NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CHƯƠNG 3 ppt

CHƯƠNG IIICÁC KỸ THUẬT CỦA CÔNG NGHỆ GEN I- SƠ ĐỒ KHÁI QUÁT II- CÁC CÔNG CỤ III- CÁC KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CĂN BẢN IV- PHƯƠNG PHÁP PCR V.. Sự khác nhau căn bản của kĩ thuật mới với ph

CHƯƠNG III

CÁC KỸ THUẬT CỦA CÔNG NGHỆ GEN

I- SƠ ĐỒ KHÁI QUÁT

II- CÁC CÔNG CỤ

III- CÁC KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CĂN BẢN

IV- PHƯƠNG PHÁP PCR

V XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CÁC

NUCLEOTIDE CỦA GEN

• Vào năm 1972 – 1973, Berg, Boyer và Cohen ở

Mĩ đã tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp in vitro từ

ba nguồn vật liệu di truyền khác nhau Tiếp

theo, 1973 – 1974, nhóm Cohen, Helinski, Boyer đã lần đầu tiên nhận được DNA tái tổ hợp có

hoạt tính sinh học Sự khác nhau căn bản

của kĩ thuật mới với phương pháp cũ ở

chỗ cho phép trong điều kiện thí nghiệm in

vitro (trong ống nghiệm) tạo thành (ghép

nối) các tổ hợp có hoạt tính khi đưa trở vào

tế bào sống từ các đoạn DNA khác nhau

có lựa chọn.

KĨ THUẬT TÁÙI TỔ HỢP DNA.

1 Sơ đôàà kháùi quáùt.

1.Tách DNA plasmid và DNA tế

bào cho (người)

2 Cắt cả hai loại DNA restriction endonuclesae tạo các đầu so le cố kết 3 Trộn

2 loại DNA để gắn gen lạ vào plasmid 4 Ligase tạo

liên kết hóa trị (Phosphodiester) 5 Chuyển ADN tái tổ hợp vào

tế bào nhận (vi khuẩn

E.coli)

6 Tạo dòng.

II CÁC CÔNG CỤ

• 1 CÁC CÔNG CỤ ENZYME.

– Restriction endonuclease (cắt).

RESTRICTION ENDONUCLEASE

(RE)

•- Phân lập từ vi khuẩn, mà 25% có

ít nhất 1 RE.

- Trình tự nhận biết (recognition

site) trên DNA mạch kép Ví dụ

e.g EcoRI: -

GAATTC - CTTAACGAATTC -

CTTAAC Có 3.000 RE đã được phát hiệän với hơn 230 trình tự nhậän biết

Wadsworth Center ORNL

b Enzyme Ligase (nối).

•Liên kết phosphodiester được tạo

ra giữa G-A hay A-G trên mỗi

mạch DNA

c) Enzyme phiên mã ngược (Reverse

transcriptase)

• Enzyme reverse transcriptase có khả năng tổng hợp nên

DNA một mạch được gọi là c-DNA (complementary DNA)

từ khuôn mRNA hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng

hợp hoá học Nhờ enzyme reverse transcriptase này có

thể tổng hợp hầu như bất cứ gen riêng biệt nào miễn có mặt mRNA của gen đó Các c-DNA mạch đơn có thể

được biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và được

gọi là c-DNA kép (c-DNA duplex)

• Đoạn c-DNA kép được gắn vào plasmid và biến nạp vào

vi khuẩn để tạo dòng c-DNA

d) Các enzyme khác

Enzyme Chức năng

Dnase I Phân huỷ DNA mạch kép bằng

thuỷ giải nội liên kết phosphodiester.

Nuclease BAL31 Phân huỷ cả 2 đầu mút 3’ và 5’ của

DNA không cắt nội liên kết.

S1 nuclease Phân huỷ DNA mạch đơn.

