khảo sát thành phần hóa học của cây phèn đen phyllanthus reticulatus poir , họ thầu dầu (euphorbiaceae)

Sơ đồ cô lập các chất hữu cơ trong cao ethyl acetate của cây Phèn đen ..... Bằng những con đường khác nhau, các nhà hóa học đã tạo ra những sản phẩm có ứng dụng trong các lĩnh vực như: y

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

KHOA HÓA HỌC



CỬ NHÂN HÓA HỌC Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

PHÈN ĐEN PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR., - HỌ

THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE)

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Ánh Tuyết

Sinh viên thực hiện : Trần Thanh Vương

Lớp : Hóa Hữu Cơ 4C

MSSV : 35106059

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2013

L ỜI CẢM ƠN

Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin chân thành cảm ơn:

 Cảm ơn Cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã theo sát, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp kiến thức và động viên em trong suốt thời gian thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp Được Cô hướng dẫn là một may mắn lớn của em trong năm học cuối cùng này tại trường Đại học Sư phạm Em xin cảm ơn Cô!

 Cảm ơn Thầy Dương Thúc Huy, Cô Lê Thị Thu Hương đã giúp đỡ và cho em những ý kiến quý báu để em hoàn thành đề tài của mình

 Cảm ơn tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa đã tận tình dạy dỗ em trong suốt bốn năm qua để em có kiến thức hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

 Cảm ơn các bạn Liêu Diệp Hân, Trần Thị Kim Liên, Lương Thị Thủy đã giúp đỡ, chia sẻ cùng em những khó khăn, vui buồn trong suốt quá trình thực hiện đề tài

 Cảm ơn ba mẹ và cả gia đình đã nuôi nấng, dạy dỗ, là chỗ dựa tinh thần vững vàng nhất giúp em vượt qua mọi khó khăn và đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này

Xin gửi lời chúc tốt đẹp nhất đến mọi người!

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC x

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY PHÈN ĐEN 4

1.1.1 Mô tả chung 4

1.1.2 Vùng phân bố, thu hái 4

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 4

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền 5

1.2.2 Các nghiên cứu về dược tính của một số loài thuộc chi Phyllanthus 5

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 6

1.3.1 Phyllanthus acidus 7

1.3.2 Phyllanthus acuminatus 7

1.3.3 Phyllanthus amarus L 7

1.3.4 Phyllanthus discoides 8

1.3.5 Phyllanthus emblica L 8

1.3.6 Phyllanthus flexuosus 8

1.3.8 Phyllanthus myrtifolius 9

1.3.9 Phyllanthus niruroides 9

1.3.10 Phyllanthus niruri L 9

1.3.11 Phyllanthus oxyphyllus 9

1.3.12 Phyllanthus polyanthus 9

1.3.13 Phyllanthus sellowianus 10

1.3.14 Phyllanthus simplex 10

1.3.15 Phyllanthus tenellus 10

1.3.16 Phyllanthus urinaria 10

1.3.17 Phyllanthus watsonii 10

CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 24

2.1 NGUYÊN LIỆU 25

2.1.1 Thu hái nguyên liệu 25

2.1.2 Xử lý mẫu nguyên liệu 25

2.2 HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25

2.2.1 Hoá chất 25

2.2.2 Thiết bị 25

2.3 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 26

2.3.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 26

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 26

2.4 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 26

2.5 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE 27

2.5.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate 27

2.5.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng 1 28

2.5.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.2 của bảng 2 28

2.5.4 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2 29

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT V3 33

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT V1 35

4.1 KẾT LUẬN 42

4.2 ĐỀ XUẤT 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 49

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

J Coupling constant Hằng số ghép cặp

RP – 18 Reversed Phase C-18 Pha đảo C-18

Rf Retention factor

1H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate (EA) 30

Bảng 2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng 1 30

Bảng 3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.4 của bảng 2 31

Bảng 4 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2 32

Bảng 5 Số liệu phổ NMR của V3 42

Bảng 6 Số liệu phổ NMR của V1 43

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1 Qui trình điều chế cao ether dầu hoả và ethyl acetate (EA) 29

Sơ đồ 2 Sơ đồ cô lập các chất hữu cơ trong cao ethyl acetate của cây Phèn đen 33

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Trái phèn đen 4

Hình 2 Thân, lá phèn đen 4

Hình 3 Tương quan HMBC của hợp chất V3 37

Hình 4 Tương quan HMBC của hợp chất V1 41

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Phổ 1H-NMR của hợp chất V3

Phụ lục 2 Phổ 13

C-NMR của hợp chất V3 Phụ lục 3 Phổ DEPT của hợp chất V3

Phụ lục 8 Phổ 13C-NMR của hợp chất V1

Phụ lục 8a Phổ 13

C-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 8b Phổ 13C-NMR của hợp chất V1

L ỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật, ngành hóa học đóng một vai trò rất quan trọng trong sự phát triển của xã hội Bằng những con đường khác nhau, các nhà hóa học đã tạo ra những sản phẩm có ứng dụng trong các lĩnh vực như: y học, dược học, sinh học và nông nghiệp,… Tuy nhiên, những sản phẩm được tạo

ra bằng cách tổng hợp mặc dù có kết quả nhưng lại gây ra nhiều tác dụng phụ cho con người và môi trường Vì thế, hóa học các hợp chất thiên nhiên ngày càng được quan tâm hơn Các nhà hóa học đã tiến hành tách chiết, cô lập, bán tổng hợp ngày càng nhiều những hợp chất có hoạt tính sinh học để tạo ra những sản phẩm hữu ích từ cây cỏ để nâng cao chất lượng cuộc sống

Các nghiên cứu trước đây cho thấy những loài thuộc chi Phyllanthus chứa nhiều

loại hợp chất có hoạt tính sinh học như: alkaloid, triterpenoid, tannin, lignan, sesquiterpen,…Ngoài ra, Y học dân gian đã phát hiện khoảng 20 loại cây cỏ có khả năng

chữa trị viêm gan, đặc biệt trong đó là các loài thuộc chi Phyllanthus (họ Thầu dầu,

Euphorbiaceae) [4]

Cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) là thực vật thuộc chi Phyllanthus

được dùng trong Y học cổ truyền của Việt Nam và nhiều nước trên thế giới Các bộ phận của cây đều được sử dụng làm thuốc: rễ Phèn đen thường được dùng trị lỵ, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận và trẻ em bị cam tích… Lá thường dùng chữa sốt, kiết

lỵ, tiêu chảy, phù thũng, ứ huyết do đòn ngã, huyết nhiệt sinh đinh nhọt… Vỏ thân được dùng để chữa lên đậu có mủ và tiểu tiện khó khăn…

Với mong muốn đi sâu hơn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, nâng cao tính hiệu quả, an toàn của dược liệu, đưa dược liệu vào sử dụng một cách khoa học hơn và có thể đẩy mạnh khai thác sử dụng cây thuốc này vào việc phòng và chữa bệnh

cho nhân dân trong cộng đồng nên chúng tôi quyết định chọn cây Phyllanthus reticulatus

Poir để làm đề tài nghiên cứu Hy vọng rằng kết quả nghiên cứu sẽ mang lại những hiểu biết mới về mặt hóa thực vật của cây Phèn đen, cũng như qua đó góp phần làm tăng giá

CHƯƠNG 1

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY PHÈN ĐEN [2]

Tên thông thường: Phèn đen

Tên gọi khác: Nỗ, Sáp tràng thảo, Tảo phàn diệp, Diệp hạ châu mạng

Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Tên khoa học: Phyllanthus reticulatus Poir

Hình 1: Trái phèn đen Hình 2: Thân, lá phèn đen

Cụm hoa hình chùm, mọc dưới nách lá, riêng lẻ hay xếp 2-3 cái một Quả hình

cầu, khi chín màu đen, dài 5 mm, rộng 3 mm Hạt hình 3 cạnh, màu nâu, có những đốm

rất nhỏ Cây ra hoa kết quả từ tháng 8 -10 hàng năm

1.1.2 Vùng phân b ố, thu hái [2]

Phèn đen là loài cây nhiệt đới nên có phân bố rất rộng, vùng Đông Nam Á, Nam Trung Quốc, Tây và Nam Phi

Ở nước ta, Phèn đen mọc thành bụi tự nhiên, có thể tìm dễ dàng ở bờ bụi ven đường, ven rừng

các loài được dùng làm thuốc nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L., Phyllanthus

reticulatus Poir và Phyllanthus amarus Schum et Thonn [5]

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền [2,6]

Phèn đen vị đắng chát, tính mát, có tác dụng làm se, giảm đau, sát khuẩn, giải độc Chủ trị làm thuốc cầm máu, chữa đậu mùa, chữa viêm cầu thận, chữa lỵ, tiêu chảy Trong

