Khảo sát thành phần hóa học của cây huỳnh đàng hai tuyến (Dysoxylum binectariferum)

Việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất tự nhiên từ nguồn sinh vật nói chung và thực vật nói riêng là một công việc quan trọng trong giai đoạn đầu nhằm tìm hiểu hóa thực vật của

1 MỞ ĐẦU 1

2.1 Giới thiệu về họ Xoan (Meliaceae) 2

1 MỞ ĐẦU

Trong đời sống con người, cây cỏ đóng một vai trò hết sức quan trọng, đặc biệt nhiều loài đã được sử dụng trong dân gian để làm thuốc chữa bệnh từ rất lâu Việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất tự nhiên từ nguồn sinh vật nói chung và thực vật nói riêng là một công việc quan trọng trong giai đoạn đầu nhằm tìm hiểu hóa thực vật của loài cây khảo sát, cung cấp cao thô và hợp chất tinh khiết cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học, tìm kiếm các hoạt chất có khả năng chữa bệnh

Với điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, rất thích hợp cho sự sinh trưởng của thực vật, nước ta có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú Đó là điều kiện rất thuận lợi cho ngành hóa học hợp chất tự nhiên và hóa dược phát triển

Dysoxylum là một chi lớn thuộc họ Xoan (Meliaceae), có nhiều loài có ứng dụng

trong thực tiễn như cung cấp gỗ quí phục vụ cho xây dựng, làm đồ dùng gia đình, cung cấp một nguồn lớn các terpenoid, alkaloid, limonoid có hoạt tính sinh học đa dạng, có khả năng kháng sâu bệnh, kháng viêm, kháng khuẩn

Huỳnh đàng hai tuyến (Dysoxylum binectariferum) được sử dụng trong y học dân

gian để trị cùi và lở loét Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu về loài cây này nhưng chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam Do vậy, trong điều kiện cho phép, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cây huỳnh đàng hai tuyến thu hái tại Vườn Quốc gia Lò Gò - Xa Mát, tỉnh Tây Ninh

2 TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về họ Xoan (Meliaceae)

Cây to hay nhỡ Lá mọc so le, kép lông chim, ít khi đơn Cụm hoa chùm, bông hay tán Hoa đều, lưỡng tính; lá đài 4-5, cánh hoa 4-5 có khi 3, rời hay dính ở dưới; nhị 5-

10, dính nhiều hay ít thành ống và đính trên đế hoa, ít khi rời, đĩa mật quanh bầu; bầu trên, 2-5 ô, ít khi 6, mỗi ô chứa 1-8 noãn, thường là 2 ở gốc trong lá noãn Quả khô hay nạc, mở hay không mở, ít khi quả hạch; hạt có vỏ cứng hay có cánh [1, 2]

Gồm 51 chi, phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [1, 2]

Theo GS Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam, họ Xoan có 20 chi với 85 loài phân bố rải rác khắp đất nước [3]

2.2 Giới thiệu về chi Dysoxylum

Có khoảng 200 loài, phân bố ở Ấn Độ, Đông Nam Á, Úc và New Zealand [4]

Ở Việt Nam, chi Dysoxylum có khoảng 15 loài, phân bố rải rác khắp đất nước ở

những vùng có đất bazan, đất đá vôi, đất sa thạch, đất pha cát [3]

2.2.2 Công dụng

Đa số những loài thuộc chi Dysoxylum ở Việt Nam là nguồn cung cấp gỗ có giá trị

trong xây dựng, làm đồ dùng gia đình [3]

Trong y học dân gian, nhiều loài thuộc chi này được dùng để chữa bệnh Cao nước

của vỏ cây D variabile được người dân địa phương PaPua New Guinea dùng chữa táo bón, đau bụng, đau dạ dày, bí tiểu, sốt [5] Lá và vỏ cây D richii được người bản xứ

Fiji dùng chữa bệnh méo mặt ở trẻ em, chân tay cứng, u dưới da, kích ứng da và chữa

bệnh lây nhiễm qua đường tình dục [6] Lá và vỏ cây D spectabile dùng chữa sốt, xuất

Triterpenoid hiện diện khá phổ biến ở chi Dysoxylum Năm 1991, Adesanya và cs

phân lập được năm apotirucallan triterpen mới là dysoron A-E (1-5) từ lá cây D

23,26-dihydroxy-tirucalla-7,24-dien-3-on (9) được Luo và cs tìm thấy vào năm 2000 từ

