khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của bạch đầu ông vernonia cinerea

Từ các cao chiết của Bạch đầu ông, bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH, đã xác định được hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethanol tổng với giá trị IC50 là: 127 g/mL.. Đề tài “Thành p

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA

­­­­­­­­­­

MAI VĂN HIẾU

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

KHÁNG OXY HÓA CỦA BẠCH ĐẦU ÔNG

VERNONIA CINEREA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

Cần Thơ, 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA

­­­­­­­­­­

MAI VĂN HIẾU

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

KHÁNG OXY HÓA CỦA BẠCH ĐẦU ÔNG

- TS Nguyễn Trọng Tuân đã tận tình chỉ bảo, khuyến khích và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn, giúp tôi định hướng được con đường nghiên cứu khoa học của riêng mình

- ThS Nguyễn Thế Duy, một người anh, người Thầy đã luôn khuyến khích, chỉ bảo cho tôi từ những ngày đầu bước chân vào nhiên cứu khoa học, giúp tôi có nền tảng vững chắc để hoàn thành tốt luận văn này Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS Đái Thị Xuân Trang,

bộ môn Sinh Học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã có những đóng góp quí báo

để giúp tôi hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến tập thể lớp Hóa Dược K37 đã luôn đồng hành cùng tôi 4 năm qua Con xin cám ơn gia đình đã tin tưởng, ủng hộ con trong suốt quãng thời gian học Đại học này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tổ chức phi lợi nhuận “Góp phần đào tạo nhân tài Việt Nam” đã hỗ trợ tài chính cho tôi trong suốt 4 năm học Song song đó, tôi cũng gửi lời cám ơn đến “Hội cựu học sinh trường Trung học Thoại Ngọc Hầu” luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi học tập tốt

ii

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập ­ Tự Do ­ Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: TS Nguyễn Trọng Tuân

2 Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của bạch

đầu ông Vernonia cinerea

3 Sinh viên thực hiện: Mai Văn Hiếu MSSV: 2112023

Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015

Cán bộ hướng dẫn

TS Nguyễn Trọng Tuân

2 Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của bạch

đầu ông Vernonia cinerea

3 Sinh viên thực hiện: Mai Văn Hiếu MSSV: 2112023

Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015

Cán bộ phản biện

iv

TÓM TẮT

Bạch đầu ông (Vernonia cinerea) là một loại cỏ mọc hoang đã được sử dụng từ lâu như là một vị thuốc trong y học cổ truyền Từ các cao chiết của Bạch đầu ông, bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH, đã xác định được hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethanol tổng với giá trị IC50 là: 127 g/mL Kết quả định tính cho thấy trong toàn cây Bạch đầu ông có chứa flavonoid, triterpenenoid, steroid, glycoside, phenol, tannin Từ cao chiết hexane đã phân lập và xác định được cấu trúc của hai hợp chất là stigmasterol và một dẫn xuất của acid béo bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân Một vài sterol và triterpene khác như: -Sitosterol, campesterol, lupeol, -amyrin cũng được xác nhận hiện diện trong cao hexane bằng kĩ thuật GC-MS, trong đó campesterol lần đầu được xác nhận hiện diện trong Bạch đầu ông Các kết quả này góp phần làm phong phú thêm vốn hiểu biết về loài Bạch đầu ông mọc ở Việt Nam

v

ABSTRACT

Vernonia cinerea is widely distributed and has many traditionally

medical applications From the various extracts of Vernonia cinerea, using the

free radical DPPH, have determined the antioxidant activity of ethanol extract with IC50 = 127 (g/mL) The qualitative of phytochemical showed the present

of many phytochemical groups such as flavonoid, triterpenoid, steroid, glycoside, phenol, tannin From the hexane extract, two compounds namely: stigmasterol and a fatty acid derivative have isolated and elucidated their structure by NMR Some phytosterols and triterpenes including -sitosterol, campesterol, lupeol, -amyrin have also identified by GC-MS and campesterol

is the first time were reported in Vernonia cinerea These results have contributed to our knowledge about Vietnamese Vernonia cinerea

vi

MỤC LỤC

2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH 6

2.2.2 Các phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa 7

2.2.4 Cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenolic 9

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ 10

vii

3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa bằng DPPH 14

3.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết 17

3.3.5 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa TLC-DPPH 183.4 Định tính thành phần hóa học của các cao chiết 18

4.5 Kết quả phân tích thành phần triterpenoid-steroid 31

viii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Các sesquiterpene và hoạt tính sinh học của chúng 4

Bảng 2.2: Các phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa 7

Bảng 2.3: Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học [22] 12

Bảng 4.1: Độ hấp thu của dung dịch DPPH 24

Bảng 4.2: Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của Vitamin C 25

Bảng 4.3: Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của cao chiết 26

Bảng 4.4: Kết quả định tính các nhóm hợp chất 27

Bảng 4.5: Độ dịch chuyển hóa học của VC1 so với  ­stigmasterol ( ppm) 29 Bảng 4.6: Kết quả GC-MS của hhVC1 31

