NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CHƯƠNG 5 pps

Cấu trúc Protein• Protein: chuỗi các amino acid nối với nhau bằng cầu nối peptide • Các Amino Acid: –Phân cực: có những vùng tích điện âm và dương –Nhóm C=O carboxyl tự do, chất nhận cầu

CHƯƠNG V

CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ

ENZYME

I CẤU TRÚC PROTEIN

II CÁC PROTEIN TRỊ LIỆU

III CÁC ENZYME CÔNG NGHIỆP

IV CỐ ĐỊNH ENZYME VÀ TẾ BÀO

V BIOSENSOR (CẢM BIẾN SINH

HỌC)

Cấu trúc Protein

• Protein: chuỗi các amino acid nối với nhau bằng cầu nối peptide

• Các Amino Acid:

–Phân cực: có những vùng tích điện âm và dương

–Nhóm C=O (carboxyl) tự do, chất nhận cầu nối hydro

–Nhóm NH (amin) tự do, chất cho cầu nối hydro

• Các Amino acid khác nhau ở gốc R có thể được chia làm 3 loại:

–Kị nước: Alanine(A), Valine(V), phenylalanine (Y), Proline (P), Methionine (M), isoleucine (I) và Leucine(L)

–Tích điện: partic acid (D), Glutamic Acid (E), Lysine (K),

Arginine (R)

–Phân cực: Serine (S), Theronine (T), Tyrosine (Y); Histidine (H), Cysteine (C), Asparagine (N), Glutamine (Q), Tryptophan (W)

• Nhiều cấu hình có thể tạo ra do sự quay của các phân tử xung quanh Carbon alpha (Cα)

• Cấu hình amino acid thay đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc bậc ba của protein

Cấu trúc Protein

phần của chuỗi polypeptide

• Cấu trúc bậc hai : sự sắép xếp của các amino acid trong chuỗi polypeptide ở dạng mạch thẳng

như: xoắn α và chuỗi β

chiều của các amino acid, tác động với nhau do sự phân cực và sự tương tác với các chuỗi bên.

• Cấu trúc bậc 4: là sự sắp xếp tổng thể trong

không gian của các tiểu phần trong một protein mà cấu thành từ hai hay nhiều chuỗi

polypeptide

Xoắn α

‰Cầu nối hydro được hình thành giữa mỗi 4 vị trí amino acid

‰Một vòng xoắn tương đương với khoảng 3,6 amino acid.

‰Chiều dài trung bình của một dải xoắn là 10 amino

acid với khoảng 3 vòng xoắn

‰Chiều dài thay đổi từ 5 đến 40 amino acid

•- Trên bề mặt của các

Phiến β

a)

-Điểm đầu mũi tên chỉ hướng đầu tận cùng C của

polypeptide, chia thành 3 lọai: Gồm các chuỗi β xếp lại với nhau với số lượng

các cầu nối Hydro tối đa Cùng chiều: phiến parallel Ngược chiều: anti parallel

Hỗn hợp.

2 Sự ổån định và gấp cuộn

• Trình tự amino acid không đủ đảm bảo cho polypeptide tạo dạng hình có tính đặc hiệu cao để đáp ứng đúng chức năng của nó

• Nhóm các protein chaperone giúp các polypeptide gấp cuộn đúng dạng hình không gian ba chiều có đủ hoạt tính sinh

học và một số enzyme như disulfide isomerase giúp tạo cầu nối disulfide.

• Các protein gấp cuộn không đúng có thể gây ra bệnh như Alzheimer, chứng xơ

nang, nhiều căn bệnh ung thư … là kết qủa

của sự gấp nếp sai.

• Các enzyme peptidyl prolyl isomerase và

các enzyme protein disulfide isomerase

cũng tham gia vào việc gấp cuộn chính

xác và hữu hiệu của nhiều protein in vivo.