Năm 2001, Hisham và cs phân lập

21R,23R-epoxy-21α-etoxy-24S,25-dihydroxyapotirucall-7-en-3-on (10) là một apotirucallan triterpen mới và acetoxy-3β,25-dihydroxycycloartan (11) từ lá cây D malabaricum [9]

HOH

11

Liu và cs phát hiện được tám tirucallan triterpen mới là dyvariabilin A-H (12-19) từ

vỏ cây D variabile vào năm 2001 [5]

OH

OHOH

OAcO

21

Năm 1991, từ quả cây D richii, Aalbersberg và Singh tìm thấy tám triterpen trong

đó có bốn dammaran triterpen mới là metyl richenoat (22), richenon (23), richenol (24)

Dymalol (27), là một dammaran triterpen mới được phân lập từ lá cây D

malabaricum vào năm 1994 bởi Govindachari và cs [12] Năm 1999, Huang và cs phân lập một abeo-dammaran mới là (20R)-23(24→25)abeo-20,24-dihydroxydammaran-3-

on (28) từ quả cây D cauliflorum [13]

[14]

OMe AcO

OH

O

OH

30

Năm 2009, Ismail và cs tìm thấy hai triterpen mới từ cao MeOH của lá cây D

acutangulum thu hái ở Malaysia đặt tên là acutaxylin A (33) và B (34) Trong đó

acutaxylin B (34) có khả năng gây độc đối với tế bào ung thư bạch cầu [15]

OHHHO

HHO

HO

COOMe

OO

33

OHH

HHO

HO

COOMe

OH

34

Năm 2011, Kurimoto và cs phát hiện sáu triterpen và một triterpen glucosid mới

(35-41) từ cao MeOH của lá cây D cumingianum Các hợp chất này có hoạt tính gây

độc tế bào yếu đối với ba dòng tế bào ung thư người (KB-ung thư biểu mô, MCF7-ung thư vú và KB-C2) [16]

OH H

H OH

38

OHH

HHO

OMeO

HH

OH

40

OHH

Limonoid là các tetranortriterpenoid được tìm thấy khá phổ biến ở chi Dysoxylum

Năm 1987, Jogia và Andersen phân lập được một limonoid mới là dysoxylin (42) từ lá

cây D richii [17]

OO

O

OOH

42

Năm 2007, Chen và cs phân lập được bốn tetranortriterpenoid mới đặt tên là

dysoxylin A-D (43-46) từ vỏ cây D gaudichaudianum thu hái ở Papua New Guinea

Các hợp chất này có hoạt tính mạnh kháng lại hoạt động của virus hợp bào hô hấp

(RSV) bằng thử nghiệm in vitro và in vivo [18]

OOO

Đến năm 2008, Xie và cs phát hiện ba limonoid giảm cấp mới là dysodensiol A-C

(47-49) từ cành con và lá cây D densiflorum [19]

O O

pentenyl)-2-norbornanol (50), là một sesquiterpen từ quả cây D spectabile [7] Năm

2008, Xie và cs phát hiện ba sesquiterpen mới là dysodensiol D-F (51-53) từ cành con

và lá cây D densiflorum [19]

HO

50

OHH

HHOOC

Năm 1998, Fujioka và cs tìm thấy ba diterpen mới là dysokuson A-C (54-56) từ

thân cây D kuskusense [20] Và từ quả của loài cây này, năm 2000, Duh và cs phân lập

hai eudesman diterpen mới là dysokuson D-E (57, 58) [21]

O

O R

H

56

O H

ent-18-acetoxy-16-hydroxy-8(14)-pimaren-H H

64

O O

N

O

O OH

O

N

O HO

OH

O O

O

65

N O O

O

O OH

HO

R

OMe OMe

66 R=OMe

67 R=H

Năm 2010, Zhang và cs phân lập được tám alkaloid có khung tirucallan mới là

laxiracemosin A-H (68-75) từ vỏ cây D laxiracemosum [25] Và gần đây, năm 2011,

Huang và cs tìm thấy một alkaloid mới từ cành và lá con cây D lenticellatum đặt tên là

dysolenticin (76) [26]

N

R2

R3O

-N

R 1

CHO H

73 R=  -OH

74 R=  -OAc

NH O

O

R 75 R = O 76 R =  -OH,  -H

2.3 Cây huỳnh đàng hai tuyến

Huỳnh đàng hai tuyến hay chặc khế có tên khoa học là Dysoxylum binectariferum

Hook f., thuộc họ Xoan (Meliaceae) [1, 3]