đó rễ phèn đen có vị chát, tính lạnh, có tác dụng tiêu viêm, thu liễm, chỉ tả Lá Phèn đen

có tác dụng thanh nhiệt giải độc, sát trùng, lợi tiểu…

Chữa kiết lỵ: dùng rễ cây Phèn đen, dây mơ lông, cỏ seo gà, cỏ tranh bằng nhau, mỗi vị 20g, gừng 2 lát 2g - sắc uống (Nam dược thần hiệu)

Chữa bị đòn máu ứ ở trong nguy cấp: lá Phèn đen giã nhỏ, chế rượu vào và vắt lấy nước uống (Bách gia trân tàng), hoặc dùng 40g sắc rồi chế thêm một chén rượu - uống

Chữa nhọt độc mới phát: lá Phèn đen và lá Bèo ván giã nát rồi đắp (Bách gia trân tàng)

Chữa nhiệt tả và lỵ: cây Phèn đen cả cành và lá, đậu đen sao, mỗi thứ 40g, đổ 4 bát nước sắc lấy 1 bát, chia ra uống làm 3 lần (Hoạt nhân toát yếu của Hoàng Đôn Hòa)

Chữa đại tiện ra máu: cây Phèn đen cả cành và lá, thái nhỏ 3 bát, sắc đặc uống (Bách gia trân tàng)

Chữa chảy máu nướu răng: lá Phèn đen phối hợp với lá Long não và lá Xuyên tiêu phơi khô, chế thành viên rồi ngậm

Trị rắn cắn: lá Phèn đen tươi nhai nát nuốt hết nước rồi lấy bã đắp lên chỗ rắn cắn

1.2.2 Các nghiên cứu về dược tính của một số loài thuộc chi Phyllanthus

Ở Quảng Tây Trung Quốc, cây Phyllanthus reticulatus Poir (Euphorbiaceae) là

một loại thuốc được sử dụng để chống viêm khớp và điều trị bệnh thấp khớp [44]

Năm 1997, E Omulokoki và cộng sự [14] đã sử dụng dịch chiết từ lá của loài

Năm 2010, một số báo cáo đã chứng minh rằng các chất chiết xuất của lá cây

gây độc tế bào và bảo vệ gan [28]

• Dược tính của một số cây khác cùng chi:

Năm 1961, Phòng Đông Y - Viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng

sinh của cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) cho thấy kết quả tác dụng kháng sinh như sau: Tụ cầu trùng (0,5 cm), Salmonella typhi (0,9 cm), Shigella flexneri (1,1cm), Shigella sonnei (0 cm), Shigella shigae (1cm), Bacillus subtilis (0,4 cm),

Escherichia coli (0 cm) [7]

Năm 1988, Blunberg và cộng sự [1] đã nghiên cứu tác dụng của hai loài cây chó

đẻ răng cưa là Phyllanthus amarus và Phyllanthus niruri trên các bệnh nhân viêm gan

siêu vi B Kết quả cho thấy có 22/37 bệnh nhân âm tính sau 30 ngày điều trị bằng hai loài

chó đẻ răng cưa trên Các tác giả còn chứng minh cây Phyllanthus amarus có chứa chất

làm ức chế men pelymerase DNA của virus viêm gan siêu vi B

Năm 2002, Nguyễn Bá Kinh và cộng sự [3] công bố kết quả nghiên cứu lâm sàng trên bệnh nhân viêm gan mãn tính Chế phẩm LIV/94 được sản xuất từ 3 loại thảo dược:

chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.), cây chua ngút (Embelia ribes Burn) và cỏ nhọ nồi (Ecliptaprostrata L.) được dùng để điều trị cho các bệnh nhân viêm gan mãn tính

trong 2 năm (2001-2002) Kết quả nghiên cứu cho thấy thuốc có tác dụng làm giảm và sạch HBsAg của bệnh nhân

Bên cạnh đó, năm 2007 các nhà khoa học Ấn độ đã khảo sát khả năng chống oxi hóa từ dịch chiết methanol của 5 loài Phyllanthus là: Phyllanthus debilis, Phyllanthus

quả cho thấy các dịch chiết này đều thể hiện tính kháng oxi hóa [24]

Chi Phyllanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có trên 700 loài gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ Ở Việt Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý

nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L (cây Chó đẻ răng cưa), Phyllanthus reticulatus

Poir (cây Phèn đen) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn (cây Diệp hạ châu đắng)

Thành phần hoá học của chi này rất phong phú và đa dạng [10]