3 Các biến đổi sau dịch mã

• Sự cắt xén bởi protease Ví dụ, các enzyme tiêu

hoá như trypsin, chymotrypsin và pepsin

• Glycosyl hóa : gắn thêm các gốc hoặc chuỗi

đường Thường gặp ở các protein màng hoặc các

protein ngoại bào ở Eukaryotae Glycosyl hoá có

nhiều chức năng : trực tiếp làm trung gian cho các hiệu ứng sinh học của một số protein (hCG và erythropoetin), định hướng mục tiêu (các enzyme của lysosome), nhận biết (các thụ thể), ổn định cấu trúc, thay đổi độ hòa tan, tăng bán chu kì tồn tại của phân tử

•

• – Phosphoryl hóa : gắn thêm nhóm phosphate vào protein, mà chất cho chủ yếu là ATP Quá

trình có thể thuận nghịch nhờ hệ thống 2 enzyme : kinase và phosphatase Nó

• làm thay đổi hoạt tính sinh học hoặc tính chất hóa lý của polypeptide.

• Ngoài ra, có nhiều kiểu biến đổi sau dịch mã

khác như acetyl hóa (acetylation), acyl hóa

(acylation), amid hóa (amidation), sulfate hóa

(sulfation), hydroxyl hóa (hydroxylation), tạo

nối S-S,

II CÁC PROTEIN TRỊ LIỆU

• 1.Các protein từ máu và sản phẩm

• Hệ tuần hoàn chứa khoảng 5 – 6 lít máu, chiếm 8,5 –

9,0% tổng trọng lượng cơ thể người Máu gồm các tế

bào hồng cầu (99% tổng các tế bào máu), các bạch cầu và tiểu cầu, lơ lững trong dịch huyết tương Khi máu đóng cục (clot), các tế bào bị nhốt trong mạng

lưới các protein sợi fibrinogen, chất lỏng còn lại là

huyết thanh.

• Sử dụng chủ yếu ở các dạng : máu toàn phần, chất

đông máu, chất chống đông máu và tác nhân làm tan máu.

Máu toàn phần và huyết tương

• Máu toàn phần được thu nhận một cách vô trùng từ người cho máu, ngay lập tức được hòa lẫn với chất chống đông để ngăn chặn sự đông máu

• Các chất chống đông có heparin và sodium citrate

• Máu toàn phần làm nguồn cung cấp các yếu tố máu:

* Tế bào hồng cầu;

* Tiểu cầu;

* Các nhân tố đông máu;

* Các immunoglobulin miễn dịch;

* Các yếu tố khác trong huyết tương.

- Máu không có mầm bệnh : HIV, HBV, HCV

- Huyết tương cung cấp protein trị liệu quan trọng

- Dịch protein huyết thanh được sử dụng trong các trường hợp bệnh nhân bị sốc do giảm thể tích máu

Các nhân tố đông máu

Nhân tố I Fibrinogen

Nhân tố II Prothrombin

Nhân tố III Thromboplastin (nhân tố mô)

Nhân tố IV Calcium

Nhân tố V Labile factor (proaccelerin)

Nhân tố VI *

Nhân tố VII Proconvertin

Nhân tố VIII Antihaemophilic factor

Nhân tố IX Christmas factor (thromboplastin huyết tương) Nhân tố X Stuart factor

Nhân tố XI Thromboplastin huyết tương

Nhân tố XII Hageman factor

Nhân tố XIII Fibrin stabilizing factor (FSF-nhân tố ổn định fibrin) Dạng hoạt hóa được kí hiệu “a” , ví dụ VIIa là nhân tố VII hoạt hóa

• : Nhân tố VI đã được xác định chính là nhân tố Va

CÁC CHẤT CHỐNG ĐÔNG

• Các chất chống đông được sử dụng cho người bệnh

đau tim, bệnh đột quỵ, người mắc chứng nghẽn mạch

• Chứng nghẽn mạch liên quan đến sự đông kết cục

máu Chứng nghẽn mạch dễ dàng xảy ra ở các mạch máu có bệnh lý Sự thành lập một cục máu nghẽn

trong một động mạch làm tắc nghẽn dòng di chuyển của máu đến mô

• Cục máu (nghẽn động mạch vành) sẽ làm tắc nghẽn dòng máu đến cơ tim,gây ra đau tim, thường gây chết, hoặc nhồi máu ở một phần cơ tim.

• Các cục máu ngăn máu lên não thường gây đột quỵ.