2.3.1 Đặc điểm thực vật

Cây gỗ trung bình, cao 8-15 m; vỏ xám, khía dọc, có những vết sẹo lá, hình tim, bóng Lá kép lông chim lẻ, cuống chung dài 33 cm, cuống phụ 5 mm; lá chét 3-5 đôi mọc so le hoặc gần đối, mỏng, không lông, dài 12-15 cm, rộng 4-6 cm; phiến thuôn, bầu dục, đầu nhọn lồi, gốc lá nhọn, có khi gần tròn, lệch; gân bên 9-10 đôi [1]

Cụm hoa hình chùy ở nách lá, ngắn hơn lá, cao cỡ 10 cm; cuống hoa ngắn hơn hoa, hoa thuôn, dài 8 mm Đài hợp hình đấu với 4 răng bé Tràng 4 cánh hoa, màu vàng, dài hơn đài hai lần Nhị 8, họp thành ống hình trụ; bao phấn hình bầu dục, cụt, đính ở đầu ống Đĩa hình bao, bọc cao quá nửa bầu, phân thành 8 thùy Bầu tròn, có lông, vòi kéo dài, đầu nhụy dẹt; ô 4, mỗi ô có 2 noãn Quả nang dài 7 cm, rộng 5 cm, hình quả lê hoặc gần tròn, vỏ nạc, mở thành 4 mảnh, chứa 4 hạt dài 3.5 cm [1]

Hình 2.1 Hình cành, lá và hoa huỳnh đàng hai tuyến (Dysoxylum binectariferum) ở

Vườn Quốc gia Lò Gò - Xa Mát Phân bố ở Ấn Độ, nam Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia Ở nước ta, có gặp từ Tuyên Quang, Phú Thọ, Thái Nguyên, Hòa Bình vào tới Khánh Hòa [1]

Cây mọc trong rừng vùng núi Ưa ẩm, ưa đất cát pha trên các sườn núi ít dốc, có thể mọc trên núi đất lẫn đá Gỗ màu hồng hoặc xám có vân, thớ mịn, đóng đồ dung gia đình rất tốt, làm ván sàn, xây nhà cửa [1]

2.3.2 Các nghiên cứu hóa học trước đây

Theo tài liệu chúng tôi có được, trên thế giới có 6 báo cáo về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây huỳnh đàng hai tuyến Những khảo sát này được thực hiện trên mẫu cây thu hái ở Ấn Độ Kết quả cho thấy huỳnh đàng hai tuyến chứa terpenoid

và alkaloid, phân bố ở quả, vỏ và thân

Năm 1976, Singh và cs phân lập được dysobinin (77), một tetranortriterpen từ quả

Hợp chất này có tác động hạ hoạt thần kinh trung ương và kháng viêm [27] Năm 1988, Naik v à c s phân lập được rohitukin (78) từ vỏ cây Đây là một alkaloid

có hoạt tính ức chế tác nhân gây bệnh thấp khớp, ngoài ra có tác dụng hạ hoạt thần kinh trung ương, kháng viêm và kháng ung thư [28]

Từ rohitukin, nhiều chất có hoạt tính sinh học tương tự đã được điều chế [29] Trong

số đó, flavopiridol (79) là chất có khả năng kháng ung thư, kháng nhiều loại u bướu gồm

cả bệnh bạch cầu lympho, u rắn và hiện đang được Viện Quốc gia Ung thư Mỹ thử nghiệm lâm sàng để làm thuốc [30] Hợp chất này có thể sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với những loại thuốc khác để kháng ung thư [31]

N Me

3 NGHIÊN CỨU

3.1 Giới thiệu chung

Trong đề tài này, chúng tôi khảo sát thành phần hóa học của cây huỳnh đàng hai

tuyến (Dysoxylum binectariferum) thu hái tại Vườn Quốc gia Lò Gò - Xa Mát, tỉnh Tây

Ninh

Sắc ký cột cao etyl acetat (70 g) của lá và cành non trên silica gel bằng hệ dung ly hexan-EtOAc thu được 8 phân đoạn (1-8), trong đó các phân đoạn 3, 4, 7 có khối lượng lớn và cho vết rõ trên SKBM nên trong đề tài này chúng tôi chọn khảo sát 3 phân đoạn này

3.2 Kết quả và bàn luận

Thực hiện SKC phân đoạn 3, 4 và 7 chúng tôi phân lập được năm hợp chất

Phân tích các số liệu phổ NMR (1H, 13C NMR, HSQC và HMBC), chúng tôi định

danh được các hợp chất này bao gồm mellein (80), ferulaldehyd (81), acid vanillic (82), lupeol (83) và acid betulinic (84)