Năm 1976, Wai-Haan Hui và cộng sự [46] đã cô lập được

21-α-hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one (61) , β-sitosterol (43), friedelin-1β,22β-diol (58) và glochidonol (60) khi

nghiên cứu trên loài Phyllanthus reticulatus Poir

Năm 1981, Joshi và cộng sự [19] đã phân lập được các hợp chất kém phân cực

Năm 2009, Phan Văn Dân [7] khảo sát thành phần hóa học cây Phyllanthus

chất β-sitosterol (43), β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (44),

2-acetamido-3-phenylpropyl 2-benzamido-3-phenylpropanoate (76)

Năm 2012, J Xiong Ma và cộng sự [21] đã phân lập được hai arylnaphthalene

lignan glycoside từ dịch chiết methanol của cây Phyllanthus reticulatus Poir., đó là

reticulatusides A (40) và reticulatusides B (41) Ngoài ra, tác giả còn đề cập tới sự hiện

diện của syringaresinol (42) trong cây này

Do chưa có nhiều công trình nghiên cứu trên cây Phèn đen (Phyllanthus

cùng chi

1.3.1 Phyllanthus acidus

Năm 1966, Sengupta và cộng sự [37] phân lập được hai pentacyclic triterpenoid,

đó là: phyllanthol (74) và olean-12-en-3β-ol (β-amyrin) (51).

1.3.2 Phyllanthus acuminatus

Năm 1984 - 1985, Pettit và cộng sự [31,32] đã tách được phyllanthostatin 1 (32), phyllanthostatin 2 (33), phyllanthostatin 3 (34), phyllanthostatin 4 (35) và phyllanthostatin 5 (36)

Năm 1990, Pettit và cộng sự [30] cũng đã cô lập được phyllanthostatin 6 (37)

1.3.3 Phyllanthus amarus L

Năm 1995, Yeap Foo [25] phân lập được acid amariinic (45)

Năm 1996, Peter J Houghton và cộng sự [29] đã tách được 2 alkaloid mới là

isobubbialine (4) và epibubbialine (2) cùng với 3 alkaloid đã biết là phyllanthine (11),

securinine (13) và nor-securinine (9) Cấu trúc của chúng được xác định dựa vào phân tích các dữ liệu phổ UV, IR, phổ MS và NMR

Năm 2005 và 2007, Herbert Kolodziej và Farah Naaz [15,17] cô lập được acid

shikimic (88) và epigallocatechin gallate (16)

Năm 2008, Thales R.Cipriani và cộng sự [43] phân lập được acid thiobarbituric

(14) và acid ascorbic (77)

1.3.4 Phyllanthus discoides

Năm 1973, Manske và cộng sự [26] đã tách được phyllanthin (38) và 2 alkaloid là phyllanthine (11) và phyllantidine (12)

Năm 1983, Aripova và cộng sự [38] đã cô lập được phyllalbine (10)

Năm 1988, Calixto và cộng sự [10] phân lập được

14,15-dihydroallosecurinine-15β-ol (1) tinh thể màu vàng da cam

1.3.5 Phyllanthus emblicaL

Năm 1992, Kumar Roy và cộng sự [23] đã cô lập được acid ascorbic (77)

Năm 1995, Mekkawy [13] phân lập được putranjivain A (50)

Năm 1996, Ghosal [16] đã tách được phyllanemblinin A (48) là chất bột màu trắng, emblicanin-A (46) và emblicanin-B (47).

Năm 1988, Calixto và cộng sự [10] đã cô lập được acid 2-O-galloylgalactaric (80)

và acid galloylmalic (81)

Năm 2000, Zhang và cộng sự [53] đã tách được prodelphinidin A1 (49)

Năm 2002, Zang và cộng sự [54] đã phân lập được

1-([2-O-β-D-glucopyranoside]-4,6-dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-1-one (82) ở dạng tinh thể và

1-({2-O-[D-apiofuranosyl)-(16)-D-glucopyranoside]}-4,6-dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-1-one

(83) là chất vô định hình màu vàng

Năm 2006, Ying-Jun Zhang [51] đã tách được acid phyllaemblic (87)

Năm 2008, Xiaoli Liu và cộng sự [49] đã phân lập từ dịch chiết methanol được

quercetin (22) và catechin (15), đây là hai chất có hoạt tính chống oxi hóa cao

1.3.6 Phyllanthus flexuosus

Năm 1993, Tanaka và các cộng sự [42] đã phân lập được 5 triterpenoid có tên gọi

như sau: olean-12-en-3β,15α-diol (70); lup-20(29)-en-3β,24-diol (66); olean-12-en-3β, 24-diol (71); oleana-11,13(18)-dien- 3β,24-diol (73), olean-12-en-3β,15α,24-triol (72), betulin (55) và lup-20(29)-en- 3β,15α-diol (67)