• Nguy cơ cao do phẩu thuật, ít cử động, cao tuổi, có

thai

2 Hormone và các nhân tố tăng

• Các cytokine được tổng hợp chủ yếu do bạch

cầu Khác với các hormone, các cytokine đều là polypeptide hoặc glycoprotein và được sản sinh ra

do các tế bào không tổ chức thành tuyến Chúng

thường được tổng hợp bởi nhiều hơn một kiểu tếbào, tác động đến vài loại tế bào mục tiêu và

kích hoạt nhiều phản ứng ở các tế bào này

3 Các cytokine : interleukine và

interferon

• Các nhóm chủ yếu gồm :

• – Các interleukin (IL-1 – IL-15) Interleukine-2 có vai trò trong phản ứng miễn dịch chống tế bào ung thư và

nhiễm virus IL-2 trong liệu pháp miễn nhiễm.

• – Các interferon gồm IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-ω và IFN-τ Các interferon tăng cường sự đề kháng không đặc

hiệu như giúp tế bào đích chống virus, ức chế sự tăng

sinh của nhiều loại tế bào và điều hoà sự biểu hiện của

các kháng nguyên MHC lớp I Nhiều interferon sản xuất nhờ CN gen.

• – Các nhân tố kích thích tạo tập đoàn tiểu cầu

• – Các nhân tố gây hoại tử khối u (– TNF)

Interferon (IFN)

- Phát hiện: 1957

- Động vật có xương sống

- Loài hữu nhũ có ít nhất 3 loại:

IFN-a, IFN-b, IFN-g

- Ở người:

16 IFN-a, 1 IFN-b, 1 IFN-g

Interleukin (IL)

- Ít nhất 16 IL được mô tả ở người

- Hoạt động nhờ liên kết thụ quan chuyên biệt

trên bề mặt các tế bào

- Tính đa hiệu

- Được sản xuất chủ yếu bởi các tế bào của hệ

miễn dịch và chức năng chủ yếu là điều hòa miễn dịch

Các vaccine và kháng thể

• Vaccine là một chế phẩm thành phần của kháng

nguyên thông thường hoặc lấy từ mầm bệnh,

hoặc liên quan tới mầm bệnh

• Các kháng thể được sử dụng trong chẩn đoán in vitro Các kháng thể đa dòng chiết từ máu người

và động vật dùng chẩn đoán và trị liệu, gồm :

immunoglobulin uốn ván, kháng độc tố uốn ván, antitoxin botilin, kháng huyết thanh (antisera) nọc rắn, antisera bò cạp, antisera nhện,…

• Từ 1975, kháng thể đơn dòng.

III CÁC ENZYME CÔNG

NGHIỆP

• 1 Khái quát về enzyme

• Nhờ có enzyme các phản ứng hoá học được thực

hiện trong tế bào sống với sự hoàn hảo trong

điều kiện đẳng nhiệt , đẳng áp và có các đặc

điểm sau : phản ứng có hiệu quả cao, nhiều phản ứng xảy ra đồng thời theo dây chuyền, không

phải tinh sạch sản phẩm ở từng công đoạn, các

phản ứng chịu sự điều hòa hợp lí và tiết kiệm

nhất, lại ít tiêu tốn năng lượng

Có khoảng 3000 enzyme đã được biết và

được phân loại thành 6 nhóm dựa vào loại

phản ứng mà chúng xúc tác : 1) Oxi hóa

-khử; 2) Transferase (chuyển các nhóm

chức năng có chứa C−, N−, hay S−) ; 3)

Hydrolase (tách các liên kết C−C, C−O,

C−N, C−S, C−halogen) ; 4) Lyase (thêm vào các nối đôi) ; 5) Isomerase ; 6) Ligase.

2 Thị trường các enzyme công

nghiệp chủ yếu

Loại enzyme Sản lượng

3 Các enzyme biến đổi carbohydrate

• – Glucoamylase còn gọi amyloglucosidase (exo

α-1,4 D-glucosidase) là exo-hydrolase cắt rời từng glucose từ đầu ngắn α-1,4 mạch glucan của dextrin, nhờ đó phân hủy bột đến tận cùng thành

glucose Chủng sản xuất là Aspergillies niger và

Rhizopus sp (40 – 700C, pH = 6,0 – 6,5), được chọn giống làm mất sự ức chế ngược của glucose