Bảng 4.7: Kết quả GC-MS của hhVC2 32

ix

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Bạch đầu ông (Venonia cinerea) 2

Hình 2.2: Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH 9

Hình 2.3: Cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenolic 10

Hình 3.1: Quy trình chiết phân đoạn các cao 14

Hình 3.2: Quy trình thử hoạt tính kháng oxy hóa DPPH 16

Hình 3.3: Quy trình thử nghiệm TLC-DPPH 18

Hình 3.4: Bố trí sắc kí cột nhanh - khô 21

Hình 3.5: Sơ đồ phân lập các chất từ cao hexane 22

Hình 4.1: Sắc kí bản mỏng các cao phân đoạn 23

Hình 4.2: Độ hấp thu theo nồng độ DPPH ở 0 và 30 phút 24

Hình 4.3: Phần trăm ức chế theo nồng độ của vitamin C 25

Hình 4.4: Phần trăm ức chế theo nồng độ của cao tổng 26

Hình 4.5: Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa TLC-DPPH 27

Hình 4.6: Sắc kí bản mỏng hợp chất VC1 28

Hình 4.7: Sắc kí bản mỏng hợp chất VC2 30

Hình 4.8: Cấu trúc sơ bộ VC2 31

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Khí hậu Việt Nam thích hợp cho sự phát triển của nhiều loài thực vật trong đó có nhiều loài được sử dụng làm thuốc Bạch đầu ông là một loài cỏ mọc hoang dại khắp nơi cả nước, ở một số vùng nó được dùng để ăn như một loại rau Bên cạnh đó, từ lâu trong dân gian đã sử dụng Bạch đầu ông như là một vị thuốc nam Tuy nhiên, các nghiên cứu về Bạch đầu ông vẫn còn hạn chế, chưa làm rõ được nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng cũng như thành phần hóa học của nó Do đó, việc đánh giá thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, của Bạch đầu ông là cần thiết nhằm làm sáng tỏ thêm nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng, góp phần làm rõ hơn tác dụng trị liệu của nó từ đó định hướng sử dụng Bạch đầu ông vào lĩnh vực dược học hiệu quả hơn

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Trên cơ sở các nghiên cứu ở ngoài nước cũng như những hạn chế của các nghiên cứu trong nước Đề tài “Thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy

hóa của Bạch đầu ông Vernonia cinerea” mong muốn đạt được các mục tiêu sau:

- Định tính các nhóm hợp chất có trong Bạch đầu ông

- Phân lập các hợp chất từ cao chiết Bạch đầu ông ở quy mô phòng thí nghiệm

- Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa ở mức độ in vitro của cao chiết từ

Bạch đầu ông

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Thu hái, và xử lý nguyên liệu: Bạch đầu ông sau khi thu hái được cắt nhỏ, phơi khô rồi nghiền thành bột

- Trích ly cao ethanol tổng từ bột khô, sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau như: hexane, ethyl acetate, để phân lập các nhóm hợp chất có độ phân cực khác nhau bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng

- Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết bằng phương pháp DPPH, TLC-DPPH

- Khảo sát thành phần hóa học các cao chiết thu được

- Xác định cấu trúc của các hợp chất cô lập được bằng phương pháp phổ như: NMR, IR, MS…

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây Bạch đầu ông

2.1.1 Tên gọi

Tên gọi khác: Nụ áo hoa tím, Bạc đầu nâu, Dạ hương ngưu

Tên khoa học: Vernonia cinerea (L.) Less., họ Cúc – Asteraceae [1]

2.1.2 Đặc điểm

Mô tả thực vật: Cây thảo cao 20-80cm Thân đứng có khía, có lông mềm

rạp xuống Lá hình dải, hình múi mác hay hình quả Trám, gần như nguyên hay

có răng rõ, kích thước rất thay đổi Cụm hoa là ngù ở ngọn, đôi lúc ở bên, gồm nhiều đầu Lá bắc xếp thành 3 hàng Mào lông màu trắng hay vàng nhạt, lông không đều nhau, những lông ngoài rất ngắn Tràng hoa màu hồng hay đo đỏ, các thuỳ thuôn, hình chỉ Bao phấn có tai rất ngắn Quả bế có lông nhung dày,

có rạch hay không [Hình 2.1]

Hình 2.1: Bạch đầu ông (Venonia cinerea)

Phân bố: Loài cây nhiệt đới, rất phổ biến ở nước ta, mọc hoang ven

đường đi, bãi cát, bờ ruộng từ miền núi đến đòng bằng trung du và ven biển Cũng phân bố ở nhiều nơi khác vùng Viễn Đông, ở châu Phi, châu Ðại Dương

