Khảo sát thành phần hóa học của cây Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill. var. atropurpureum (Bull.) Fosb., họ Ô rô (Acanthaceae)

MỞ ĐẦU Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đã và đang đóng góp những thành tựu quý báu cho ngành hoá học cũng như ngành sinh học và y dược học. Sự kết hợp những chứng cứ khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên và hoạt tính sinh học đã góp phần củng cố và phát triển các bài thuốc y học cổ truyền một cách thuyết phục nhất. Việt Nam có vị trí địa lý thuộc vùng nhiệt đới nóng ẩm, là điều kiện phát triển hệ thực vật phong phú và đa dạng. Đây cũng chính là lý do nền y học cổ truyền của nước ta phát triển mạnh. Với vai trò nhà nghiên cứu về hóa học các hợp chất thiên nhiên, chúng tôi mong muốn được đóng góp vào sự phát triển chung này. Từ những năm 1980, người dân truyền miệng nhau rằng “cây Hoàn ngọc hay còn gọi là cây Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk., trị bách bệnh”. Những tác dụng về dược lý của cây Xuân hoa trên các bệnh về gan, hệ tiêu hóa, tim mạch, ung thư, viêm loét, … [9] với những bài thuốc đơn giản mà hiệu nghiệm đã cuốn hút chúng tôi tìm hiểu về chi Pseuderanthemum. Gần đây, Wararut Buncharoen [57] đã công bố những nghiên cứu về khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch trích nước từ cây Xuân hoa, P. palatiferum. Kết quả nghiên cứu này cho thấy tiềm năng chữa bệnh Alzheimer của cây thuốc Xuân hoa. Sau khi tham khảo các tài liệu liên quan đến các loài cây thuộc chi Pseuderanthemum, chúng tôi nhận thấy rằng, trong số 10 loài cây thuộc chi Pseuderathemum hiện diện ở Việt Nam, chỉ có cây Xuân hoa, P. palatiferum, đang được quan tâm nghiên cứu sâu rộng về cả lĩnh vực hóa học lẫn lĩnh vực dược học, còn các cây khác chưa có tài liệu nào đề cập. Chúng tôi chọn cây Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill. var. atropurpureum (Bull.) Fosb., để khảo sát vì cây được sử dụng trong dân gian với đặc tính chữa lành vết thương, trị thương đòn tổn, [4] nhưng chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học. Nội dung chính được thực hiện trong luận án này là khảo sát thành phần hóa học của cây Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill. var. atropurpureum (Bull.) Fosb.. Bên cạnh đó, những thử nghiệm hoạt tính sinh học cũng được thực hiện trên các hợp chất tinh khiết cô lập được. Chúng tôi chọn thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase nhằm góp phần tìm kiếm hợp chất có tiềm năng chữa bệnh Alzheimer, do dịch trích nước từ cây P. palatiferum đã được nghiên cứu có khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase; ngoài ra, còn thực hiện thử nghiệm hoạt tính gây độc trên hai dòng tế bào ung thư vú MCF–7 và ung thư cổ tử cung HeLa, do cây P. palatiferum đang được sử dụng trong dân gian như cây thuốc để chữa một số bệnh ung thư và những thử nghiệm này nằm trong khả năng với điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam. Việc khảo sát thành phần hóa học của cây Xuân hoa đỏ, P. carruthersii var. atropurpureum góp phần làm sáng tỏ hóa – thực vật của chi Pseuderanthemum, hiện có rất ít thông tin. Những kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học góp phần nâng cao giá trị ứng dụng của đề tài.

Phản biện 3: PGS TS Trần Lê Quan

Phản biện độc lập 1: PGS TS Phạm Khánh Phong Lan

Phản biện độc lập 2: TS Trần Thượng Quảng

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS TS NGUYỄN NGỌC SƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc –––––oOo–––––

LỜI CAM ĐOAN

Luận án Tiến sĩ Hóa học “Khảo sát thành phần hóa học của cây Xuân hoa đỏ,

Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb., họ

Ô rô (Acanthaceae)” do tôi thực hiện một cách trung thực Những kết quả nghiên cứu trong luận án này chưa được các tác giả khác công bố ở Việt Nam cũng như trên thế giới Điều này đã được kiểm tra bằng cách tra cứu tài liệu tham khảo cung cấp bởi phần mềm Scifinder

Tôi xin cam đoan danh dự về công trình khoa học này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 08 năm 2011

Nghiên cứu sinh

Võ Thị Ngà

– iii –

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục ký hiệu hợp chất cô lập vi

Danh mục hình ảnh vii

Danh mục sơ đồ viii

Danh mục bảng biểu ix

Danh mục phụ lục xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT 3

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC HỌC 4

1.2.1 Kinh nghiệm dân gian sử dụng cây P palatiferum 4

1.2.2 Nghiên cứu in vitro về dược tính 6

1.2.3 Nghiên cứu in vivo về dược tính 7

1.2.4 Nhận xét về dược tính của cây P palatiferum 9

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC 9

1.3.1 Loài Eranthemum pulchellum 9

1.3.2 Loài Pseuderanthemum latifolium 9

1.3.3 Loài Pseuderanthemum palatiferum 10

1.3.4 Nhận xét về thành phần hóa học chi Pseuderanthemum 11

1.3.5 Đặc điểm hóa – thực vật họ Ô rô (Acanthaceae) 13

1 4 NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI VÀ ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU 16

1.4.1 Những vấn đề tồn tại 16

1.4.2 Định hướng nghiên cứu 16

2.1 TRÍCH LY VÀ CÔ LẬP HỢP CHẤT 18

2.1.1 Hóa chất và thiết bị 18

2.1.2 Nguyên liệu 19

2.1.3 Điều chế các loại cao 21

2.1.4 Cô lập các hợp chất hữu cơ 23

2.2 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC 31

2.2.1 Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 31

2.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC 37

3.1.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất nhóm terpenoid 37

3.1.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất nhóm lignan 58

3.1.3 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất nhóm flavonoid 76

3.1.4 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất nhóm phenylethanoid 91

3.1.5 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất có chứa nitrogen 111

3.1.6 Bàn luận 116

3.2 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC 125

3.2.1 Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 125

3.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào 126

3.2.3 Bàn luận 126

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 130

TÀI LIỆU THAM KHẢO 133

DANH MỤC CÔNG TRÌNH 141

PHỤ LỤC 143

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

HR–ESI–MS High Resolution ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

Trang

Hình 1.1 Cây Xuân hoa đỏ lá đỏ 4

Hình 1.2 Cây Xuân hoa đỏ lá xanh 4

Hình 1.3 Cấu trúc hợp chất béo và các dẫn xuất có trong chi Pseuderanthemum 11

Hình 1.4 Cấu trúc các hợp chất steroid có trong chi Pseuderanthemum 11

Hình 1.5 Cấu trúc các hợp chất terpenoid có trong chi Pseuderanthemum 12

Hình 1.6 Cấu trúc các hợp chất lignan có trong chi Pseuderanthemum 12

Hình 1.7 Cấu trúc các hợp chất flavonoid có trong chi Pseuderanthemum 13

Hình 1.8 Cấu trúc các hợp chất chứa nitrogen có trong chi Pseuderanthemum 13

Hình 1.9 Cấu trúc các hợp chất iridoid glucoside và các amine bậc bốn hiện diện

trong các loài thuộc họ Ô rô 14

Hình 2.1 Lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ 20

Hình 2.2 Rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh 20

Hình 2.3 Lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh 20

Hình 3.1 Một số tương quan HMBC và COSY trong XHĐ–L.MN2 39

Hình 3.2 Một số tương quan NOESY trong XHĐ–L.MN2 39

Hình 3.3 Một số tương quan HMBC trong XHX–R.C8 49

Hình 3.4 Một số tương quan NOESY trong XHX–R.C8 51

Hình 3.5 Độ dịch chuyển hóa học của C–23 và C–24 trong các hợp chất triterpene 51

Hình 3.6 Một số tương quan HMBC và COSY trong XHX–R.C12 71

Hình 3.7 Mối liên hệ giữa hóa học lập thể và độ dịch chuyển hóa học của các carbon C–7 và C–7’ trong lignan 72