• Các amylase được sử dụng rộng rãi trong công

nghiệp rượu bia, bánh mì, sản xuất glucose từ bột

Do nhu cầu ngày càng cao nên sản xuất enzyme tăng nhanh, đạt doanh số lớn nhất

4 Các protease

• – Rennin (còn gọi chymosin) là enzyme từ dạ dày bê non

(chưa cai sữa), dùng đông tụ sữa trong sản xuất phômai

• Dịch chiết thô gọi là rennet có chứa 2 – 3% rennin Rennin có 2 ưu điểm đặc biệt là đông tụ sữa nhanh và casein bị nó phân hủy tạo nên phômai có hương vị thơm

ngon Các chủng mốc Mucor miehei và Mucor pusillus

sản sinh protease có hoạt tính tương tự rennin

• Công nghiệp sản xuất phômai phát triển mạnh với doanh số gần 30 tỉ USD, nên rennin có sản lượng lớn thứ hai sau các amylase.

• – Protease acid từ chủng Aspergillus sp Dùng thay

thế rennin

• – Protease kiềm (alkaline) từ các chủng

Aspergillus oryzae và Bacillus sp., dùng trong bột

giặt Sản lượng enzyme này tăng nhanh

• – Protease trung tính từ các chủng Bacillus

amyloliquefaciens, Bacillus thermoproteoliticus

dùng dịch hoá các chất phụ gia cho bia

• – Papain, bromelain và ficin là các protease thực

vật được sử dụng làm mềm thịt, làm trong suốt

rượu bia và dịch nước trái cây

5 Các enzyme khác

• – Pectinase : Phần lớn pectinase từ các loài Aspergillus và Penicillinum Chúng làm tăng hiệu suất chiết tách và làm trong dịch nước trái cây nước ép quả.

• – Cellulase : chất tẩy rửa, sản xuất thức uống có cồn

6 Các enzyme và protein cực đoan

• – Các enzyme từ sinh vật chịu nhiệt cao là mục

tiêu cần hướng tới trong các quy trình chế biến công nghiệp, vì thực hiện ở nhiệt độ cao sẽ giảm nhiễm bởi nhiều VSV khác và có phản ứng nhanh hơn Hiện DNA polymerase chịu nhiệt

được sử dụng rộng rãi Ngoài ra, nhiều amylase,

protease,… chịu nhiệt cao (có thể đến 118OC) đã được phát hiện

V CỐ ĐỊNH ENZYME VÀ TẾ BÀO

• Các enzyme thường sử dụng trong dung dịch và sau đó không thu hồi được, mà việc chiết

tách chúng rất tốn kém làm giá thành cao Để sử dụng enzyme nhiều lần và hiệu quả hơn, kĩ

thuật cố định enzyme hay giữ im (enzyme

immobilisation) ra đời mở rộng khả năng ứng dụng chúng

• – Phương pháp gắn cơ học hay hấp phụ : Sử dụng các vật liệu chất nền (matrix material) xốp có

nhiều lỗ hỏng như chất trao đổi ion, nhựa resin, than hoạt tính, đất sét, oxide nhôm, sợi thủy tinh xốp, sành, sứ, có thể làm cho các enzyme hoặc tế bào gắn vào những khe và khi sử dụng

enzyme không bị mất (hình 5.5)

Cơ chất gắn cơ học vào chất nền (a)

và chất trao đổi ion (b)

• – Phương pháp liên kết chéo : Dùng các chất trung

gian : glutaraldehyde, bisisocyanate,

bisdiazobenzidine, BSA (bovine serum albumin) để

gắn enzyme vào chất nền Hoạt tính enzyme

mạnh và ổn định hơn nếu liên kết chéo với

glutaraldehyde hay với BSA

• – Liên kết cộng hoá trị : agarose, cellulose, PVC

(polyvinyl chloride), chất trao đổi ion, sợi thủy

tinh xốp (porous glass) là các chất nền Phương

pháp này rất phức tạp, nhưng nó làm cho hoạt tính

của enzyme được khôi phục và ổn định hơn

• – Phương pháp nhốt (Entrapment) :Sử dụng cho

cả enzyme và tế bào Các chất nền có acid alginic

(C6H8O6)n , carageenan, collagen, polyacrylamide,

gelatin, silicon rubber, polyurethans Các chất

nhốt bao bên ngoài, nhưng vẫn cho các cơ chất

cần biến đổi có thể ra vào qua màng (hình 5.6)