1.3.7 Phyllanthus fratermus

Năm 1988, Shunyo Matsunaga và cộng sự [40] công bố đã tách được acid

trichadenic B (75)

Năm 1997, Rajasubramaniam cùng các cộng sự [33] đã tách được acid

indole-3-butyric (5) và acid 1-naphthaleneacetic (84)

Năm 1999, Chen Lui và cộng sự [12] đã phân lập và nhận danh được

4-O-brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranos (78)

1.3.9 Phyllanthus niruroides

Năm 1996, Babady Bila và cộng sự [9] đã phân lập được một hợp chất mới thuộc

nhóm alkaloid là niruroidine (2,7-diepimer) (8)

Năm 1986, Joshi và cộng sự [20] đã tách được nirurine (7) và

4-methoxy-nor-securinine (6)

Năm 1991, Satyanarayana và Venkateswarlu [36] đã tách được 4 diarylbutane

lignan: 2,3-desmethoxy seco-isolintetralin (24), 5-desmethoxyniranthin (25), linnanthin

(39) và cuối cùng là demethylenedioxyniranthin (26)

Năm 2007, tại vùng Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh từ phần dịch chiết ethyl acetate

đã phân lập được hai chất là: 2,4,6-cyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy-1-one (79)

và 5,7,8-trihydroxy-9,10-peroxy-4-ethoxybenzo[2,3-d]coumarin (89) [5]

Năm 2008, Shakil và Pankaj [39] đã tách được 2 flavanone: 8-(3-

methyl-but-2-enyl)-2-phenylchroman-4-one (21) và chroman-4-one (19) có khả năng làm thuốc chữa bệnh gút (gout) và bệnh thận

Năm 2003, Sutthivaiyakit và cộng sự [41] đã tách được: acid

29-nor-3,4-seco-friedelantriterpen (68) và guaiane (85) Những hợp chất này được đánh giá là có khả năng chống oxi hóa tốt ở nồng độ IC50= 0.017 ± 0.001 mM

Năm 2008, Vuyelwa J.N và cộng sự [45] đã tìm ra được một số triterpenoid gồm:

(20S)- 3β-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol (54), lupenone (63) và

(20S)-3α-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol (53)

Theo luận văn cao học của Phan Văn Dân [7], năm 1971, 1972, 1974, các tác giả

lần lượt là Asakawa, Bick và Bilia đã phân lập được tenellus-1 (17) và tenellus-2 (18)

Năm 2000, Zhang L.Z và cộng sự [52] đã tách được một số triterpenoid như:

lupeol acetate (64) , β-amyrin (51), β-amyrylglucosid (52) và lupeol (62)

Năm 2003, Chang và cộng sự [11] đã cô lập được 2,3-desmethoxy

seco-isolintetralin diacetate (27), linnanthin (39), phyllanthin (38), hypophyllanthin (28), niranthin (29), nirtetralin (30) và phyltetralin (31) Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng cách thuỷ giải và dựa vào các dữ liệu phổ khối lượng và phổ cộng hưởng

từ hạt nhân

Năm 2005, Wanxing Wei và cộng sự [47] đã phân lập được acid

pentahydroxybenzoic (86)

Năm 1992, Matsunaga và Tanaka [27] đã tách được hợp chất triterpen:

26-nor-D:A-friedooleanane (69) cùng với một số hợp chất khác là: lupenyl palmitate (65),

friedelin (57), epi-friedelanol (56), glochidone (59), glochidonol (60), lupeol (62) và

lup-20(29)-en-3β,24-diol (66).

Các công thức cấu tạo một số hợp chất trong chi Phyllanthus

• Các alkaloid

H O

O

H OH H

N

H O O

H

O H

14,15-Dihydroallosecurinine-15-ol (1) Epibubbialine (2)

N O O

H3CO

OH

N

H O O

OH H

(14-Hydroxy-4-methoxy-13,14- Isobubbialine (4) dihydronorsecurinine) (3)

N H COOH

N

O CH3 O

O

Acid indole-3-butyric (5) 4-Methoxy-nor-securinine (6)

N O O

O H

O

H H

H OH

H

O O

Nirurine (7) Niruroidine (8) nor-Securinine(9)

O

O H3CO

O

N C H3

O O

H3CO

Phyllalbine (10) Phyllanthine (11)