Đoạn Klenow DNA polymerase chỉ còn hoạt tính

exonuclease 3’ –> 5’

Taq DNA

polymerase DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquatus

2 CÁC VECTOR CHUYỂN GEN

MCR : MULTICLONING REGION

Các vector chuyển gen phải thoả mãn các

yêu cầu tối thiểu :

• – Có các trình tự khởi sự sao chép (ori) để tự sao

chép mà tồn tại độc lập

• – Có các trình tự nhận biết, nơi cắt để hở làm chỗ

ráp đoạn gen lạ vào

• – Các trình tự điều hòa (promoter) tạo thuận lợi

cho sự phiên mã gen lạ

• – Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ

hợp.

• – Có các gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện ra

chúng hoặc các gen lạ

Các vector chuyển gen có 5 ứng dụng

quan trọng chủ yếu :

DNA (nhiều bản sao giống nhau).

• – Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn

trình tự DNA.

a) Các vector plasmid

• Một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi

nhất là pBR322 (hình 3.4) Như mô tả, plasmid này có gen kháng ampicilline (ampR), gen kháng

tetracyline (tetR), trình tự xuất phát sao chép (ori)

và nhiều trình tự nhận biết đặc hiệu cho các RE

như EcoRI , HindIII, BamHI, SalI, Nó có khả

năng sao chép độc lập với bộ gen tế bào E.coli và

tồn tại với số lượng trung bình 20 – 30 bản sao cho mỗi tế bào

Plasmid pBR322

3 Các hệ thống tế bào chủ.

• – Nuôi số lượng lớn để tách plasmid cho thí nghiệm tạo dòng

• – Dùng để biểu hiện gen tái tổ hợp,

đặc biệt ở Eukaryotae bậc cao như tế

bào động thực vật

• – Dùøng để sản xuất các protein tái tổ hợp.

a Vi khuẩn Escherichia coli (E

coli).

E coli dòøng JM109

a Vi khuẩn Escherichia coli

(E coli).

E.coli là vi khuẩn Gram âm,

hình que (~ 1 micromet), không độc, thường gặp trong ruột

người Bộ gen là một phân tử

DNA (nhiễm sắc thể) vòng tròn khoảng 4,6 x 106 cặp base, nằm

ở vùng nhân (nucleoid).

Tế bào vật chủ đơn giản nhất

b Nấm men Saccharomyces

cerevisiae.

• – Thứ nhất, nó là một Eukaryotae đơn bào (~ 5

micromet), biết rất chi tiết về DT và SL

• – Thứ hai, vài promoter mạnh được phân lập từ S

cerevisiae, đặc biệt YAC.

• –Thứ ba, S cerevisiae có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã

• – Thứ tư, thường tiết ra rất ít loại protein

• – Thứ năm, nó đã được sử dụng nhiều thế kỉ trong

sản xuất bánh mì và bia, đưa vào danh sách sinh

vật an toàn thực phẩm

c Các hệ thống tế bào thực vật.

d Các hệ thống tế bào động vật.

• – Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (African green monkey kidney (COS).

• – Tế bào thận chuột đồng con (Baby hamster kidney (BHK).

• – Tế bào thận phôi người (Human embryonic kidney (HEK-239).

• – Tế bào tử cung chuột bạch (Chinese hamster ovary (CHO).

• – Tế bào côn trùng nuôi Baculovirus biểu hiện protein

người

• – Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans.

III CÁC KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG

PHÁP CĂN BẢN

1 Lai nucleic acid

3 phương pháp lai trên pha rắn được sử dụng rộng rãi nhất :

– Thấm Southern (Southern blot), do ông E

Southern tìm ra, dùng cho DNA

– Thấm Northern (Northern blot) dùng cho RNA – Phương pháp dot (điểm) và slot (khe) blot dùng cho RNA và DNA

2 Lai tại chỗ (in situ hybridisation)

2 Xác định số lượng và đánh dấu

DNA.