Hình 3.8 Một số tương quan HMBC và COSY trong XHX–R.C13 75

Hình 3.9 Một số tương quan NOESY trong XHX–R.C13 76

Trang

Bảng 1.1 Các iridoid glucoside và amine bậc bốn trong các loài thuộc họ Ô rô 15

Bảng 2.1 Kết quả xác định độ ẩm nguyên liệu 21

Bảng 2.2 Khối lượng và thu suất của các loại cao của các nguyên liệu 22

Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate lá Xuân hoa đỏ lá đỏ 28

Bảng 2.4 Kết quả sắc ký cột cao methanolnước lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ 28

Bảng 2.5 Kết quả sắc ký cột cao chloroform rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh 29

Bảng 2.6 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh 29

Bảng 2.7 Kết quả sắc ký cột cao methanolnước rễ Xuân hoa đỏ lá xanh 30

Bảng 2.8 Kết quả sắc ký cột cao dichloromethane lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh 30

Bảng 2.9 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh 30

Bảng 2.10 Kết quả sắc ký cột cao methanol lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh 30

Bảng 2.11 Thang đánh giá mức độ tác động ức chế AChE .34

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN2 so sánh với 6–hydroxyantirrhide 40

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN1 so sánh với antirrhinoside 41

Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN3 so sánh với linarioside 44

Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C1 so sánh với squalene 45

Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C2 so sánh với oleanolic acid 47

Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C8 so sánh với stachlic A acid 50

Bảng 3.7 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C5 so sánh với lupeol 53

Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C3 so sánh với betulin 55

Bảng 3.9 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C6 so sánh với betulinic acid 57

Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C10 so sánh với (+)–episyringaresinol 59

Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C9 so sánh với (+)–syringaresinol 62

Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C4 so sánh với (+)–eudesmin 63

Bảng 3.13 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C7 so sánh với (+)–magnolin 65

Bảng 3.14 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C11 so sánh với (+)–1–hydroxysyringaresinol 68

Bảng 3.15 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.C12 70

– x –

Bảng 3.17 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.E3 so sánh với

luteolin 7–O––D–glucopyranoside 78

Bảng 3.18 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN9 so sánh với luteolin 7–O–rutinoside 80

Bảng 3.19 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN10 so sánh với apigenin 7–O–rutinoside 82

Bảng 3.20 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN11 so sánh với apigenin 6–C––L –arabinopyranosyl–8–C––L–arabinopyranoside 85

Bảng 3.21 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN12 so sánh với apigenin 6,8–di–C––L–arabinopyranoside 88

Bảng 3.22 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN13 so sánh với apigenin 6–C––D –xylopyranosyl–8–C––L–arabinopyranoside 90

Bảng 3.23 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN4 so sánh với salidroside 93

Bảng 3.24 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN5 so sánh với echipuroside A 94

Bảng 3.25 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN6 so sánh với darendoside B 96

Bảng 3.26 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN7 so sánh với verbascoside 99

Bảng 3.27 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN8 so sánh với isoverbascoside 101

Bảng 3.28 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.E1 so sánh với martynoside 104

Bảng 3.29 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.E2 so sánh với isomartynoside 106

Bảng 3.30 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–R.E2 so sánh với leucosceptoside A 108

Bảng 3.31 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.E1 so sánh với osmanthuside B 110

Bảng 3.32 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–L.D so sánh với indole 3–carboxaldehyde 112

Bảng 3.33 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–L.E1 so sánh với uracil 113

Bảng 3.34 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–L.E2 so sánh với adenine 115

Bảng 3.35 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHX–L.M so sánh với betaine 116

Bảng 3.36 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 128

Bảng 3.37 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên dòng ung thư vú MCF–7 và ung thư cổ tử cung HeLa 129

Việt Nam có vị trí địa lý thuộc vùng nhiệt đới nóng ẩm, là điều kiện phát triển

hệ thực vật phong phú và đa dạng Đây cũng chính là lý do nền y học cổ truyền của nước ta phát triển mạnh Với vai trò nhà nghiên cứu về hóa học các hợp chất thiên nhiên, chúng tôi mong muốn được đóng góp vào sự phát triển chung này

Từ những năm 1980, người dân truyền miệng nhau rằng “cây Hoàn ngọc hay

còn gọi là cây Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk., trị bách

bệnh” Những tác dụng về dược lý của cây Xuân hoa trên các bệnh về gan, hệ tiêu hóa, tim mạch, ung thư, viêm loét, …[9] với những bài thuốc đơn giản mà hiệu

nghiệm đã cuốn hút chúng tôi tìm hiểu về chi Pseuderanthemum

Gần đây, Wararut Buncharoen [57] đã công bố những nghiên cứu về khả năng

ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch trích nước từ cây Xuân hoa,

P palatiferum Kết quả nghiên cứu này cho thấy tiềm năng chữa bệnh Alzheimer

của cây thuốc Xuân hoa

Sau khi tham khảo các tài liệu liên quan đến các loài cây thuộc chi

Pseuderanthemum, chúng tôi nhận thấy rằng, trong số 10 loài cây thuộc chi Pseuderathemum hiện diện ở Việt Nam, chỉ có cây Xuân hoa, P palatiferum, đang

được quan tâm nghiên cứu sâu rộng về cả lĩnh vực hóa học lẫn lĩnh vực dược học, còn các cây khác chưa có tài liệu nào đề cập Chúng tôi chọn cây Xuân hoa đỏ,

Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb., để

khảo sát vì cây được sử dụng trong dân gian với đặc tính chữa lành vết thương, trị thương đòn tổn, [4] nhưng chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học

Nội dung chính được thực hiện trong luận án này là khảo sát thành phần hóa

-2-

atropurpureum (Bull.) Fosb Bên cạnh đó, những thử nghiệm hoạt tính sinh học

cũng được thực hiện trên các hợp chất tinh khiết cô lập được Chúng tôi chọn thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase nhằm góp phần tìm kiếm hợp

chất có tiềm năng chữa bệnh Alzheimer, do dịch trích nước từ cây P palatiferum đã

được nghiên cứu có khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase; ngoài ra, còn thực hiện thử nghiệm hoạt tính gây độc trên hai dòng tế bào ung thư vú MCF–7 và

ung thư cổ tử cung HeLa, do cây P palatiferum đang được sử dụng trong dân gian

như cây thuốc để chữa một số bệnh ung thư và những thử nghiệm này nằm trong khả năng với điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam

Việc khảo sát thành phần hóa học của cây Xuân hoa đỏ, P carruthersii var

atropurpureum góp phần làm sáng tỏ hóa – thực vật của chi Pseuderanthemum,

hiện có rất ít thông tin Những kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học góp phần nâng cao giá trị ứng dụng của đề tài

Tên khoa học: Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var

atropurpureum (Bull.) Fosb

Họ Ô rô (Acanthaceae)

Tên thông thường : Xuân hoa đỏ, Ô rô đỏ, Nhớt tím

Tiểu–mộc cao 1–2 m, phân nhánh nhiều, không lông Lá có phiến xoan bầu dục, mỏng, không lông, dài 7–10 cm, đỏ bầm có bớt đậm, đôi khi cũng thấy có màu vàng với bớt vàng đậm; cuống ngắn Chùm ở ngọn; hoa trắng tâm hường, tai có đốm đỏ; tiểu–nhụy 2, thò

Cây ưa ẩm, đòi hỏi đất nhiều phân Nhân giống bằng các chồi gốc vào mùa xuân Ra hoa tháng 4–5, có quả tháng 6–7

Cây Xuân hoa đỏ hiện đang được trồng làm cảnh ở nhiều nơi trong Thành phố

Hồ Chí Minh

Chúng tôi đã thu thập được 2 loài cây có cùng hình thái thực vật, nhưng có

màu sắc khác nhau, cùng được nhận danh là Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemum

carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb bởi nhà Thực vật học

TS Võ Văn Chi và TS Hoàng Việt, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh Chúng tôi tạm gọi hai cây này là Xuân hoa đỏ lá đỏ

và Xuân hoa đỏ lá xanh, hình ảnh của chúng lần lượt được trình bày trong Hình 1.1

và Hình 1.2

-4-

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC HỌC

Có rất ít thông tin về dược tính trên các loài thuộc chi Pseuderanthemum Chỉ

có ba loài có thông tin liên quan đến dược tính, đó là P carruthersii var

atropurpureum, P latifolium và P palatiferum Trong đó chỉ có P palatiferum đã

được khảo sát dược tính bằng các phương pháp khoa học hiện đại

P carruthersii var atropurpureum: các bộ phận lá, rễ và hoa được sử dụng

trong dân gian để trị lở miệng và làm lành vết thương [1],[4]