2.1.3 Công dụng

Tính vị, tác dụng: Cây có vị đắng, ngọt, tính mát; có tác dụng thanh can,

thoái nhiệt, an thần Ở Java (Indonesia) người ta dùng toàn cây nấu chín ăn như rau Ở Ðông Phi Châu, lá và hoa được xem như là lợi tiêu hoá

3

Công dụng: Thường dùng trị: 1 Sổ mũi, sốt, ho (lá); 2 Lỵ, ỉa chảy, đau

dạ dày (rễ); 3 Viêm gan (hoàng đản cấp tính); 4 Suy nhược thần kinh; 5 Mụn nhọt, viêm tuyến sữa, hắc lào, chàm, rắn cắn Ở Vân Nam, Trung Quốc cây còn được dùng trị sốt rét, đòn ngã, mất ngủ, bạch đới, trẻ em khóc đêm Ở Nouvelle-Calédonie, cây được dùng hãm uống giúp lợi tiêu hóa, lợi dạ dày, trị thấp khớp

Cách dùng: Ngày dùng 15-30g cây khô sắc uống với các vị thuốc khác

Dùng lá giã đắp để chữa đinh nhọt, rắn cắn và bệnh ngoài da Bột lá lẫn với vôi dùng đắp trị đau đầu, vết thương Có thể dùng cành lá nấu nước rửa

Ðơn thuốc:

- Sổ mũi, sốt, ho: Bạch đầu ông, Ngũ trảo, rễ Bồ hòn, lá Gừa (sanh) mỗi vị 15g nấu nước uống

- Suy nhược thần kinh: Bạch đầu ông, Hy thiêm mỗi vị 15g, Chua me đất,

Rau bợ mỗi vị 12g, Sẹ (Alpinia oxyphylla) 6g, sắc uống.

- Huyết áp cao: Bạch đầu ông, Chua me đất, Hy thiêm mỗi vị 15g, đun sôi lấy nước uống

2.1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

a) Ngoài nước

Đã có nhiều công trình nghiên cứu ngoài nước về hoạt tính sinh học của các cao chiết từ Bạch đầu ông Nghiên cứu cho thấy cao methanol có khả năng

kháng khuẩn, có thể tiêu diệt và làm thay đổi hình thái của Pseudomonas

aeruginosa [2], cao benzene thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, có khả

năng kháng hàng loạt vi khuẩn Gram (-) lẫn Gram (+) [3] Nghiên cứu trên mô hình chuột cho thấy cao lá của Bạch đầu ông với nồng độ từ 100-400 mg/kg

có tác dụng giảm đau, hạ sốt kháng viêm nên có tiềm năng trong việc điều trị sốt rét [4, 5] Ngoài ra, cao chloroform từ lá có hoạt tính lợi tiểu trên mô hình chuột bạch tạng trong khi cao nước và cao methanol lại có hoạt tính chống lợi tiểu [6] Nghiên cứu còn cho thấy cao chiết methanol không gây ra độc tính trên mô hình chuột và brine shrimp thử nghiệm [7], từ đó cho thấy việc sử dụng Bạch đầu ông là an toàn

Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy thành phần chủ yếu là

các sesquiterpene với việc đã phân lập được rất nhiều sesquiterpene 1­19 với

nhiều hoạt tính đáng chú ý như kháng ung thư, kháng viêm, kháng sốt rét [Bảng 2.1] Ngoài ra, thành phần tinh dầu Bạch đầu ông cũng chứa gần 90% các sequiterpene tiêu biểu là : β-caryophyllene (23.2%), δ-cadinene (10.3%),

γ-amorphene (7.5%), cis-β-guaiene (6.8%), premnaspirodiene (6.3%) and

9-epi-β-caryophyllene (4.8%) [8]

Kháng viêm, ức chế

NO, kháng sốt rét, diệt

u nguyên bào đệm, kháng ung thư vú

[9-11]

5

8-(2-Methylacryloyloxy)-hirsutinolide-13-O-acetate

Hoa, toàn thân

Kháng viêm, diệt u nguyên bào đệm, kháng ung thư vú

5

Ngoài ra, cũng đã phân lập được một vài hợp chất dạng isoprenoid,

flavonoid và dẫn xuất của acid béo bao gồm: Loliolide 20, isololiolide 21

(3R)-3-hydroxy-ionone 22, apigenine 23, (9Z,12S,13S)-

dihydroxy-9-octadecanoic acid 24 [10]