Sau đây là phần bàn luận cấu trúc của các hợp chất này

3.2.1 Mellein (80)

O O OH

1 2

4 6

8

9 4a

8a

80

Mellein (80) (HD1) thu được dưới dạng tinh thể màu trắng, cho phản ứng màu xanh

đậm với thuốc thử FeCl3 trong EtOH chứng tỏ đây là một dẫn xuất của phenol

Phổ 1H NMR (Phụ lục 1) cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với một nhóm hydroxyl kiềm nối [δH 11.02 (1H, s, 8-OH)], một vòng benzen 1,2,3- tam hoán [δH 7.41 (1H, t,

Các số liệu phổ trên cho thấy 80 có khung dihydroisocoumarin

Cấu trúc 80 được xác định dựa vào phổ HSQC (Phụ lục 3) và HMBC (Phụ lục 4)

Nhóm -OH kiềm nối (δH 11.02) phải gắn vào carbon hương phương mang oxygen duy nhất trong phân tử [δC 162.2, C-8] Trong phổ HMBC, hai proton hương phương ở δH

7.41 (1H, t, J= 8.0 Hz) và 6.89 (1H, d, J= 8.5 Hz) đều cho tương quan với C-8 Do vậy

hai proton này là H-6 và H-7 và suy ra C-5 mang proton hương phương còn lại [δH6.69, H-5] để tạo được vòng benzen 1,2,3- tam hoán Hằng số ghép cặp của proton

hương phương ở δH 7.41 cho tín hiệu mũi ba [δH 7.41 (1H, t, J= 8.0 Hz)] nên proton

này là H-6, suy ra proton ở δH 6.89 là H-7

O O OH

1 3

4 6

8

9 4a

8a 7

Hình 3.1 Các tương quan HMBC chính trong mellein (80)

Proton H-7 cho tương quan HMBC với carbon hương phương trí hoán ở δC 108.3, suy ra carbon này là C-8a Proton H-6 cho tương quan với carbon hương phương trí hoán ở δC 139.4 nên carbon này là C-4a Proton H-5 cho tương quan với carbon của nhóm metylen δC 34.6, suy ra carbon này là C-4 Proton H2-4 cho tương quan với carbon metin ở δ 76.1 và carbon metyl ở δC 20.8, nên hai carbon này lần lượt là C-3 và C-9

So sánh thêm số liệu phổ trên với tài liệu tham khảo [32] cho thấy hợp chất này là

3,4-dihydro-8-hydroxy-3-metylisocoumarin (80), còn gọi là mellein

Các tương quan HMBC chính của 80 được biểu diễn trong Hình 3.1 Số liệu phổ

1H, 13C NMR và tương quan HMBC của 80 được trình bày trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của mellein (80) trong CDCl3

3.2.2 Ferulaldehyd (81)

O H

OMe OH

9

8 7 1

3 4 5

81 Ferulaldehyd (81) (HD2) thu được ở dạng tinh thể hình kim màu trắng, cho phản

ứng màu xanh đậm với thuốc thử FeCl3 trong EtOH

Phổ 1H NMR (Phụ lục 5) cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của một proton aldehyd [δH 9.65 (1H, d, J= 8.0 Hz, H-9)], một vòng benzen 1,2,4- tam hoán [δH7.13 (1H, dd, J= 8.5 và 2.0 Hz, H-6), 7.07 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-2) và 6.96 (1H, d, J= 8.0 Hz, H-5)], hai proton trans olefin [δH 7.40 (1H, d, J= 16.0 Hz, H-7) và 6.59 (1H,

Cấu trúc của 81 được xác định dựa vào phổ HSQC (Phụ lục 7) và HMBC (Phụ lục

8) Trong phổ HMBC, proton aldehyd (δH 9.65, H-9) cho tương quan HMBC với carbon olefin ở δC 126.7 nên carbon này là C-7 hoặc C-8 Mặt khác, một trong hai

proton trans olefin (δH 7.40) cho tương quan HMBC với hai carbon hương phương mang proton (δC 124.2 và 109.7) và carbon hương phương trí hoán (δC 126.9) nên proton này gắn trên C-7 (δC 153.0) Suy ra proton trans olefin ở δH 6.59 gắn vào C-8 (δC 126.7) và carbon hương phương trí hoán là C-1, hai carbon hương phương mang

proton là C-2 và C-6 Hằng số ghép cặp của H-6 và H-2 [δH 7.13 (1H, dd, J= 8.5 và 2.0

