L-1 và peptone casein từ 5 đến 11 g / L-1 Hoạt tính proteolytic tối đa của mỗi lần nuôi cấy và khối lượng tế bào tương ứng được xác định để tính toán hoạt tính proteolytic tối đa Hoạt động proteolytic đặc hiệu cao nhất đã được tìm
thấy khi glucose, casein peptone, và sunfat amoni được áp dụng ở tỷ lệ 100: 85: 26
Nồng độ sinh khối tối đa trong môi trường này đạt khoảng 70% thí nghiệm so sánh sử dụng môi trường tăng trưởng phức hợp được tối ưu hóa, do hàm lượng giảm của casein peptone Hoạt động proteolytic tối đa được cải thiện đến 185%