O

O HO

O

(CH2)4CH3

7

OH OH

-6

2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH

2.2.1 Sơ lược về gốc tự do và tác hại

Gốc tự do là những nguyên tử, phân tử hay những mảnh nguyên tử, phân

tử có chứa một hay nhiều electron không độc thân liên kết lớp ngoài cùng, có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian ngắn Chúng là những phần tử có khả năng phản ứng cao, dễ dàng lấy đi điện tử của phân tử khác nhằm bền vững hoá lớp vỏ điện tử của mình nhưng đồng thời sinh ra một gốc tự do mới, gốc tự do mới lại tiếp tục phản ứng với phân tử khác và tạo thành phản ứng dây chuyền [13]

Oxy hóa stress là hiện tượng khi các gốc tự do có vai trò quan trọng trong cơ thể, là những chất chuyển hóa trung gian có hoạt tính mạnh, vượt quá

sự kiểm soát của cơ thể tấn công vào hệ thống các mô, cơ quan, các base trong nucleic acid, các amino acid trong chuỗi protein, các acid béo chưa bão hoà…

và gây ra hàng loạt biến đổi có hại cho cơ thể như: lão hóa, các vấn đề tim mạch, thoái hóa thần kinh, các bệnh ung thư, Tuy nhiên, quan điểm hiện tại cho rằng oxy hóa stress không hẳn luôn có hại Tùy thuộc vào mức độ biểu hiện, nó có thể đóng vai trò quan trọng trong một số quá trình quan trọng trong

cơ thể như: trong lộ trình truyền tín hiệu, sự tổng hợp các enzyme chống oxy hóa, các quá trình tự sửa chữa, sự nhân lên hay chết theo chương trình của tế bào Vì thế, sự điều hòa các chất chống oxy hóa không đúng cách có thể gây ra các tác động tiêu cực đến cơ thể sống [13]

7

Chất chống oxy hóa là những phân tử có thể ức chế quá trình oxy hóa của các phân tử khác

2.2.2 Các phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa

Ở mức độ in vitro, có nhiều phương pháp khác nhau để đánh giá khả

năng kháng oxy hóa nhưng nhìn chung rơi vào ba nhóm phương pháp là: quang phổ, điện hóa hóa học và sắc kí [Bảng 2.2] trình bày chi tiết về nguyên tắc của từng phương pháp cũng như cách để xác định điểm kết thúc của các phương pháp thử của nhóm quang phổ [14, 15]

Phương pháp quang phổ dựa trên phản ứng của một gốc tự do (DPPH, ORAC, HORAC, TRAP); cation gốc tự do (ABTS) hay phản ứng tạo phức (FRAP, PFRAP) với một chất chống oxy hóa có khả năng cho một nguyên tử hydrogen Phương pháp đo điện hóa học dựa vào sự khác biệt về điện trước và sau khi phản ứng Trong các phương pháp này, kĩ thuật quét thế vòng tuần hoàn và biamperometry được sử dụng phổ biến nhất Các phương pháp sắc kí cũng cho phép xác định khả năng kháng oxy hóa toàn phần nhưng có ưu điểm

là cho phép tách riêng các thành phần kháng oxy hóa từ đó có thể định lượng được chính xác các thành phần có hoạt tính kháng oxy hóa

Bảng 2.2: Các phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa

Phương pháp quang phổ

DPPH Chất chống oxy hóa phản ứng với gốc

tự do hữu cơ

Đo cường độ màu

ABTS Chất chống oxy hóa phản ứng với gốc

tự do hữu cơ

Đo cường độ màu

FRAP Chất chống oxy hóa phản ứng với phức

Fe(III)

Đo cường độ màu

PFRAP Chất chống oxy hóa khử kali

ferricyanide và phản ứng tiếp theo của kali ferrocyanide với Fe3+

Đo cường độ màu

CURAC Chất chống oxy hóa khử Cu(II) thành

Cu(I)

Đo cường độ màu

ORAC Chất chống oxy hóa phản ứng với gốc

tự do peroxyl (ROO•) được sinh ra từ AAPH (2,2’-azobis-2-amidino-propane)

Đo độ giảm cường

độ huỳnh quang của fluorescein

HOARC Chất chống oxy hóa trung hòa gốc tự do

OH• sinh ra bởi Co(II) dựa trên hệ thống

Đo độ giảm cường

độ huỳnh quang của

8

TRAP Chất chống oxy hóa trung hòa các gốc

tự do dẫn xuất từ luminol, sinh ra bởi sự phân hủy AAPH

Độ mất khả năng phát quang hóa học

Phương pháp điện hóa hóa học

Đo cường độ của tín hiệu cathod/ anod

Biamperometry Phản ứng của chất phân tích với chất

oxy hóa sẽ tạo thành một cặp oxy hóa, khử

Đo thế của hai điện cực giống nhau với…

Phương pháp sắc kí

Sắc kí khí Phân tách hỗn hợp chất dựa trên sự

phân bố giữa pha tĩnh lỏng và pha động

là một chất khí

Đầu dò ion hóa ngọn lửa hay đầu dò đo độ dẫn nhiệt

Đầu dò UV-Vis, huỳnh quang, khối phổ, điện hóa

Ở mức độ thử nghiệm in vivo, một vài phương pháp bao gồm:

- Đánh giá khả năng khử Fe của huyết tương

- Đánh giá khả năng khử glutathione (GSH)

- Đánh giá mức glutathione peroxydase (GSHPx)

- Đánh giá glutathione-S-tranferase (GSt)

- Phương pháp superoxyde dismutase (SOD)

- Catalase (CAT)

- Thử nghiệm hoạt tính của -glytamyl transpeptidase

- Thử nghiệm glutathione reductase (GR)

- Thử nghiệm mức độ peroxy hóa của lipid

- Thử nghiệm LDL

Trong tất cả các phương pháp thử kể trên, DPPH là phương pháp được

sử dụng phổ biến nhất ở mức độ in vitro trong khi đó LPO là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất ở mức độ in vivo để đánh giá khả năng kháng oxy

hóa [16] Vì thế, phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa thông qua

9

khả năng làm sạch gốc tự do DPPH được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết từ bạch đầu ông

2.2.3 Nguyên tắc của phương pháp DPPH

Phương pháp DPPH được giới thiệu lần đầu tiên bởi Marsden Blois vào năm 1958 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do ổn định, bền ở nhiệt độ thường, dạng bột màu đen ở điều kiện thường, có màu tím đặc trưng trong dung môi (thường dùng methanol, ethanol) Gốc DPPH có bước sóng hấp thu cực đại ở 517 nm và độ hấp thu của nó giảm tương ứng khi nguyên tử

N mang một điện tử lẻ nhận một điện tử hoặc hydro từ các chất chống oxy hóa (dung dịch DPPH từ màu tím đen chuyển sang màu vàng) [Hình 2.2] Do đó, DPPH được sử dụng rộng rãi và là thử nghiệm cơ bản để đánh giá hiệu quả hoạt động làm sạch gốc tự do của các chất chống oxy hóa dựa trên sự thay đổi

độ hấp thu của dung dịch DPPH ở 517 nm

Hình 2.2: Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH Khả năng kháng oxy hóa của một chất được biểu hiện bằng giá trị IC50, nồng độ chất chống oxy hóa để có thể ức chế 50% gốc tự do DPPH Giá trị IC50 càng nhỏ, hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh

2.2.4 Cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenolic

Các hợp chất phenolic là thành phần chủ yếu trong cao chiết thực vật có vai trò như là các chất chống oxy hóa tự nhiên Cơ chế phản ứng của các hợp chất phenolic (ArOH) với DPPH được biểu diễn theo hai cơ chế: cơ chế chuyển dịch electron (Hydrogen Atom Transfer – HAT) và cơ chế dịch chuyển electron mất tuần tự proton (Squential Proton Loss Electron Transfer – SPLET) Trong cơ chế HAT, nguyên tử H trong liên kết O–H dịch chuyển trực tiếp từ ArOH đến DPPH Thay vào đó, cơ chế SPLET khởi đầu bằng sự deproton hóa tạo ion phenolic (ArO─) rồi DPPH nhận một electron từ ArO─

10

[Hình 2.3] biểu diễn sự tương quan giữa hai cơ chế HAT và SPLET, từ đây ta

có thể thấy dung môi dung để hòa tan hỗn hợp phản ứng có thể ảnh hưởng đến phản ứng của chất chống oxy hóa với DPPH thông qua cơ chế HAT Dung môi có thể đóng vai trò là chất cho hay nhận liên kết hydrogen [14]

Hình 2.3: Cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenolic

2.2.5 Phương pháp TLC­DPPH

Sắc kí bản mỏng kết hợp với việc hiện hình bằng DPPH (TLC-DPPH) là một phương pháp cải biến của sắc kí bản mỏng thông thường cho phép định tính khả năng kháng oxy hóa của một chất hay của các cao chiết thực vật Bản mỏng sau khi giải ly sẽ được hiện hình bằng dung dịch DPPH Các thành phần kháng oxy hóa sẽ chuyển sang màu vàng trên nền tím của DPPH tương tự như khi ủ dung dịch chất kháng oxy hóa với cao chiết [17, 18] Phương pháp này

có thể sử dụng cho cả bản mỏng pha thường và cả pha đảo [19]

Ưu điểm của phương pháp này là cho phép định tính nhanh các thành phần gây ra hoạt tính kháng oxy hóa nên cho phép sử dụng để sàng lọc các hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa từ thực vật [20] Đồng thời, nó còn cho phép đánh giá định tính khả năng kháng oxy hóa của các thành phần kém phân cực vốn rất khó khi sử dụng phương pháp DPPH thông thường do khả năng hòa tan kém của chúng trong các dung môi phân cực như ethanol, methanol