P latifolium: được người dân ở Vân Nam, Trung Quốc sử dụng như thảo dược

và là một loài có tiềm năng trong nhóm thực vật đang được một nhóm nghiên cứu ở Trung Quốc nghiên cứu sàng lọc khả năng chữa HIV [63]

P palatiferum: cây được phát hiện tại Việt Nam từ những năm 1980, đã được

sử dụng theo truyền miệng trong dân gian và đang được nghiên cứu Sau đây là

những thông tin chi tiết về dược tính của loài P palatiferum

1.2.1 Kinh nghiệm dân gian sử dụng cây P palatiferum

Năm 2005, bác sĩ Xuân Lục [9] đưa ra một số bài thuốc từ cây P palatiferum:

 Chữa các bệnh về đường tiêu hóa (đi lỏng, lỵ, rối loạn tiêu hóa, táo bón, đau bụng không rõ nguyên nhân): ăn từ 7–9 lá, khoảng 2–3 lần/ngày cho đến khi khỏi, có thể nấu canh nhạt để ăn

 Bệnh kèm theo chảy máu (chảy máu dạ dày, đường ruột, đái ra máu, phân ra máu kể cả đái buốt, đái rắt,…): ăn lá khi đói hoặc sắc nước lá đặc để uống, có thể nấu canh độ một bát nhỏ Ăn 1–5 lần, máu sẽ cầm; nên ăn ngày 2 lần

 Các bệnh ung thư thời kỳ phát bệnh: ăn lá xong, cơn đau giảm dần, người tỉnh táo, ăn ngủ tốt, có cảm giác như khỏi bệnh Thử nghiệm qua một số bệnh ung thư dạ dày, gan, phổi,… đều thấy có diễn biến tốt Lượng lá dùng thường xuyên theo mức độ đau, thông thường ngày 2 lần, mỗi lần 3–7 lá, tùy theo hiệu quả giảm đau

 Các bệnh u ở phổi, tiền liệt tuyến: liều dùng như trên, sau 1 tuần, các triệu chứng giảm hẳn, bệnh nhân ăn ngủ tốt Riêng u xơ tiền liệt tuyến, ăn vào cuối tháng, khoảng 3 tháng liên tục

 Các bệnh về gan (xơ gan cổ trướng, viêm gan,…): ăn lá tươi như trên ngày 2 lần khi đói Bột lá khô cùng với bột Tam thất theo tỉ lệ 1:1 là thuốc trị xơ gan

cổ trướng đặc hiệu

 Bệnh về thận (viêm thận cấp hoặc mãn, suy thận, các hiện tượng nước đái đục, đái ra máu): điều trị như trên sau 1 tuần Ăn 1 lần/ngày, nhưng nếu nước giải chỉ trong được nửa ngày thì tăng lên 2 lần/ngày Trong thời gian nửa tháng, các triệu chứng bệnh giảm rõ rệt

 Chữa viêm loét (loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, trĩ nội ngoại, trực tràng,…): ăn lá tươi khi đói (tốt nhất là vào buổi sáng) Với các vết thương thuộc phạm vi dạ dày, chỉ cần ăn trong 1 tuần, tránh uống rượu mạnh Khi chữa vết loét thuộc phần ruột, liều lượng cần nhiều hơn tùy theo nặng, nhẹ

 Điều chỉnh huyết áp, ổn định thần kinh: khi biến đổi huyết áp (cao hay thấp) theo liều lượng trên, ăn xong chợp mắt nghỉ trong thời gian ngắn, huyết áp sẽ trở lại bình thường; khi lên cơn rối loạn thần kinh thực vật, tùy theo mức độ để định liều lượng, có thể ăn vào buổi sáng giúp cơ thể ổn định trong ngày và đề phòng khi thời tiết thay đổi đột ngột

 Chữa về chấn thương (các loại chấn thương, đặc biệt chấn thương sọ não, va đập, gãy dập xương hay bắp thịt): lá thuốc có tác dụng cầm máu, khôi phục các mô cơ bị dập, kháng viêm nhiễm, lá làm cả thuốc đắp và thuốc uống Với vết thương kín, có thể nhai để đắp; vết thương hở, nên giã để đắp

-6-

 Chữa cảm cúm: nếu kéo theo rối loạn tiêu hóa, đau đầu, mệt mỏi, nhiệt độ cao, nên ăn lá cách 2 giờ, cơn sốt nhanh chóng hạ đồng thời rối loạn tiêu hóa cũng khỏi Sau cơn sốt, nên ăn cháo có lá thuốc trộn vào giúp cho người bệnh mau chóng trở lại bình thường

 Khôi phục sức khỏe: khi mệt mỏi toàn thân hoặc cần nâng cao sức chịu đựng cường độ cao, nên ăn như liều định 5–7 lá trước nửa giờ Trẻ con đi lỏng nên lấy từ 1–2 lá giã lấy nước cho uống

1.2.2 Nghiên cứu in vitro về dược tính

1.2.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Năm 1998, Trần Công Khánh và cộng sự [6] đã thử tác dụng kháng vi sinh vật

kiểm định (trong ống nghiệm) của cao đặc chiết từ lá cây P palatiferum, kết quả cho thấy cao đặc có tác dụng kháng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa), kháng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes), nấm mốc (Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Pyricularia oryzae, Rhezoctonia solanii), nấm men

(Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans)

Năm 2005, Phan Minh Giang và cộng sự [3] đã khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng

khuẩn và kháng nấm của cao ethyl acetate và n–butanol (ở nồng độ 10 mg/ml) từ lá cây P palatiferum, các kết quả cho thấy cả hai loại cao trích đều thể hiện khả năng kháng các chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus), Gram âm (Escherichia coli) và vi nấm (Candida albicans, Candida stellatoides), trong đó cao trích ethyl acetate có hoạt tính tốt hơn cao trích n–butanol Kết quả cũng cho thấy cao trích ethyl acetate kháng tốt các chủng Salmonella typhi 158 (đường kính vòng vô khuẩn là 21,0 mm), Shigella flexneri (21,5 mm) và

Escherichia coli (21,0 mm), đây là những vi khuẩn gây bệnh về đường ruột, tiêu

chảy, viêm ruột, lỵ

Năm 2007, Trần Công Khánh và cộng sự [7] đã công bố dịch chiết

n–hexane của rễ cây P palatiferum có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đối với

chủng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus với giá trị IC50 là 174,9 mg/ml

1.2.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa

Năm 2005, Phan Minh Giang và cộng sự [3] đã nghiên cứu hoạt tính kháng oxy

hóa của các loại cao ethyl acetate và n–butanol từ lá cây P palatiferum bằng

phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các loại cao này lên độ hoạt động của

enzyme peroxydase trong máu Kết quả cho thấy cả hai loại cao ethyl acetate và n–

butanol từ lá cây đều có tác dụng kháng oxy hóa

1.2.3 Nghiên cứu in vivo về dược tính

1.2.3.1 Thử độc tính trên động vật thử nghiệm

Năm 1999, Lê Thị Lan Oanh và cộng sự [10] đã khảo sát độ độc của dịch chiết

lá P palatiferum trên cá chọi Kết quả cho thấy dịch chiết lá không độc với cá chọi

vì với nồng độ 50% cá vẫn không chết sau 5 ngày

Kết quả kiểm nghiệm độc tính của lá khô cây P palatiferum cũng đã được

thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế, áp dụng trên thỏ và chuột thí nghiệm, cho thấy không có độc tính.[10]

Năm 1999, Nguyễn Thị Minh Thu và các cộng sự [11] đã thử độc tính cấp diễn

của cây P palatiferum theo phương pháp của Behrens trên chuột nhắt trắng

Phương pháp được tiến hành với các nồng độ thuốc khác nhau, liên tục theo dõi diễn tiến hành vi của chuột từ khi đưa thuốc trực tiếp vào dạ dày Kết quả cao đặc toàn phần lá cây không gây độc tính cấp diễn trên chuột, không có giá trị LD50, chuột sống hoàn toàn khỏe mạnh qua 48 giờ