N O

O O

H

O O

N H N O

S O

Phyllantidine (12) Securinine (13) Acid thiobarbituric (14)

• Các flavonoid

O O

O

OH OH

O

O

O

O OH OH

O OH O

O

O OH

Flavonoide tenellus-1 (17)

O H

O H OH

O

O

O

O O OH

O OH O

O H

O H

OH

O

O H OH OH

Flavonoide tenellus-2 (18)

O

O

CH3 C

H3

OH

1 2 3 4 5 6 7 8 4a 8a 1'' 2''3'' 1' 2'

3' 4' 5' 6'

O O

OH OH OH

Isoquercitrin (20)

2-(4-Hydroxyphenyl)-8-(3-metyl-but-2-enyl)-chroman-4-one (19)

O

CH3 C

H3

1 2 3 4 5 6 7 8 4a 8a 1'' 2''3'' 1' 2' 3' 4' 5' 6'

O O

OH O

OH

OH OH

Quercetin (22)

O O

OH OH

O O C

H3

OH

O O

CH2OH

O

OCH3OCH3

CH2OCH3

CH2OCH3

2,3-Desmethoxy seco-isolintetralin (24) 5-Desmethoxyniranthin (25)

OCH3OCH3

CH2OCH3

CH2OCH3O

OCH3OCH3

Demethylenedioxyniranthin (26) 2,3-desmethoxy seco-isolintetralin

diacetate (27)

8-(3-Methyl-but-2-enyl)-2-phenylchroman-4-one (21)

H3CO CH2OCH3

CH2OCH3

OCH3 OCH3

O O

H3CO

CH2OCH3

CH2OCH3

OCH3OCH3

O O

Hypophyllanthin (28) Niranthin (29)

CH2OCH3

CH2OCH3

OCH3 OCH3 H3CO

O O

CH2OCH3

CH2OCH3

OCH3 OCH3

H3CO

H

H

H H3CO

Nirtetralin (30) Phyltetralin (31)

O O CH3

CH3 O O

O

H O

OH CH3

CH3 O

O O CH3

CH3 O

CH3 O OH

Phyllanthostatin 1(32) Phyllanthostatin 2 (33)

O O CH3

O

O

H O

OH CH3

CH3 O

CH3 O

O O CH3

O

O H

O CH3 CH3 O

CH3 O OH

Phyllanthostatin 3 (34) Phyllanthostatin 4 (35)

O O CH3

O

O H

O CH3

CH3 O OH

CH3 O

O O CH3

O

O H

OH CH3 OH

Phyllanthostatin 5 (36) Phyllanthostatin 6 (37)

CH2OCH3

CH2OCH3

OCH3 OCH3

H3CO

H3CO

H H

O O

H3CO

H3CO

O

O O

O O

H O H

OH

O O HOH2C

OH OH

Reticulatusides A (40)

O O

O

H3CO

O

O O

O O

H

CH2OH O

H3CO

O H

H3CO

OCH3OH

OCH3

Syringaresinol (42)

• Các steroid

C H3

O H

CH3 H

CH3 CH3 CH3

H H

C H3

H

C H3

O

CH3 H

C H3

CH3 CH3 CH3

H

H H O

O H

O H

O

O O O O O

OH OH OH O

O

O OH

OH O

O H O

OH OH OH

O

OH OH

OH

OH

OH OH

O

O H O

OH

CO CO

O O O

HOH2C OH

O OH

OH

OH O

Emblicanin-B (47) Phyllanemblinin A (48)

OH O

H O H

CO CO

O OH

OH

O OHH

O H O O

O

H

OH

O H

OH

O OH O

O OH

O OH OH

O

OH OH

O C H3 CH2OH

CH3 CH3

CH3

CH3

C H3 CH3

O

CH2OH O

H O H

OH

CH3 H

H CH3 H

C H3

CH3 CH3

CH3

O H C H3

C H2

CH3 CH3

O

O

CH3

CH3 H

H CH3 H

C H3

CH3 CH3

CH3

O H C H3

C H2

CH3 CH3

O O CH3

(20S)-3α-Acetoxy-24- (20S)-3β-Acetoxy-24-

methylenedammaran-20-ol (53) methylenedammaran-20-ol (54)

O H C H3 CH3

CH3 CH3

CH3

CH2OH H

CH3C

H2

O H C H3

CH3 CH3

CH3

C H3

CH3

C

H3

CH3H

Betulin (55) Epi-friedelanol (56)