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ

Có nhiều phương pháp phổ nghiệm khác nhau để xác định cấu trúc một chất như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance); khối phổ MS (Mass Spectroscopy), phổ hồng ngoại (IR), phổ RAMAN, phổ nhị sắc vòng tròn CD (Circular Dichroism), phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis (Ultraviolet-Visible spectroscopy), nhiễu xạ tia X (X-Ray) [21]

Trong hóa học hữu cơ, để xác định cấu trúc hóa học một chất chưa biết, cần phải kết hợp nhiều phương pháp phổ khác nhau Công thức hóa học được xác định chính xác bằng khối phổ MS thay cho các kĩ thuật phân tích nguyên

tố cổ điển kém chính xác Phổ hồng ngoại cho biết thông tin về các nhóm chức tồn tại trong phân tử trong khi đó, kĩ thuật UV chỉ cho thông tin ít ỏi, kém

11

chính xác về một số nhóm hợp chất đặc trưng nên ít khi được dùng trong việc xác định cấu trúc phân tử Phổ cộng hưởng từ NMR là một công cụ mạnh và rất hữu dụng cho phép xác định khung sườn carbon của phân tử Trong một số trường hợp, nó còn cho phép xác định hóa học lập thể của phân tử Nếu các kĩ thuật cộng hưởng từ chưa đủ để kết luận lập thể của phản ứng thì có thể sử dụng thêm các kĩ thuật phổ khác như phổ nhị sắc vòng tròn CD hay phổ tán xạ quay ORD Nhiễu xạ tia X (X-Ray) là một công cụ mạnh mẽ cho phép xác định cấu trúc của các chất, đặc biệt là trong việc xác định cấu trúc của các protein vốn dĩ các phương pháp phổ kể trên không thực hiện được [Bảng 2.3] trình bày tóm tắt các các phương pháp phổ kể trên cũng như uu nhược điểm của từng phương pháp

12

Bảng 2.3: Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học [22]

khả kiến

Tử ngoại, khả kiến

Tia X

Không Không Được (nếu tách được)

Thông tin

độ tinh khiết

Độ dịch chuyển Hằng số ghép

Độ dịch chuyển Ion đơn hay

đa điện tích

Trạng thái dao động

Trạng thái electron

[] Vị trí tương đối của

các nguyên tử Cấu hình tuyệt đối R/S

Phổ đồ

13

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện

600C đến khi mẫu giòn, có thể bóp vụn rồi nghiền mẫu thành bột thu được 3,2

kg bột khô, trữ mẫu trong túi nylon được cột kín ở nhiệt độ phòng

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị

 Máy quang phổ hồng ngoại FT – IR Nicolet 6700

 Máy cô quay chân không

 Máy soi UV bước sóng 254 và 365 nm

 Cân phân tích Sartorius

3.2 Điều chế các cao chiết

Bột Bạch đầu ông khô (3,2 kg) được cho vào túi vải rồi cột kín, ngâm chiết trong 20 L EtOH 96 độ / 5 lần, mỗi lần ngâm không dưới 24 h Sau đó dịch chiết được lọc qua giấy lọc rồi tiến hành cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp thu được khoảng 0,5 L cao chiết EtOH tổng dạng lỏng

Cao chiết EtOH tổng được phân bố vào 0,5 L nước dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm thu được tổng cộng 1 L dịch nước Tiến hành chiết phân bố lỏng-

và với hai biên là 0,5 cm Thực hiện trên hai bản khác nhau rồi giải ly trong hai hệ dung môi tương ứng là 100% CHCl3 và EA:MeOH:H2O = 100:13,5:10 với quãng đường di chuyển của dung môi kể từ vạch xuất phát là 5 cm Hiện hình bằng dung dịch vanillin trong dd H2SO4 10% rồi sấy ở 110oC trong 5 phút rồi quan sát kết quả

3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa bằng DPPH

Có nhiều phương pháp khác nhau để thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của một chất Trong tất cả các phương pháp thử, phương pháp làm sạch gốc tự

0,5 L cao EtOH dạng lỏng

Bột Bạch đầu ông 3,2 kg

- Ngâm chiết trong EtOH 960 (5 lần)

-Cô đuổi dung môi

Dịch nước 1

Cao Hex

- Phân bố vào 0,5 L nước bằng siêu âm

- Chiết phân bố với hexane

Dịch nước 2

Cao EA - Chiết phân bố với EA - Cô đuổi EA

15

do DPPH (gọi tắt là phương pháp DPPH) là phương pháp được sử dụng phổ

biến nhất ở mức độ in vitro [16] Ngoài ra, phương pháp này có ưu điểm là

đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với điều kiện có sẵn trong phòng thí nghiệm nên hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết Bạch đầu ông sẽ được đánh giá bằng phương pháp DPPH