Năm 2009, Peerawit Padee và cộng sự [42] đã thử nghiệm độc tính của cao trích

ethanol 80% lá cây P palatiferum cả in vitro lẫn in vivo Kết quả thử nghiệm in

vitro trên tế bào thận khỉ xanh châu Phi bằng phương pháp GFP (green fluorescent

protein) cho thấy mẫu thử không độc ở nồng độ 50 g/ml, liều cao nhất có thể pha

được Với thử nghiệm in vivo, thử nghiệm với cao trích ethanol 80% được thực hiện

trên chuột trưởng thành qua đường uống, với một liều duy nhất ở các nồng độ khác nhau, 500, 1.000, 1.500, và 2.000 mg mẫu cao trích/kg trọng lượng chuột Kết quả cho thấy chuột không có dấu hiệu ngộ độc trong 24 giờ đầu và không chết qua 14 ngày thử nghiệm; không có sự khác biệt về thể trọng giữa nhóm chuột thử nghiệm

-8-

và nhóm chuột đối chứng Với thử nghiệm in vivo trên chuột qua đường uống, mỗi

ngày, trong 14 ngày, ở các nồng độ khác nhau, 250, 500, 1.000 mg mẫu cao trích/kg trọng lượng chuột, không có liều nào gây độc cho chuột Các trị số hóa lý như creatinine, triglyceride, cholesterol tổng, protein tổng và albumin không có sự khác biệt giữa nhóm chuột thử nghiệm và nhóm chuột đối chứng

1.2.3.2 Tác dụng bảo vệ tế bào gan

Năm 1999, Nguyễn Thị Minh Thu [11] đã thử tác dụng bảo vệ tế bào gan của

cao đặc toàn phần lá cây P palatiferum trên chuột nhắt trắng Mô hình gây ngộ độc

gan bằng tetrachloromethane Kết quả như sau: ở liều gây độc gan 1,0 ml CCl4/kg thể trọng, chưa thấy có dấu hiệu bình phục của tế bào gan Ở liều gây độc 0,5 ml CCl4/kg thể trọng, hàm lượng men gan có giảm nhưng chưa đáng kể, có dấu hiệu bình phục của tế bào gan

1.2.3.3 Tác dụng trị tiêu chảy

Năm 2006, Dieu HK và cộng sự [18] đã xác định hiệu quả của bột lá P

palatiferum trong trị bệnh tiêu chảy heo con theo mẹ, so sánh với hai chế phẩm

Coli–norgent (với thành phần gồm colistine sulfate, norfloxacin, gentamicin sulfate

và trimethoprim) và Cotrimxazol (với thành phần gồm trimethoprim và sulfamethoxazol) Kết quả sau 3 ngày điều trị cho thấy bột lá khô (tỉ lệ khỏi bệnh / tỉ

lệ tái phát: 92,86% / 7,14%) có tỉ lệ khỏi bệnh cao hơn và tỉ lệ tái phát thấp hơn so với kháng sinh Coli–norgent (90,48% / 9,52%) và Cotrimxazol (83,33% / 14,29%)

1.2.3.4 Hiệu quả ức chế enzyme acetylcholinesterase

Năm 2010, Wararut Buncharoen và cộng sự [57] đã xác định hiệu quả ức chế

enzyme acetylcholinesterase của dịch trích nước lá cây P palatiferum trên chuột

bạch Chuột bạch đực được cho uống dịch trích nước lá cây ở các liều 0,3; 0,7 và 1,0 g/kg thể trọng trong 30 ngày Hiệu quả ức chế enzyme acetylcholinesterase được đánh giá dựa trên tế bào máu đỏ, huyết thanh và não chuột Kết quả cho thấy dịch trích có thể làm giảm sự tổng hợp enzyme acetylcholinesterase trong não

chuột Hiệu quả ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch trích nước lá cây P

palatiferum đã cho thấy tiềm năng chữa bệnh Alzheimer của cây thuốc này

1.2.4 Nhận xét về dược tính của cây P palatiferum

Những kết quả nghiên cứu về dược lý một cách khoa học cho thấy, cây Xuân

hoa, P palatiferum, không có độc tính và có một số tác dụng dược lý sau đây Những thử nghiệm in vitro cho biết dịch trích từ cây P palatiferum có tác dụng

kháng một số dòng vi khuẩn gây bệnh liên quan đến đường tiêu hóa, kháng một số

chủng nấm men, nấm mốc và tác dụng kháng oxy hóa Những thử nghiệm in vivo cho thấy dịch trích từ cây P palatiferum không có độc tính, có tác dụng bảo vệ tế

bào gan, trị tiêu chảy Đặc biệt, khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase của

dịch trích nước lá cây P palatiferum đã mở ra tiềm năng chữa bệnh Alzheimer của

cây thuốc này

Như vậy, qua các nghiên cứu in vitro về tính kháng khuẩn và kháng nấm của các cao trích từ cây P palatiferum phần nào đã phần nào giải thích được khả năng

chữa các bệnh về đường tiêu hóa của cây Xuân hoa thường được sử dụng trong dân

gian Các nghiên cứu in vivo về hoạt tính trị tiêu chảy đã góp phần khẳng định công

dụng chữa bệnh đường tiêu hóa của cây thuốc này

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC

Về những nghiên cứu hóa học trên chi Pseuderanthemum, chỉ mới có những tài liệu nghiên cứu công bố trên ba loài Eranthemum pulchellum, P latifolium và P

palatiferum

1.3.1 Loài Eranthemum pulchellum

Năm 1987, Henrik Fischer W Jensen và cộng sự [22] đã cô lập được từ cuống

hoa của cây Eranthemum pulchellum một hợp chất iridoid glucoside là

eranthemoside (15) và một amine bậc bốn là betaine (33)

1.3.2 Loài Pseuderanthemum latifolium

Năm 2006, Zhu Xiang–dong và cộng sự [63] đã cô lập từ phần trên mặt đất của

cây P latifolium một số hợp chất steroid bao gồm stigmasterol (9), stigmasterol 3–

O––D–glucopyranoside (10), sitoindoside I (12); một hợp chất iridoid glucoside là antirrhinoside (14); ba hợp chất flavonoid là 7,4’–dihydroxyflavone (28), 5,4’–

-10-

dihydroxy–7–methoxyflavone (29) và 5,6–dihydroxy–7,8,3’,4’–tetramethoxy

–flavone (30); một hợp chất chứa nitrogen là allantoin (34)

1.3.3 Loài Pseuderanthemum palatiferum

Năm 2000, Nguyễn Thị Minh Thu và cộng sự [12] đã cô lập được các hợp chất

phytol (16), –sitosterol (7), hỗn hợp hai đồng phân stigmasterol (9) và

poriferasterol (11) và –sitosterol 3–O––D–glucopyranoside (8) từ lá cây

P palatiferum

Năm 2003, Phan Minh Giang và cộng sự [2] đã cô lập từ lá khô cây

P palatiferum hợp chất 1–pentacosanol (2), palmitic acid (4), –sitosterol (7),

stigmasterol (9), hỗn hợp –sitosterol 3–O––D–glucopyranoside (8) và

stigmasterol 3–O––D–glucopyranoside (10), hỗn hợp kaempferol 3–methoxy–7–

O––D–glucopyranoside (31) và apigenin 7–O––D–glucopyranoside (32)

Năm 2004, Nguyễn Văn Hùng và cộng sự [5] đã cô lập từ lá cây P palatiferum

các hợp chất 1–triacontanol (3), hexadecanoate glycerol (5), salicylic acid (6) và palmitic acid (4)

Năm 2005, Mai Đình Trị và các cộng sự [13] đã cô lập được các hợp chất từ lá

cây P palatiferum bao gồm: –amyrin (18), oleanolic acid (19), –sitosterol (7), stigmasterol (9), hỗn hợp –sitosterol 3–O––D–glucopyranoside (8) và

stigmasterol 3–O––D–glucopyranoside (10)

Năm 2007, Trần Kim Thu Liễu [8] đã cô lập từ lá cây P palatiferum các hợp

chất squalene (17), dotriacontane (1), phytol (16), palmitic acid (4), –sitosterol (7),

stigmasterol (9), hỗn hợp –sitosterol 3–O––D–glucopyranoside (8) và

stigmasterol 3–O––D–glucopyranoside (10), 24–methylenecycloartanol (25) và loliolide (13)

Năm 2007, Trần Công Khánh và cộng sự [7] đã cô lập từ rễ cây P palatiferum

được bốn hợp chất triterpenoid là lupeol (22), lupenone (24), betulin (23), pomolic acid (21); một acid béo là palmitic acid (4) và một dipeptide là asperglaucide (35)

Năm 2011, Mai HD và các cộng sự [37] đã cô lập từ rễ cây P palatiferum hai

hợp chất lignan là palatiferin A (26) và palatiferin B (27) Ngoài ra, còn có năm triterpene, bao gồm epifriedelanol (20), lupeol (22), betulin (23), lupenone (24) và pomolic acid (21); và một dipeptide là asperglaucide (35)