• – Nồng độ dung dịch DNA bằng cách đo độ hấp

thụ tại bước sóng UV 260nm

• – Nồng độ nucleic acid có thể được xác định

thông qua độ phát sáng huỳnh quang

• liên kết với ethidium bromide

• – Đánh dấu phóng xạ

• 3 Điện di trên gel.

• 4 Lai nucleic acid.

3 Thu nhận gen

• a Tách các đoạn DNA từ bộ gen.

• b Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học

• - Hormone somatostatin

• - Insulin

• c Sinh tổng hợp gen từ mRNA của gen tương ứng.

Wadsworth Center ORNL

Wadsworth Center ORNL

4 TẠO PLASMID TÁI TỔ HỢP.

• 1 Phương pháp đơn giản dùng các đầu cố kết

• 2 Phương pháp dùng các đoạn nối

(linkers)

terminal transferase.

5 BIẾN NẠP DNA TÁI TỔ

HỢP VÀO TẾ BÀO.

• a Hóa biến nạp.

• xử lí CaCl2 lạnh, kèm sốc nhiệt (420C, 2’)

• b Điện biến nạp.

• c Vi tiêm (micro-injection)

• d Bắn DNA vào tế bào

• Các hạt kim loại tungsten hay vàng

6.CHỌN LỌC, TẠO DÒNG VÀ SỰ

BIỂU HIỆN CỦA GEN

• a Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp.

• - Tế bào vi khuẩn không nhận được plasmid.

• - Tế bào nhận được plasmid không có gen lạ vào.

• - Tế bào vi khuẩn nhận được đúng plasmid tái tổ hợp.

• Thấp hơn 1 phần tỉ.

• a Lai nucleic acid

• b Bổ sung -α (α -Comflementation).

• c Mất hoạt tính do xen đoạn.

• 2 Sự biểu hiện gen tạo dòng.

Mixture white blue colonies (white colonies contain DNA w/inserts).

/inserts ).

2 Sự biểu hiện của gen được

tạo dòng.

• – Số lượng hợp lí các bản sao của vector plasmid

đối với một tế bào

• – Chọn promoter mạnh để phiên mã tốt.

• – Có trình tự tạo điểm bám vào ribosome (rbs) và DNA phụ cho dịch mã tốt.

• – Chọn lựa các codon tốt cho dịch mã trong gen

được tạo dòng

• – DNA tái tổ hợp có sự ổn định lâu dài.

• – Tránh sự thủy giải protein (proteolysis) do các

enzyme của tế bào

III PHƯƠNG PHÁP PCR.

• Polymerase chain reaction, viết tắt là PCR, phản ứng

polymerase dây chuyen

amplifier (nhân tố khuyếch đại), oligo hay primer.

• – dNTP : các loại nucleotide triphosphate.

Bổ sung mồi 1, mồi 2, dNTP

và Taq polymerase

Tăng đến 95oC để tách mạch

Giảm đến 60oC để mồi bắt cặp

Tăng đến 95oC để tách mạch

Giảm đến 60oC để mồi bắt cặp

Mồi P2DNA mục tiêu

Ở 60oC mồi được kéo dài nhờ

2

DNA mục tiêu

Bổ sung mồi 1, mồi 2, dNTP và Taq polymerase

Tăng đến 95 o C để tách mạch Giảm đến 60 o C để mồi bắt cặp Mồi P1

3 Giá trị sử dụng

• – Thời gian thực hiện cực nhanh, chỉ cần mất 3 giờ

để khuếch đại một trình tự DNA được quan tâm

• – Đơn giản và ít tốn kém : được thực hiện trong

ống nghiệm plastic nhỏ

• – Độ tinh sạch của mẫu không cần cao : PCR có

thể thực hiện với các mẫu nucleic acid thô

V XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CÁC

NUCLEOTIDE CỦA GEN

• 1 Phương pháp hóa học Maxam và Gilbert

didesoxy và nay đã có máy tự động xác định

trình tự các nucleotide của DNA

Phương pháp didesoxy của Sanger

Wadsworth Center Courtesy of Dr.Robert Desnick