Hz, H-6), 7.07 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-2)] cho thấy C-5 mang proton (δH 6.96; δC 115.1)

O H

OMe OH

9

8 7 1

3 4 5

Hình 3.2 Các tương quan HMBC chính trong ferulaldehyd (81)

Proton H-6 cho tương quan HMBC với carbon hương phương trí hoán mang oxygen ở δC 149.1 nên carbon này là C-4 Proton H-2 cho tương quan với C-4 và carbon hương phương trí hoán mang oxygen ở δC 147.2 nên carbon này là C-3 Mặt khác, proton của nhóm metoxyl (δH 3.95) cho tương quan HMBC với C-3 nên C-3 mang nhóm metoxyl Proton của nhóm hydroxyl tự do ở δH 5.98 cho tương quan với C-

3, C-4 và carbon hương phương mang proton ở δC 115.1 (C-5), tái xác nhận C-4 mang nhóm -OH

Vậy hợp chất trên là (E)-3-(3-metoxyphenyl)prop-2-enal hay

4-hydroxy-3-metoxycinnamaldehyd (81), còn gọi là ferulaldehyd

Các tương quan HMBC chính của 81 được biểu diễn trong Hình 3.2 Số liệu phổ

1

H, 13C NMR và tương quan HMBC của 81 được trình bày trong Bảng 3.2

Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

3.2.3 Acid vanillic (82)

COOH

OCH3OH

1

3 5

7

82

Acid vanillic (82) (HD3) thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng

Phổ 1H NMR (Phụ lục 9) và 13C NMR (Phụ lục 10) cho các mũi cộng hưởng ứng với 8 carbon gồm một vòng benzen 1,2,4- tam hoán [H 6.90 (1H, d, J= 8.0 Hz, H-5),

7.56 (1H, m, H-2), 7.56 (1H, m, H-6)], một carbon carbonyl của acid carboxylic [C 166.9 (C-7)] và một nhóm metoxyl [H 3.89 (3H, s, 3-OMe); C 55.0 (3-OMe)]

So sánh số liệu phổ trên với tài liệu tham khảo [33] cho thấy hợp chất này là acid hydroxy-3-metoxybenzoic, còn gọi là acid vanillic (82), được tìm thấy khá phổ biến

4-trong thực vật [34]

Số liệu phổ 1H và 13C NMR của 82 được trình bày trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của acid vanillic (82)

3.2.4 Lupeol (83)

HO

H

H H

20 21

22

23 24

Lupeol (83) (HD4) thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, không hấp thu

tia tử ngoại, điểm nóng chảy 190-192 °C

Phổ DEPT 90 và DEPT 135 (Phụ lục 11) cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của 6 nhóm CH, 11 nhóm CH2 và 7 nhóm CH3 Phổ 13C NMR (Phụ lục 12) cho các mũi cộng hưởng ứng với 30 carbon trong đó có hai carbon của nhóm exometylen [C 151.1 (s, C-20) và 109.5 (t, C-29)] và một carbon oxymetin [C 79.2 (d, C-3)] Phổ 1H NMR (Phụ lục 13) cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của 2 proton của nhóm exometylen [H 4.69 (1H, d, J= 2.5 Hz, H-29) và 4.57 (1H, m, H-29)],

một proton của alcol bậc hai [H 3.19 (1H, dd, J= 11.5 và 5.0 Hz, H-3)], một proton

alyl [H 2.38 (1H, td, J = 11.1 và 5.8 Hz, H-19)], một nhóm metyl gắn vào carbon

olefin [H 1.66 (1H, s, H3-30)] và 6 nhóm metyl bậc ba [H 0.97 (3H, s, H3-23), 0.83 (3H, s, H3-24), 0.79 (3H, s, H3-25), 1.03 (3H, s, H3-26), 0.95 (3H, s, H3-27), 0.76 (3H,

s, H3-28)]

Từ các số liệu phổ trên có thể dự đoán 83 có công thức phân tử C30H50O với độ bất bão hoà là 6, trong phân tử có một nối đôi C=C Vậy đây là một triterpen có 5 vòng So

sánh phổ của 83 với tài liệu tham khảo [35] cho thấy hợp chất này là lup-20(29)-en-3

-ol hay còn gọi là lupe-ol (83), một triterpen thường gặp trong thực vật

Số liệu phổ 1

H và 13C NMR của lupeol (83) được trình bày trong Bảng 3.4