1.3.4 Nhận xét về thành phần hóa học chi Pseuderanthemum

Qua việc phân tích các tài liệu tham khảo về thành phần hóa học của các cây

thuộc chi Pseuderanthemum, chúng tôi nhận thấy rằng chi này có chứa những nhóm

hợp chất như chất béo (Hình 1.3), steroid (Hình 1.4), terpenoid (Hình 1.5), lignan (Hình 1.6), flavonoid (Hình 1.7) và một vài hợp chất có chứa nitrogen (Hình 1.8)

Hình 1.3 Cấu trúc hợp chất béo và các dẫn xuất có trong chi Pseuderanthemum

OH O HO

Antirrhinoside (14)

O OGlc

Eranthemoside (15)

HO HO

Hình 1.5 Cấu trúc các hợp chất terpenoid có trong chi Pseuderanthemum

Hình 1.6 Cấu trúc các hợp chất lignan có trong chi Pseuderanthemum

Hình 1.7 Cấu trúc các hợp chất flavonoid có trong chi Pseuderanthemum

Hình 1.8 Cấu trúc các hợp chất chứa nitrogen có trong chi Pseuderanthemum

1.3.5 Đặc điểm hóa–thực vật họ Ô rô (Acanthaceae)

Năm 1988, Henrik Fischer W Jensen [23] đã dựa trên các kết quả nghiên cứu

về hóa học của 40 loài thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) để phân loại hóa học của họ này Kết quả nghiên cứu đã đưa ra hai điểm đặc trưng của họ Ô rô như sau:

Có chứa các hợp chất iridoid glucoside Trong số 40 loài được khảo sát thì 14

loài có chứa iridoid glucoside Trong số 20 hợp chất iridoid glucoside được cô lập

từ họ này, có 7 hợp chất iridoid glucoside chỉ hiện diện trong họ này, bao gồm 6–

O–acetylshanzhiside methyl ester (41), 6,8–di–O–acetylshanzhiside methyl ester (43), 8(S)–7,8–hydroaucubin (45), eranthemoside (15), hygrophiloside (50), 6–epi–

stilbericoside (53) và thunbergioside (54)

-14-

Có chứa các hợp chất amine bậc bốn Trong đó, betaine (33) là hợp chất tiêu

biểu đã được tìm thấy với lượng lớn trong 31 loài Kế đến là trigonelline (55) cũng

được tìm thấy trong 14 loài

Các iridoid glucoside và amine bậc bốn hiện diện trong họ Ô rô (Acanthaceae) được trình bày trong Bảng 1.1 và cấu trúc của chúng được trình bày trong Hình 1.9

Hình 1.9 Cấu trúc các hợp chất iridoid glucoside và các amine bậc bốn hiện diện trong

các loài thuộc họ Ô rô (Acanthaceae)

Ghi chú: * Bảy iridoid glucoside chỉ hiện diện trong họ Ô rô

Bảng 1.1 Các iridoid glucoside và amine bậc bốn trong các loài thuộc họ Ô rô[22]

Phân loại các loài thuộc họ Ô rô Iridoid glucoside Amine bậc bốn

Subfamily I Thunbergioideae

Thunbergia alata Sims

fragrans Roxb

grandiflora (Rottl.) Roxb

mysorensis (Wight) T Anders

Subfamily II Mendocioideae

Mendoncia cociinea Vellozo

Subfamily III Nelsonioideae

Nelsonia canescens (Lam.) Spreng

Elytraria virgata Michaux

Staurogyne lasiobotrys (Nees) O Ktze

Subfamily IV Acanthoideae

Acanthus montanus (Nees) T Anders

Crossandra nilotica Oliver

Subfamily V Ruellioideae

Tribe A Ruellieae

Brillantaisia lamium Benth

Eranthemum pulchellum Andrews

Hygrophila difformis (L.f.) Blume

polysperma (Roxb.) T Anders

Phaulopsis imbricata (Forssk.) Sweet

Ruellia dipteracanthus Hemsl

graecizans Backer

portellae Hook.f

rosea Mart

tweedieana Griseb

Sanchezia nobilis Hook.f

Strobilanthes dyeriana Mast

isophylla (Nees) T Anders

Tribe C Andrographideae

Andrographis laxiflora (Bl.) Lindau

Tribe D Justicieae

Subtribe a Barleriinae

Asystasia bella (Harv.) Benth.& Hook.f

Barleria strigosa Willd

lupulina Lindl

prionitis L

Chamaeranthemum gaudichaudii Nees

Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill

Schaueria calycotricha (Link&Otto) Nees

Jacobinia mohintli (Nees) Benth & Hook.f

pauciflora Benth & Hook.f

(40), (47)

(15) (50) (36), (49) (45)

(51)

(37), (38), (39), (46) (40), (41), (42), (43), (44) (40), (42), (43) (48)

(55) (55) (55) (55) (55)

(33), (55) (33), (55)

(33) (33), (55) (33) (33) (33) (33) (33) (33) (33) (33) (33) (33) (33) (33)

(33) (33) (33) (33) (33) (33) (33) (33) (33), (55) (33), (55) (33), (55) (33), (55) (33), (55) (33) (33) (33), (55)

-16-

1.4 NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI VÀ ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU

1.4.1 Những vấn đề tồn tại

Từ những thông tin về thành phần hóa học của ba cây thuộc chi

Pseuderanthemum đã được công bố, liên hệ với phân loại hóa – thực vật họ Ô rô

(Acanthaceae) chúng tôi nhận thấy:

Về đặc trưng có chứa các hợp chất iridoid glucoside: từ hai cây Eranthemum

pulchellum ở Đan Mạch và P latifolium ở Trung Quốc đã có hai hợp chất iridoid

glucoside được cô lập là eranthemoside (15) và antirrhinoside (14) Riêng cây P

palatiferum ở Việt Nam, chưa có tài liệu nào công bố đến việc cô lập iridoid

glucoside

Về đặc trưng có chứa các hợp chất amine bậc bốn: từ cây Eranthemum

pulchellum ở Đan Mạch đã cô lập được một hợp chất amine bậc bốn là betaine (33)

Với hai cây còn lại, P latifolium ở Trung Quốc và cây P palatiferum ở Việt Nam

đã phát hiện một số hợp chất có chứa nitrogen nhưng chưa tìm thấy sự hiện diện của hợp chất amine bậc bốn

1.4.2 Định hướng nghiên cứu

Từ những nhận định vừa trình bày trên, vấn đề được đặt ra là, tại sao chưa tìm

thấy các hợp chất iridoid glucoside và amine bậc bốn ở cây P palatiferum mọc ở

Việt Nam? Đây là những hợp chất phân cực mạnh, trong quá trình trích ly sẽ hiện diện ở các phân đoạn có độ phân cực mạnh như trong cao methanol hoặc cao nước

Trong khi đó, các công trình nghiên cứu trên cây P palatiferum, đã công bố, chủ

yếu tập trung nghiên cứu ở các phân đoạn phân cực kém và phân cực trung bình

Từ nhận định trên, chúng tôi đưa ra định hướng khảo sát thành phần hóa học

của cây P carruthersii var atropurureum ở các phân đoạn từ phân cực trung bình

đến phân cực mạnh, đặc biệt ở cao methanol–nước, với hy vọng cô lập được các hợp chất đặc trưng của họ Ô rô (Acanthaceae)

Về mặt thử nghiệm hoạt tính sinh học, những thử nghiệm hiệu quả ức chế

enzyme acetylcholinesterase của cây P palatiferum đã được công bố, chỉ mới thực

hiện trên dịch trích nước, đã cho thấy tiềm năng chữa bệnh Alzheimer của cây thuốc

này Do đó, trong định hướng thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase, chúng tôi sẽ thực hiện trên những hợp chất tinh khiết cô lập từ

cây P carruthersii var atropurpureum, đặc biệt là những hợp chất cô lập từ các

phân đoạn phân cực như cao methanol–nước

Bên cạnh đó, các thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư đối với các hợp chất tinh khiết cô lập, cũng được dự kiến thực hiện Vì đây

là những thử nghiệm mà chúng tôi có thể chọn lựa trong điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam

 Thuốc thử hiện hình vết trên sắc ký lớp mỏng: H2SO4 30%, sấy nóng;