Do đây là một phương pháp sử dụng gốc tự do hóa học, không thể đánh giá trực tiếp hoạt tính trên cơ thể sống nên cần có một chất chống oxy hóa đối chứng, gọi là chất đối chứng dương Kết quả kháng oxy hóa mạnh hay yếu của các cao chiết sẽ được đánh giá gián tiếp bằng các đối chiếu với chất đối chứng dương này Có nhiều chất đối chứng dương đã được sử dụng bao gồm: Trolox, tocopherol, acid gallic, Tuy nhiên, vitamin C được sử dụng rộng rãi nhất bởi

dễ tìm và đóng vai trò sinh học quan trọng trong cơ thể Vì thế, vitamin C được sử dụng làm chất đối chứng dương trong nghiên cứu này

3.3.1 Lựa chọn các điều kiện phản ứng

a) Bước sóng tối ưu

Có nhiều công bố khác nhau về cực đại hấp thu của gốc tự do DPPH với khoảng hấp thu cực đại từ 515-520 nm trong đó bước song 517 nm được sử dụng rộng rãi nhất Vì thế trong nghiên cứu này, bước sóng được sử dụng là

517 nm [23]

b) Dung môi dùng cho phản ứng

Dung môi dùng cho phản ứng phải vừa hòa tan được DPPH, vừa hòa tan được chất thử Gốc tự do DPPH không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi hữu cơ phân cực như ethanol, methanol nên các dung môi này được dùng phổ biến cho phản ứng Tuy nhiên, trong một số trường hợp chất thử lại không tan trong ethanol hay methanol, trong trường hợp này, các dung dịch đệm methanol (pH 5,5) và đệm ethanol (pH 3,0) được dùng [23]

Trong thí nghiệm này, methanol được dùng như là môi trường cho phản ứng xác định khả năng kháng oxy hóa bằng gốc tự do DPPH

c) Thời gian phản ứng

Gốc tự do DPPH phân hủy đáng kể sau 1h quét động học dung dịch DPPH trong methanol bằng phổ kế UV/Vis ở 515 nm Trong khi đó, dung dịch sẽ rất bền, còn hơn 99% sau 1h quét động học bằng phổ kế Vis cũng tại

515 nm Vì thế, đèn UV (đèn Deuterium) nên được tắt khi dùng để đo độ hấp thu của DPPH bằng máy UV/Vis [24] Có nhiều công trình nghiên cứu sử

16

dụng thời gian phản ứng khác nhau, dao động từ 5-10 phút, tuy nhiên thời gian tối ưu nhất thường được dùng cho phản ứng là 30 phút vì hầu hết các chất chống oxy hóa đối chứng thường dùng như: BHT, vitamin C, propyl gallate,… cần đến 30 phút để phản ứng làm sạch gốc tự do DPPH xảy ra hoàn toàn [23]

Vì thế, thời gian phản ứng 30 phút trong bóng tối được chọn cho thí nghiệm

d) Nồng độ DPPH thích hợp cho phản ứng

Nhiều công trình nghiên cứu sử dụng DPPH nồng độ khác nhau từ

22,5-250 M [23] Để xác định nồng độ DPPH thích hợp dùng cho phản ứng, dung dịch DPPH với các nồng độ khác nhau từ 0-100 g/mL (0-250 M) được pha bằng cách hút một lượng chính xác dung dịch DPPH rồi thêm methanol cho vừa đủ 1 mL Đo độ hấp thu tại 517 nm

Chuẩn bị dung dịch DPPH gốc: cân chính xác 5,00 mg DPPH rồi định

mức đến 5 mL bằng methanol thu được dung dịch DPPH gốc nồng độ 1000

g/mL được dùng cho các thí nghiệm kế tiếp Dung dịch DPPH gốc được trữ lạnh trong bóng tối và được pha mới mỗi ngày

3.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của vitamin C

Chuẩn bị dung dịch vitamin C gốc: cân chính xác 10,0 mg vitamin C rồi

định mức đến 10 mL bằng methanol Lắc đều đến khi tan hoàn toàn thu được dung dịch vitamin C nồng độ 1 mg/mL Dùng micropipet rút 1 mL dung dịch vừa pha cho vào bình rồi định mức đến 10 mL bằng methanol thu được dung dịch gốc vitamin C nồng độ 100 g/mL được dùng cho các thí nghiệm kế tiếp Phản ứng được thực hiện trong tuýp eppendorf 2 mL được bọc bằng giấy sẫm màu Nồng độ DPPH trong thử nghiệm được chọn là 40 g/mL (100