Alginat, carageenan chiết tách từ tảo thường được

sử dụng

• Có thể sử dụng các enzyme cố định nhiều lần,

thậm chí trong nửa năm hoặc cả năm Hiện nay, phương pháp này được sử dụng nhiều hơn cả

Nhốt trong mạng gel (a) và

trong chất nền (b)

• Phương pháp nhốt được ứng dụng cho tế bào nguyên vẹn Khi cố định tế bào, phải tạo điều

kiện để tế bào chết được thay thế bằng tế bào mới Có định tế bào nguyên vẹn có nhiều ưu điểm :

• – Đơn giản hơn, vì không phải tốn kém nhiều

cho chiết tách tinh sạch enzyme, nên giá thành thấp.

• – Các enzyme hoàn chỉnh được hình thành trong tế bào nên không cần bổ sung các

cofactor hay coenzyme như enzyme tinh chế

ngoài tế bào.

2 Sản xuất sirop giàu fructose

• Chất bột bắp dưới tác dụng của α-amylase biến thành dextrin, chất này nhờ glucoamylase thủy giải đến tận cùng tạo glucose có độ ngọt thấp

hơn đường thường Glucose được biến thành

fructose nhờ glucose isomerase tạo ra sirop

gluco-fructose ngọt hơn đường saccharose Phản ứng

thuận nghịch

• Để tăng tỉ lệ fructose là chất ngọt gấp 1,7 lần

đường thường, các glucose isomerase cố định được sử dụng trong bioreacor Dung dịch glucose

khi qua bioreactor chứa glucose isomerase sẽ biến thành fructose rồi thoát ra ngoài để được thu hồi Nhờ vậy, dịch sirop glucose-fructose từ bột giàu fructose ( 42% fructose, 50% glucose và 8% các đường khác) Enzyme cố định thể hiện rõ vai trò quan trọng của nó

BIOREACTOR

• Một xu hướng mới hiện nay là sản xuất chất ngọt theo phương pháp này, vì ít tiêu tốn năng lượng hơn và không phụ thuộc mùa vụ như đường làm từ mía Sản xuất

đường mía phải quy hoạch vùng nguyên liệu cho nhà máy, đến mùa thu hoạch phải tốn nhiều năng lượng chế biến : chặt và chuyên chở khối lượng lớn (chỉ 10% đường), ép mía, nấu cô đặc, kết tinh và li tâm thu đường.

3 Các enzyme cố định biến đổi

amino acid

• – Enzyme cố định L-amino acid acylase dùng acyl hoá để

tách L-amino acid Nhiều L-amino acid sản xuất bằng lên men, nhưng có loại phải tổng hợp hoá học, mà sản phẩm có 2 đồng phân (isomers) D và L Quy trình qua các bước sau :

• + Bước 1 : Hỗn hợp D, L-amino acid (do tổng hợp hoá

học) được xử lí acetyl anhydride thành D, L-acyl amino

acid

• + Bước 2 : D, L-acyl amino acid dưới tác động đặc hiệu

của amino acid acylase cố định cắt nhóm acyl tạo

L-amino acid có độ hoà tan khác với D-acyl L-amino acid

• + Bước 3 : Tách L-amino acid khỏi D-acyl amino

acid

• + Bước 4 : D-acyl amino acid có thể được triền

quang hoá (racemization) rồi tái sử dụng

• – Sản xuất L-aspartic acid nhờ enzyme aspartase của tế bào E coli cố định trong carageenan L- aspartic acid là thành phần gốc của aspartame

(aspartyl phenylalanine methyl ester) là chất ngọt gấp 160 lần sucrose

4 Enzyme cố định trong sản xuất

penicillin bán tổng hợp

• Enzyme penicillin acylase cố định đóng vai trò

thiết yếu trong quá trình sản xuất penicillin

bán tổng hợp trong công nghiệp kháng sinh

Penicillin bán tổng hợp được tạo ra bằng cách

loại bỏ chuỗi bên của penicillin G tự nhiên thu

được lượng lớn trong quá trình lên men, sau đó gắn nhánh mới vào lõi 6-aminopenicillanic acid