NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CHƯƠNG 6: SINH HỌC CỦA CÁC VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP pps

Thiết bị vô trùng• Trong không khí có nhiều vi sinh vật và các bào tử của chúng, đây là nguồn nhiễm khi nuôi cấy các VSV, tế bào động, thực vật.. Tia tử ngoại thường được dùng nhất trong

• II ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VI SINH VẬT

• III KĨ THUẬT VÔ TRÙNG

• IV GIỮ GIỐNG VÀ CHỌN GIỐNG

• V CÁC NHÓM VI SINH CÔNG NGHIỆP

CHỦ YẾU

CÁC VI SINH VẬT

• Vi sinh vật chỉ các sinh vật nhỏ bé chỉ phát hiện

được nhờ kính hiển vi.

• Các vi sinh vật gồm các động vật nguyên sinh

(Protozoa) đơn bào, vi tảo, vi nấm là các vi sinh vật Eukaryotae; còn vi khuẩn, virus là các vi sinh vật Prokaryotae.

I HAI “SIÊU GIỚI”VI KHUẨN THỰC VÀ

CỔ VI KHUẨN.

• Hệ thống phân loại dựa trên rRNA đã tạo nên

cuộc "cách mạng": sinh giới không chia thành 2

nhóm lớn Prokaryotae và Eukaryotae, mà thành

• 3 “siêu giới” là Eubacteria, Archaebacteria và

Eukarya Thực vật, động vật và nấm được xếp

chung vào một “siêu giới” (superkingdom)

Eukarya Có khoảng 200 loài vi khuẩn gây bệnh, nhưng có nhiều loài có ích.

Hình thái khuẩn lạc (nhìn từ trên, mặt

cắt ngang hoặc rìa)

Đặc điểm mọc trên bề mặt hoặc

chiều sâu ống thạch nghiêng

Đặc điểm hình thái cuống bào tử

vi nấm

Đặc điểm hình thái tơ nấm

1 Các vi khuẩn thực

Giới Moneran gồm tất cả các

Procaryotae, tế bào không có

màng nhân, kích thước nhỏ, đa phần đơn bào, phần lớn là vi

khuẩn.

a Một số đặc tính chung của vi khuẩn.

Tế bào hình cầu, que, phẩy, xoắn và riêng,

từng đôi, chuỗi hay từng chùm.

• Trao đổi chất : háo khí, yếm khí, một số có khả năng cố định đạm không khí.

• Di động và không di động

• Một số tạo bào tử chịu điều kiện bất lợi.

• Giới vi khuẩn gồm: vi khuẩn Gram dương, Gram âm và Mycoplasmas.

b Vi khuẩn Gram dương.

• Ở vi khuẩn Gram dương, vách tế bào dày chứa

peptidoglycan (mucopeptid hay murein từ 80%

-90% teichoic acid

• Vi khuẩn Gram dương màu tím khi được nhuộm

kép với fuschin và tím tinh thể

• Các nhóm : Actinomycetes (xạ khuẩn), Lactobacillus, Bacillaceae, Micrococcaceae.

c Vi khuẩn Gram âm.

• Ở những vi khuẩn Gram âm, tức không nhuộm màu

Gram, vách tế bào mỏng lớp peptidoglycan chỉ khoảng

10% Mặt ngoài lớp peptidoglycan là một lớp dày chiếm tỉ lệ 80% có chứa protein, lipid, lipo-

polysacchrid Các nhóm điển hình: Cyanobacteria (vi khuẩn lam), Spirochaeta (khuẩn xoắn), Vi khuẩn lưu huỳnh lục, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae.

• d Mycoplasma.

Mycoplasma là nhóm vi khuẩn có kích thước nhỏ nhất,

đặc biệt là không có vách tế bào Chúng sống ký sinh

ở động thực vật và côn trùng.

• Các cổ vi khuẩn là nhóm sinh vật cổ nhất và

khác với VK ở nhiều đặc tính sinh hóa Vách tế bào không có peptidoglucan như ở

Eubacteria Màng tế bào có lipid khác thường

• ARN-polymerase của cổ vi khuẩn giống với

của Eukaryotae nhiều hơn Các Archaebacteria

đạt đến tất cả các kỷ lục về khả năng sống ở các điều kiện ranh giới cực đoan của sự sống.

2 Các cổ vi khuẩn

(Archaebacteria).