M) Nồng độ của chất thử vitamin C thay đổi từ 0-5 g/mL Phản ứng được hiện bằng cách hút chính xác một lượng dung dịch gốc của vitamin C và methanol cho vừa đủ 960 uL rồi lắc đều, thêm 40 mL dung dịch DPPH gốc Lắc đều rồi để phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng Sau 30 phút đo độ hấp thu tại bước sóng 517 nm [Hình 3.2] Dựng đường chuẩn, từ phương đường chuẩn

có được, ta sẽ tính được phần trăm ức chế, được biểu diễn bằng giá trị IC50

Hình 3.2: Quy trình thử hoạt tính kháng oxy hóa DPPH

17

Độ hấp thu tại 517 nm được đo trên máy Multiskan Spectrophotometer Thermotại phòng thí nghiệm Sinh học đất – Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng Dụng cụ sử dụng là khay nhựa, 96 giếng, đáy tròn với thể tích mỗi giếng là 300 L

3.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết

Chuẩn bị các dung dịch cao chiết gốc: cao chiết được trải mỏng trên đĩa

petri rồi để trong tủ hút ẩm ít nhất 24 h trước khi sử dụng Cân chính xác 100

mg cao chiết rồi định mức đến 10 mL thu được dung dịch cao chiết nồng độ

10 mg/mL Dùng micropipet rút chính xác 1 mL dung dịch vừa pha cho vào bình rồi định mức đến 10 mL bằng methanol thu được dung dịch cao chiết gốc nồng độ 1000 g/mL được dùng cho các thí nghiệm kế tiếp Thí nghiệm được thực hiện tương tự như [Hình 3.2] với nồng độ các cao chiết thay đổi từ 0-

1000 g/mL

3.3.4 Tính toán và biểu diễn kết quả

Khả năng khử gốc tự do DPPH của một cao chiết (hoặc chất chống oxy hóa) ở nồng độ xác định được biểu diễn thông qua phần trăm ức chế (I%) được tính theo công thức:

Phần trăm ức chế = x 100

Trong đó: Acontrol hay Ac là giá trị mật độ quang của dung dịch DPPH

Asample hay As là giá trị mật độ quang của dung dịch mẫu thử + DPPH

Ac luôn lớn hơn As Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của một chất bằng phương pháp DPPH được biểu diễn bằng giá trị IC50 (Half-Maximal Inhibitory Concentration)

IC50 được định nghĩa là nồng độ của chất mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc

tự do, tế bào hoặc enzyme IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp

Để xác định IC50, tiến hành khảo sát mẫu thử ở nhiều nồng độ khác nhau

và tính phần trăm ức chế của từng nồng độ Dựng đường chuẩn của phần trăm (y) theo nồng độ (x) rồi suy ra phương trình đường chuẩn dạng y = ax + b (với

a, b đã biết trước) Thay y = 50 vào phương trình suy ra được x cũng chính là giá trị IC50 của chất cần khảo sát

18

3.3.5 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa TLC­DPPH

Chuẩn bị các dung dịch: Dung dịch cao tổng được pha bằng cách cân

100 mg cao tổng pha thành 10 mL trong methanol thu được dung dịch 10 mg/mL Dung dịch vitamin C 1 mg/mL được pha bằng cách hòa tan 10,0 mg vitamin C trong 10 mL methanol Dung dịch DPPH 0,05% (0,5 mg/mL) được pha bằng cách cân chính xác 5,0 mg DPPH khan rồi pha thành 10 mL trong methanol Dung dịch DPPH sau khi sử dụng được trữ trong ngăn đá tủ lạnh để dùng cho lần kế tiếp

Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng sử dụng là loại bảng pha thường, kích

thước 2 x 6,5 cm Vạch xuất phát cách trái, phải mỗi cạnh 0,5 cm, cách cạnh dưới 1 cm Quãng đường giải ly là 5 cm tính từ vạch xuất phát

Quy trình: Đầu tiên, 10 L cao chiết 10 mg/mL (tương đương 100 g)

được quét thành một băng mỏng dài 1 cm trên bản mỏng Giải ly bản mỏng trong hệ dung môi thích hợp Bản mỏng sau khi giải ly được để khô 5 phút trong tủ hút rồi tiến hành nhúng bản mỏng trong dung dịch DPPH Dung dịch DPPH được thay mới sau mỗi lần nhúng Thấm khô bản mỏng bằng giấy rồi

để trong bóng tối 30 phút [17] Tiến hành ghi nhận kết quả, các thành phần kháng oxy hóa sẽ chuyển sang màu vàng sáng trên nền tím [Hình 3.3]

Hình 3.3: Quy trình thử nghiệm TLC-DPPH

3.4 Định tính thành phần hóa học của các cao chiết

Nhằm đánh giá sơ bộ thành phần hóa học của các cao chiết từ Bạch đầu ông, các phương pháp định tính các nhóm hợp chất tự nhiên đã được tiến hành Các nhóm hợp chất được đánh giá bao gồm: alkaloid, triterpene, flavonoid, tannin, glycoside, saponin, phenol [25] Mẫu thử được hòa tan trong methanol rồi tiến hành định tính bằng các thuốc thử