 Sắc ký lớp mỏng pha thường: TLC Silica gel 60 F254 (250 m, MERCK);

 Sắc ký lớp mỏng pha đảo: TLC Silica gel 60 RP18 F254 S (200 m, MERCK);

 Sắc ký cột pha thường: Silica gel 60 (0,0400,063 mm, HIMEDIA);

 Sắc ký cột pha đảo: Li Chroprep RP18 (0,0400,063 mm, MERCK);

 Sắc ký trao đổi ion: Diaion HP20 (MITSUBISHI);

 Sắc ký lọc gel: Sephadex LH20 (GE HEALTHCARE)

 Máy đông cô chân không (CHAIST, Alpha 12ld plus);

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (SHIMADZU LC 8A), cột SupelCoC18,

250 x 21,2 mm (10 m), đầu dò UVSPD20A;

 Máy đo nhiệt độ nóng chảy (BUCHI B540);(c)

 Máy đo phổ hồng ngoại–ép mẫu trong KBr (Vector22 BRUKER);(c)

 Máy cộng hưởng từ hạt nhân (BRUKER AVANCE) với tần số 500 MHz cho phổ 1HNMR và 125 MHz cho phổ 13CNMR;(a), (b)

 Máy cộng hưởng từ hạt nhân (BRUKER AVANCE) với tần số 400 MHz cho phổ proton, 100 MHz cho phổ 13CNMR;(c)

 Máy đo khối phổ HRESIMS (microOTOF–Q 10187);(a)

 Máy đo khối phổ APCIMS (LCMSDTrapSL);(b)

 Máy đo khối phổ CIMS (FINNIGAN MAT SSQ7000);(c)

 Máy đo năng lực triền quang P8100T (KRUSS)

(a)

Thực hiện tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

(b)

Thực hiện tại Phòng Phân tích Cấu trúc Hóa học, Viện Hóa học, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội

Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh, có tên khoa học là Pseuderanthemum

carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb., họ Ô rô

(Acanthaceae)

Mẫu khô của hai cây được lưu giữ trong quyển lưu giữ tiêu bản thực vật, ký hiệu mẫu USA007 cho cây Xuân hoa đỏ lá đỏ và ký hiệu mẫu USA008 cho cây Xuân hoa đỏ lá xanh, đặt tại Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2.2 Thu hái mẫu

Lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ (Hình 2.1) được thu hái tại xã Tân Phước, huyện Đồng Phú, tỉnh Bình Phước, vào tháng 6 năm 2008 Cây được trồng tại vườn nhà

Hình 2.1 Lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ

Hình 2.2 Rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh Hình 2.3 Lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh

2.1.2.3 Xác định độ ẩm nguyên liệu

Độ ẩm của nguyên liệu khô được xác định trực tiếp bằng máy phân tích độ ẩm với nguồn nhiệt là đèn halogen Lượng mẫu cho mỗi thí nghiệm là 5g Kết quả xác định độ ẩm của các nguyên liệu được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Kết quả xác định độ ẩm nguyên liệu

Nguyên liệu Xuân hoa đỏ lá đỏ Xuân hoa đỏ lá xanh

2.1.3 Điều chế các loại cao

2.1.3.1 Điều chế các loại cao từ lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ

Bột khô lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ (5 kg) được trích kiệt bằng phương pháp ngâm dầm với methanol ở nhiệt độ phòng (2 ngày/lần x 10 lần) Dịch trích được thu hồi dung môi ở áp suất kém để thu được cao trích thô methanol (ĐL, 800 g) Phần cao thô methanol được hòa tan với một lượng nhỏ nước để tạo dịch sệt Phần dịch sệt này khi để qua đêm trong tủ lạnh có kết tủa lắng xuống Phần kết tủa được lọc và rửa bằng methanol, thu được muối vô cơ có dạng tinh thể hình phiến (50 g) Phần dịch lọc được loại béo bằng cách trích với petroleum ether rồi đến ethyl acetate bằng phương pháp trích lỏnglỏng Các phần dịch trích này được thu hồi dung môi

ở áp suất kém, thu được các loại cao tương ứng, cao petroleum ether (ĐL.P, 170 g)

và cao ethyl acetate (ĐL.E, 17 g) Dịch nước được tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau bằng cách cho qua cột Diaion HP20, với các dung môi giải ly lần lượt là nước, hỗn hợp methanol : nước (1:1) và methanol Các phân đoạn này được thu hồi dung môi ở áp suất kém, thu được các loại cao tương ứng, cao nước (ĐL.N, 350 g), cao methanolnước (ĐL.MN, 30 g) và cao methanol (ĐL.M, 6 g) Quy trình điều chế các loại cao được trình bày trong Sơ đồ 2.1 Khối lượng và thu suất các loại cao tính trên khối lượng nguyên liệu khô ban đầu được trình bày trong Bảng 2.2

-22-

Bảng 2.2 Khối lượng và thu suất của các loại cao của các nguyên liệu

Xuân hoa đỏ lá đỏ Xuân hoa đỏ lá xanh

Loại cao Khối

lượng (g)

Thu suất (%)

Khối lượng (g)

Thu suất (%)

Khối lượng (g)

Thu suất (%)

Nguyên liệu khô ban đầu 5.000 – 5.000 – 1.000 – Cao petroleum ether 170 3,40 – – 17 1,70

Cao ethyl acetate 17 0,34 20 0,40 7 0,70 Cao methanol 6 0,12 12 0,24 100 10,00 Cao methanolnước 30 0,60 20 0,40 – –

Muối vô cơ 50 1,00 40 0,80 15,5 1,55

2.1.3.2 Điều chế các loại cao từ rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh

Bột khô rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh (5 kg) được trích kiệt bằng phương pháp ngâm dầm với ethanol ở nhiệt độ phòng (2 ngày/lần x 10 lần) Dịch trích được thu hồi dung môi ở áp suất kém để thu được cao trích thô ethanol (XR, 400 g) Phần cao thô ethanol được hòa tan với một lượng nhỏ nước để tạo dịch sệt Phần dịch sệt này khi để qua đêm trong tủ lạnh có kết tủa lắng xuống Phần kết tủa được lọc và rửa bằng methanol, thu được muối vô cơ có dạng tinh thể hình phiến (40 g) Phần dịch lọc được trích lỏnglỏng với chloroform rồi đến ethyl acetate Các phần dịch trích này được thu hồi dung môi ở áp suất kém thu được các loại cao tương ứng, cao chloroform (XR.C, 120 g) và cao ethyl acetate (XR.E, 20 g) Lớp nước được tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau bằng cách cho qua cột Diaion HP20, với các dung môi giải ly lần lượt là nước, hỗn hợp methanol : nước (1:1) và methanol Các phân đoạn này được thu hồi dung môi ở áp suất kém thu được các

loại cao tương ứng, cao nước (XR.N, 60 g), cao methanolnước (XR.MN, 20 g) và cao methanol (XR.M, 12 g)

Quy trình điều chế các loại cao được trình bày trong Sơ đồ 2.2 Khối lượng và thu suất các loại cao tính trên khối lượng nguyên liệu khô ban đầu được trình bày trong Bảng 2.2

2.1.3.3 Điều chế các loại cao từ lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh

Bột khô lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh (1 kg) được trích kiệt bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng lần lượt với các dung môi petroleum ether, dichloromethane, ethyl acetate và methanol (2 ngày/lần x 7 lần) Các phần dịch trích này được thu hồi dung môi ở áp suất kém thu được các loại cao tương ứng, cao petroleum ether (XL.P, 17 g), cao dichloromethane (XL.D, 22 g) và cao ethyl acetate (XL.E, 7 g) Riêng phần dịch trích methanol sau khi thu hồi một phần dung môi để có được dung dịch sệt, để trong qua đêm tủ lạnh, có kết tủa lắng xuống Phần kết tủa được lọc và rửa bằng methanol, thu được muối vô cơ có dạng tinh thể hình phiến (40 g) Dịch lọc được thu hồi dung môi ở áp suất kém, thu được cao methanol (XL.M, 100 g)

Quy trình điều chế các loại cao được trình bày trong Sơ đồ 2.3 Khối lượng và thu suất các loại cao tính trên khối lượng nguyên liệu khô ban đầu được trình bày trong Bảng 2.2