O

CH3

C H3 CH3

CH3 CH3 CH3

CH3 H

CH3

CH3H H

CH3OH

O OH

H

C

H3

CH3C

CH3

O

CH3C

H2

O CH2CH3

C H3

CH3

CH3

CH3 OH

CH3

C H3

O H C H3 CH3

CH3 CH3 CH3

CH3

H

CH3 C H2

21-α-Hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one (61) Lupeol (62)

O C H3 CH3

CH3 CH3 CH3

CH3

C H2 CH3

H

O C H3 CH3

CH3 CH3

CH3

H

CH3C

H2

CH3

C H3 O

O C H3 H

CH3 CH3 CH3

CH3

C H3 CH3

CH3 CH3

CH3

CH3 H

CH3C

H2

O C H3 CH2OH

CH3 CH3

CH3

H

CH3C

H2

CH3OH

Lup-20(29)-en-3β,24-diol (66) Lup-20(29)-en-3β,15α-diol (67)

O

CH3

C H3 COOH

CH3 CH3 CH3

CH3 H

H

OH H

H H

Acid 29-nor-3,4-seco-friedelantriterpen (68) 26-Nor-D:A-friedooleanane (69)

C H3 CH3 H

O H C H3 CH2OH

CH3 CH3

CH3 H CH3

C H3 CH3 H

Olean-12-en-3β,15α-diol (70) Olean-12-en-3β, 24-diol (71)

C H3 CH3 H

OH

O H C H3

CH3 CH3

CH3

CH3

C H3 CH3

CH3

C H3 CH3

CH3CH3CH3 CH3

HOOC H

H H

Phyllanthol (74) Acid trichadenic B (75)

O O

N N CH3

O O

OH O

H

OH H OH

Acid ascorbic (77)

Acetamido-3-phenylpropyl

2-benzamido-3-phenylpropanoate (76)

OH O

OH OH OH

O O

H

O H OH

O H

O H OH

O O

O

O O

OH OH

OH O

O

O O

4-O-brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl-

D-glucopyranos (78)

O H O

O H O H

OC2H5

O O O

O

O

O OH OH

OH O

O

O O

OH OH

OH

CH3 O

O

CH3

O OH

O H O H

O H OH

OH

Acid galloylmalic (81)

CH3 O O

CH3

O OH

O H O H

O H OH

O O

OH

OH OH

O OH

H3 H3C

C H3 CH3

C H3

O OH

O

O O

CH3O

O H

OH

O

H O

O H

Guaiane (85) Acid pentahydroxybenzoic (86) Acid phyllaemblic (87)

H

O H

OH

O O

O OCH2CH3

Acid shikimic (88) 5,7,8 -

trihydroxy-9,10-peoxy-4-ethoxybenzo[2,3-d] coumarin (89)

CHƯƠNG II

2.1 NGUYÊN LI ỆU

2.1.1 Thu hái nguyên li ệu

Mẫu cây dùng trong khảo sát thành phần hóa học là lá, thân và rễ cây Phèn đen

(Phyllanthus reticulatus Poir.) được thu hái tại huyện Tân Uyên, Bình Dương, vào tháng 7/2012

Mẫu cây đã được GS.TS Võ Văn Chi nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus

2.1.2 X ử lý mẫu nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn, đem sấy đến khối lượng không đổi Sau đó tiến hành ngâm chiết

và phân lập các hợp chất

2.2 HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.2.1 Hoá ch ất

Silica gel: silica gel 60, 0,04-0,06 mm, Merck dùng cho cột sắc ký

Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho sắc ký cột

Sắc ký bảng mỏng loại 25DC – Aflufolein 20×20, Kiesel gel 60F254, Merck;

Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm

Cân điện tử hiệu Sartorius max 620 g

2.3 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

- Sử dụng kỹ thuật SKC silica gel pha thường, pha đảo Rp-18 kết hợp SKLM

- Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 30%

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1

H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR đo trên máy Bruker Avance tại Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp.Hồ Chí Minh

- Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Bruker micrOTOF Q-II

Lá, thân và rễ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) được phơi khô, chặt

nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (m = 26.00 kg)

Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, sau đó đem lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (534.00 g)

Cao ethanol thô được chiết lỏng – lỏng với ether dầu hoả, ethyl acetate thu được cao ether dầu hoả (52.00 g), cao ethyl acetate (118.00 g) Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 1

Sơ đồ 1 Qui trình điều chế cao ether dầu hoả và ethyl acetate (EA)

ACETATE

2.5.1 S ắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

Thực hiện SKC silica gel trên cao ethyl acetate (118,00 g) với hệ dung môi rửa giải ED:EA có độ phân cực tăng dần từ 20% - 100% ethyl acetate Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ

Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn Kết quả thu được 4 phân đoạn (EA.1 - EA.4), được trình bày trong bảng 1

Bảng 1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate (EA)

Cao ether dầu hoả ED (52,00 g)

Cao ethyl acetate EA (118,00 g)

- Chiết lỏng-lỏng với ether dầu hoả, ethyl acetate

- Cô quay thu hồi dung môi

Cao ethanol (534.00 g)

Phân

đoạn

Dung môi giải ly

Trọng lượng (g)

EA.2 ED:EA = 7:3 7,90 Nhiều vết, tách không rõ Chưa khảo sát

Ghi chú: ED (ether dầu hỏa), EA(ethyl acetate)

2.5.2 S ắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng 1

Sắc kí lớp mỏng trên phân đoạn EA.3 (2.53 g, bảng 1) cho nhiều vết, các vết tách

rõ nên phân đoạn EA.3 được SKC silica gel với hệ dung môi rửa giải ED:C có độ phân

cực lần lượt tăng dần từ 80 – 90% C Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ

Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn Kết quả thu được 4 phân đoạn (EA.3.1 - EA.3.4), được trình bày trong bảng 2

Bảng 2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng 1

Phân

đoạn

Dung môi giải ly

Trọng

l ượng (mg)

EA.3.1 ED:C = 1:4 20 mg Nhiều vết, kéo dài Chưa khảo sát

EA.3.4 ED:C = 1:9 167 mg Nhiều vết, lẫn dơ Chưa khảo sát

Ghi chú: C (chlorofom), ED ( ether dầu hỏa)

2.5.3 S ắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.2 của bảng 2

Thực hiện SKC silica gel trên phân đoạn EA.3.2 (116 mg) của bảng 2 với hệ dung

môi rửa giải ED:C có độ phân cực tăng dần từ 60-90% C Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ

Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn Kết quả thu được 3 phân đoạn

Bảng 3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.4 của bảng 2

Phân

đoạn

Dung môi giải ly

Trọng lượng (mg)

EA.3.2.1 ED:C = 2:3 32 mg Nhiều vết dơ, mờ Chưa khảo sát

EA.3.2.3 ED:C = 1:9 29 mg Vết dơ, mờ Chưa khảo sát

Ghi chú: C (chlorofom), ED ( ether dầu hỏa)

Nhận xét:

Từ phân đoạn EA.3.2 của bảng 2, sắc kí cột thu được 3 phân đoạn sắp xếp theo

thứ tự EA.3.2.1 - EA.3.2.3

Trong đó, phân đoạn B.3.2.2 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu tím ẩn dưới

vết dơ mờ Thực hiện sắc kí cột silica gel pha thường nhiều lần kết hợp với sắc ký điều chế trên phân đoạn này thu được chất ở dạng gum, không màu (8.0 mg)

Kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng với nhiều hệ dung môi, hiện hình bằng H2SO430%, đun nóng chỉ thu được 1 vết rõ, màu tím, Rf = 0,4 (dung môi giải ly C100%) Hợp

chất này được ký hiệu là V3

2.5.4 S ắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2

Thực hiện SKC silica gel trên phân đoạn EA.3.3 (119 mg) của bảng 2 với hệ dung

môi rửa giải ED:C có độ phân cực lần lượt tăng dần từ 60 – 100% C Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ

Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn Kết quả thu được 3 phân đoạn (EA.3.3.1 - EA.3.3.3), được trình bày trong bảng 4

Bảng 4 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2

Phân

đoạn

Dung môi giải ly

Trọng lượng (mg)

EA.3.3.1 ED:C = 2:3 43 mg Nhiều vết dơ, mờ Chưa khảo sát

Ghi chú: C (chlorofom), ED (ether dầu hỏa)

Nhận xét:

Từ phân đoạn EA.3.3 của bảng 2, sắc kí cột thu được 3 phân đoạn sắp xếp theo thứ tự EA.3.3.1 - EA.3.3.3

Trong đó, phân đoạn EA.3.3.2 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu tím ẩn dưới

vết dơ mờ Thực hiện sắc kí cột silica gel pha thường nhiều lần trên phân đoạn này thu được hợp chất dạng bột, màu trắng (25.0 mg)

Kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi khác nhau, hiện hình bằng H2SO430%, đun nóng chỉ thu được một vết rõ, màu tím, Rf = 0,35 (dung môi giải ly C100%)

Kết tinh lại trong MeOH thu được hợp chất ký hiệu là V1