2.1.4 Cô lập các hợp chất hữu cơ

Áp dụng các phương pháp sắc ký cột pha thường hoặc pha đảo trên các cao thu được để tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau Tiếp tục sử dụng các phương pháp sắc ký trên các phân đoạn thu được, như sắc ký cột silica gel pha thường hoặc pha đảo, sắc ký lọc gel, sắc ký lớp mỏng điều chế Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, hiện vết bằng dung dịch H2SO4 30%

và sấy nóng, kết hợp soi đèn UV Đối với những phân đoạn khó tách, áp dụng phương pháp sắc ký hiện đại như kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với cột SupelCoC18 và đầu dò UV

-24-

2.1.4.1 Cô lập các hợp chất hữu cơ từ lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ

Từ cao ethyl acetate (ĐL.E, 17 g) và cao methanolnước (ĐL.MN, 30 g) của

lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ đã cô lập được 16 hợp chất có ký hiệu XHĐL.E1, XHĐL.E2, XHĐL.E3 (từ cao ethyl acetate); XHĐL.MN1, XHĐL.MN2, XHĐL.MN3, XHĐL.MN4, XHĐL.MN5, XHĐL.MN6, XHĐL.MN7, XHĐL.MN8, XHĐL.MN9, XHĐL.MN10, XHĐL.MN11, XHĐL.MN12, XHĐL.MN13 (từ cao methanolnước)

Các kết quả được trình bày trong Sơ đồ 2.1 và các Bảng 2.3 và 2.4, với các giá trị thu suất được tính trên khối lượng nguyên liệu khô ban đầu

2.1.4.2 Cô lập các hợp chất hữu cơ từ rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh

Từ cao chloroform (XR.C, 120 g), cao ethyl acetate (XR.E, 20 g) và cao methanolnước (XR.MN, 20 g) của rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh đã cô lập được 18 hợp chất có ký hiệu XHXR.C1, XHXR.C2, XHXR.C3, XHXR.C4, XHXR.C5, XHXR.C6, XHXR.C7, XHXR.C8, XHXR.C9, XHXR.C10, XHXR.C11, XHXR.C12, XHXR.C13 (từ cao chloroform); XHXR.E1, XHXR.E2 (từ cao ethyl acetate); XHXR.MN1, XHXR.MN2, XHXR.MN3 (từ cao methanolnước)

Các kết quả được trình bày trong Sơ đồ 2.2 và các Bảng 2.5, 2.6 và 2.7, với các giá trị thu suất được tính trên khối lượng nguyên liệu khô ban đầu

2.1.4.3 Cô lập các hợp chất hữu cơ từ lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh

Từ cao dichloromethane (XL.D, 22 g), cao ethyl acetate (XL.E, 7 g) và cao methanol (XL.M, 100 g) của lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh đã cô lập được 4 hợp chất

có ký hiệu XHXL.D (từ cao dichloromethane); XHXL.E1, XHXL.E2 (từ cao ethyl acetate); XHXL.M (từ cao methanol)

Các kết quả được trình bày trong Sơ đồ 2.3 và các Bảng 2.8, 2.9 và 2.10, với các giá trị thu suất được tính trên khối lượng nguyên liệu khô ban đầu

Cao petroleum, ether (ĐL.P, 170 g)

Cao nước (ĐL.N, 350 g)

Pđ ĐL.MN.2 (394 mg)

XHĐ-L.MN2 (10 mg) (0,00020%)

Pđ ĐL.E.4

(760 mg)

SKC, EA:M:N (16:1:1)

SKC, C:M

Muối vô cơ (50 g)

Cao methanol (ĐL.M, 6 g)

XHĐ-L.E2 (15 mg) (0,00030%)

XHĐ-L.E1

(12 mg)

(0,00024%)

Pđ ĐL.MN.4 (5,33 g)

Pđ ĐL.MN.6 (6,75 g)

XHĐ-L.MN1 (21 mg) (0,00042%)

XHĐ-L.MN3 (327 mg) (0,00654%)

XHĐ-L.MN4 (51 mg) (0,00102%)

XHĐ-L.MN9 (270 mg) (0,00540%)

XHĐ-L.MN10 (280 mg) (0,00560%)

XHĐ-L.MN8 (38 mg) (0,00076%)

XHĐ-L.MN7 (42 mg) (0,00084%)

Pđ ĐL.MN.6.1 (3,75 g)

Pđ ĐL.MN.6.2 (169 mg)

XHĐ-L.MN12 (7 mg) (0,00014%)

XHĐ-L.MN13 (5 mg) (0,00010%)

XHĐ-L.MN11 (9 mg) (0,00018%)

SKC, EA:M:N (30:1:1)

SKC RP-18, M:N

SKC, C:M:N (20:6:1)

SKC, EA:M:N (8:1:1)

SKC, C:M:N (20:6:1)

Pđ ĐL.E.6 (1,74 g)

SKC, C:M:N (80:19:1)

XHĐ-L.E3 (30 mg) (0,00060%)

SKC, EA:M:N (8:1:1)

Pđ ĐL.MN.5 (3,35 g)

XHĐ-L.MN5 (15 mg) (0,00030%)

XHĐ-L.MN6 (35 mg) (0,00070%)

Kết tủa

Qua cột Diaion HP20

Ghi chú: C: chloroform, EA: ethyl acetate, M: methanol, N: nước

(…%): thu suất so với khối lượng nguyên liệu khô ban đầu

HPLC, M:N (3:7)

M

Pseuderanthemum carruthersii var atropurpureum CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

Cao chloroform (XR.C, 120 g)

Cao methanol–nước (XR.MN, 20g)

Cao nước (XR.N, 60 g)

Trích kiệt với ethanol bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phịng

Tách phân đoạn bằng phương pháp trích lỏng-lỏng với chloroform

Pđ XR.C.5 (795 mg)

Pđ XR.C.3 (3,23 g)

Pđ XR.C.4 (20,91 g)

Pđ XR.C.9 (1,44 g)

Pđ XR.C.7 (4,18 g)

Pđ XR.C.8 (1,14 g)

Pđ XR.C.1

(690 mg)

XHX-R.C2 (127 mg) (0,00254%)

XHX-R.C3 (15,23 g) (0,30460%)

XHX-R.C4 (45 mg) (0,00090%)

XHX-R.C7 (12 mg) (0,00024%)

XHX-R.C5 (26 mg) (0,00052%)

XHX-R.C10 (3 mg) (0,00006%)

XHX-R.C9 (4 mg) (0,00008%)

XHX-R.C12 (8 mg) (0,00016%)

XHX-R.C8 (12 mg) (0,00024%)

XHX-R.C1

(230 mg)

(0,00460%)

Tách phân đoạn bằng phương pháp trích lỏng- lỏng với ethyl acetate

Pđ XR.C.10 (300 mg)

XHX-R.C6 (18 mg) (0,00036%)

XHX-R.C11 (5 mg) (0,00010%)

XHX-R.C13 (5 mg) (0,00010%)

SKC, PE:EA

SKC,

PE:EA (99:1)

SKC, PE:EA (95:5)

SKC, C:EA (98:2)

SKC, C:EA (9:1)

SKC, PE:A (6:4)

SKC, C:EA (8:2)

SKC,

EA:M:N (20:1:1)

Pđ XR.MN.2 (1,05 g)

XHX-R.MN3 (83 mg) (0,00166%)

Pđ XR.MN.4 (3,22 g)

XHX-R.MN1 (15 mg) (0,00030%)

XHX-R.MN2 (71 mg) (0,00142%)

Pđ XR.E.4 (5,12 g)

Pđ XR.E.6 (1,61 g)

XHX-R.E1 (15 mg) (0,00030%)

XHX-R.E2 (5 mg) (0,00010%)

SKC, EA:M:N (30:1:1)

SKC, C:M

SKC, C:M

SKC, EA:M:N (20:1:1)

RP-18, M:N (1:2)

Muối vơ cơ (40 g) Kết tủa

SKC, C:M:N (20:6:1)

Ghi chú: C: chloroform, PE: petroleum ether,

EA: ethyl acetate, A: acetone, M: methanol, N: nước

(…%): thu suất so với khối lượng nguyên liệu khơ ban đầu

Qua cột Diaion HP20

M

-26-

Cao dichloromethane (XL.D, 22 g)

Cao petroleum ether

Trích kiệt với petroleum ether bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng

Pđ XL.D.2 (1,13 g)

XHX-L.D (5 mg) (0,00050%)

SKC silica gel, CH:M (9:1) SKC Sephadex LH20, C:M (1:1)

Pđ XL.E.2 (480 mg)

Pđ XL.E.4 (200 mg)

XHX-L.E1 (40 mg) (0,00400%)

XHX-L.E2 (7 mg) (0,00070%)

Trích kiệt với dichloromethane bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng

Trích kiệt với ethyl acetate bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng

SKC, PE:A

SKC, CH:EA, EA:M

SKC silica gel, CH:M (85:15) SKC Sephadex LH20, C:M (1:1)

SKC silica gel, C:M (85:15) SKC Sephadex LH20, C:M (1:1)

Trích kiệt với methanol bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng

XHX-L.M (20 mg) (0,00200%)

SKC, A:M:N

Pđ XL.M.2 (108 mg) SKC, A:M:N

Muối vô cơ (15,5 g) Kết tủa

Ghi chú: CH: cyclohexane, C: chloroform, PE: petroleum ether,

EA: ethyl acetate, A: acetone, M: methanol, N: nước

-28-

Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate lá Xuân hoa đỏ lá đỏ (ĐL.E, 17 g)

Phân đoạn Dung môi giải ly Khối

lượng

Kết quả SKLM Ghi chú

ĐL.E.1 C:M (95:5) 5,03 g Nhiều vết Không khảo sát

ĐL.E.2 C:M (9:1) 1,76 g Nhiều vết Không khảo sát

ĐL.E.3 C:M (8:2) 1,24 g Nhiều vết Không khảo sát

ĐL.E.4 C:M (7:3) 760 mg Vết rõ

Khảo sát, thu được

 XHĐL.E1 (12 mg; 0,00024%)

 XHĐL.E2 (15 mg; 0,00030%) ĐL.E.5 C:M (6:4) 2,95 g Nhiều vết Không khảo sát

ĐL.E.6 C:M (5:5) 1,74 g Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHĐL.E3 (30 mg; 0,00060%) ĐL.E.7 C:M (3:7)

M 1,25 g Nhiều vết Không khảo sát

Ghi chú: C: chloroform, M: methanol

Bảng 2.4 Kết quả sắc ký cột cao methanolnước lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ (ĐL.MN, 30 g)

Phân đoạn Dung môi giải ly Khối

lượng

Kết quả SKLM Ghi chú

ĐL.MN.1 M:N (1:8) 632 mg Nhiều vết Không khảo sát

ĐL.MN.2 M:N (1:8) 394 mg Vết rõ

Khảo sát, thu được

 XHĐL.MN1 (21 mg; 0,00042%)

 XHĐL.MN2 (10 mg; 0,00020%) ĐL.MN.3 M:N (1:7) 5,94 g Nhiều vết Không khảo sát

M

6,52 g Nhiều vết Không khảo sát

Ghi chú: M: methanol, N: nước

Bảng 2.5 Kết quả sắc ký cột cao chloroform rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh (XR.C, 120 g)

Phân đoạn Dung môi giải ly Khối

lượng

Kết quả SKLM Ghi chú

XR.C.1 PE:EA (99:1) 690 mg Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHXR.C1 (230 mg; 0,00460%) XR.C.2 PE:EA (98:2) 24,78 g Nhiều vết Không khảo sát

XR.C.3 PE:EA (95:5) 3,23 g Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHXR.C2 (127 mg; 0,00254%) XR.C.4 PE:EA (9:1) 20,91 g Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHXR.C3 (15,23 g; 0,30460%) XR.C.5 PE:EA (8:2) 795 mg Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHXR.C4 (45 mg; 0,00090%) XR.C.6 PE:EA (7:3) 30,86 g Nhiều vết Không khảo sát

 XHXR.C13 (5 mg; 0,00010%) XR.C.11 EA 20,26 g Nhiều vết Không khảo sát

Ghi chú: PE: petroleum ether, EA: ethyl acetate

Bảng 2.6 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh (XR.E, 20 g)

Phân đoạn Dung môi giải ly Khối

lượng

Kết quả SKLM Ghi chú

XR.E.1 C:M (99:1) 2,19 g Nhiều vết Không khảo sát

XR.E.2 C:M (98:2) 4,41 g Nhiều vết Không khảo sát

XR.E.3 C:M (95:5) 1,73 g Nhiều vết Không khảo sát

XR.E.4 C:M (9:1) 5,12 g Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHXR.E1 (15 mg; 0,00030%) XR.E.5 C:M (8:2) 1,58 mg Nhiều vết Không khảo sát

XR.E.6 C:M (7:3) 1,61 g Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHXR.E2 (5 mg; 0,00010%) XR.E.7 C:M (5:5)

M 1,18 g Nhiều vết Không khảo sát

Ghi chú: C: chloroform, M: methanol

-30-

Bảng 2.7 Kết quả sắc ký cột cao methanolnước rễ Xuân hoa đỏ lá xanh (XR.MN, 20 g)

Phân đoạn Dung môi giải ly Khối

lượng

Kết quả SKLM Ghi chú

XR.MN.1 C:M (95:5) 5,36 g Nhiều vết Không khảo sát

XR.MN.2 C:M (9:1) 1,05 g Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHXR.MN1 (15 mg; 0,00030%) XR.MN.3 C:M (8:2) 2,62 g Nhiều vết Không khảo sát

XR.MN.4 C:M (7:3) 3,22 g Vết rõ

Khảo sát, thu được

 XHXR.MN2 (71 mg; 0,00142%)

 XHXR.MN3 (83 mg; 0,00166%) XR.MN.5 C:M (5:5) 3,85 mg Nhiều vết Không khảo sát

Ghi chú: C: chloroform, M: methanol

Bảng 2.8 Kết quả sắc ký cột cao dichloromethane lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh (XL.D, 22 g)

Phân đoạn Dung môi giải ly Khối

lượng

Kết quả SKLM Ghi chú

XL.D.1 PE:A (9:1) 8,64 g Nhiều vết Không khảo sát

XL.D.2 PE:A (8:2) 1,13 g Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHXL.D (5 mg; 0,00050%) XL.D.3 PE:A (7:3) 9,32 g Nhiều vết Không khảo sát

Ghi chú: PE: petroleum ether, A: acetone

Bảng 2.9 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh (XL.E, 7 g)

Phân đoạn Dung môi giải ly Khối

lượng

Kết quả SKLM Ghi chú

XL.E.1 CH:EA (95:5) 0,93 g Nhiều vết Không khảo sát

XL.E.2 EA:M (98:2) 480 mg Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHXL.E1 (40 mg; 0,00400%) XL.E.3 EA:M (90:10) 2,56 g Nhiều vết Không khảo sát

XL.E.4 EA:M (85:15) 200 mg Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHXL.E2 (7 mg; 0,00070%) XL.E.5 EA:M (80:20) 1,85 g Nhiều vết Không khảo sát

Ghi chú: CH: cyclohexane, EA: ethyl acetate, M: methanol

Phân đoạn Dung môi giải ly Khối

lượng

Kết quả SKLM Ghi chú

XL.M.1 A:M (9:1) 12,64 g Nhiều vết Không khảo sát

XL.M.2 M:N (99:1) 108 mg Vết rõ Khảo sát, thu được

 XHXL.M (20 mg; 0,00200%) XL.M.3 M:N (95:5) 44,87 g Nhiều vết Không khảo sát

Ghi chú: A: acetone, M: methanol, N: nước

2.2 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC

2.2.1 Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase

Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE) in vitro trên

các hợp chất tinh khiết cô lập được theo phương pháp Ellman.[20]

2.2.1.1 Nguyên tắc

Cơ sở khoa học của phương pháp Ellman như sau:

Việc đo màu liên quan đến tốc độ sản phẩm thiocholine được sinh ra sau khi

cơ chất bị phân hủy bởi AChE

Đầu tiên AChE thủy phân cơ chất acetylthiocholine tạo ra thiocholine

Thiocholine phản ứng với thuốc thử Ellman là 5,5’–dithiobis–2–nitrobenzoate (DTNB) tạo ra hai sản phẩm là 2–nitrobenzoate–5–mecaptothiocholine và 5–thio–2–nitrobenzoate, được phát hiện ở bước sóng 405 nm

2.2.1.2 Hoá chất và dụng cụ

 Acetylthiocholine iodide, ATCI (SIGMA);

 Enzyme acetylcholinesterase, AChE (SIGMA);

 Bovine serum albumin, BSA (SIGMA);

 5,5’–Dithiobis–2–nitrobenzoic acid, DTNB (SIGMA);

 Galanthamine tinh khiết (SIGMA);

 Dung dịch đệm Tris HCl 1M pH 8 (INVITROGEN);