• a Các vi khuẩn methane (Methanogene

Archaebacteria)

• b Các vi khuẩn chịu nhiệt-acid

(Thermoacidophile)

• c Các vi khuẩn cực đoan khác :

• Ưa lạnh Archaebacteria psychrophile sống ở 0 –

II ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VSV

• 1 Kích thước nhỏ bé

• 2 Dinh dưỡng:

• - Hấp thu dinh dưỡng trực tiếp qua bề mặt tế bào

• - Kiểu dinh dưỡng đa dạng

• 3 Sự phân bố: nhưng hiện diện khắp nơi

• 4 Vai trò trong sinh quyển

• 4 Cường độ trao đổi chất mạnh và sinh sản nhanh

•

III KĨ THUẬT VÔ TRÙNG

• Kiểm soát sự tăng truởng cuả VSV (Control of

Microbial Grow) bao gồm nhiều biện pháp

như khử trùng (sterilisation), tẩy trùng (disinfection) và sát trùng (antiseptsis) Mục đích cuối cùng của kĩ thuật vô trùng là diệt

sạch các tế bào và bào tử của VSV trong môi trường ban đầu.

• Sự nhiễm trùng là mối đe dọa vô hình ở bất

cứ công đoạn hay quy trình CNSH nào, từ nghiên cứu đến sản xuất trên các đối tượng VSV, thực vật hay động vật.

Sự nhiễm VSV sẽ gây nhiều hậu quả :

– Chủng VSV sản xuất sẽ không thuần

– Cạnh tranh dinh dưỡng và làm biến đổi môi trường nuôi cấy, gây bất lợi cho sự phát triển của chủng VSV sản xuất, của tế bào thực vật và động vật trong nuôi cấy mô.

– Có thể tạo độc tố.

1 Thiết bị vô trùng

• Trong không khí có nhiều vi sinh vật và các bào tử của chúng, đây là nguồn nhiễm khi nuôi cấy các VSV, tế bào động, thực vật Các thao tác với đối

tượng nuôi cấy đều được thực hiện trong phòng vô

trùng hay phòng cấy

• Muốn cấy ít nhiễm, công việc tiến hành trong các phòng đặc biệt gọi là phòng vô trùng hay phòng cấy

và tủ cấy vô trùng Phòng vô trùng chuẩn thường có vách bằng thủy tinh trong suốt để các VSV và các bào tử khó bám, khó phát triển và dễ làm sạch bề mặt Đặc biệt, có thể dùng kính không dính bụi.

• Nguyên tắc chung là làm thế nào để khi cấy thì bầu không khí trong sạch, ít có vi sinh vật trong không khí Ngày nay có máy lọc không khí khỏi các VSV và bào tử nên có thể tiến hành thao tác cấy trong tủ trước luồng không khí vô trùng

• Những thí nghiệm cần điều kiện vô trùng tuyệt đối thì phòng được thổi khí vô trùng tạo áp suất cao bên trong phòng để khí từ ngoài không xâm nhập vào, trước khi vào phòng mỗi người phải qua phòng riêng tắm và mặc quần áo phủ kín toàn thân

2 Các phương pháp khử trùng

• Một vật được coi là vô trùng khi không còn

mang bất kì một sinh vật nào Thường các VSV và bào tử khó thấy nên khái niệm vô trùng dùng để chỉ sự vắng mặt hoàn toàn của chúng.

• Có nhiều phương pháp khử trùng, thường dùng là nhiệt độ cao, lọc, bức xạ và hoá học.

a) Nhiệt độ cao

• Đốt cháy : Dùng lửa đèn cồn hoặc gas đốt cháy các dụng cụ kim loại như que cấy, kẹp, kéo, dao.

• Nhiệt khô dùng để diệt trùng các dụng cụ

kim loại hay thủy tinh trong lò Pasteur

(1800C trong 30 phút hay 1600C trong 2 giơ)ø.

• Nước sôi diệt được các tế bào sinh dưỡng

• – Hơi nước bão hoà dưới áp suất cao sẽ cho nhiệt độ cao hơn 1000C như ở áp suất thường (1atm), áp suất hơi nước tương ứng với 1210C Dụng cụ để khử trùng thông dụng là nồi hấp áp suất (autoclave)

• – Hấp Pasteur (Pasteurisation) : Một số thực

phẩm như sữa ở nhiệt độ cao sẽ mất một phần phẩm chất, và phương pháp hấp Pasteur được sử dụng để khử trùng cho sữa (đun nóng 1 lần

ở 630C trong 30 phút hoặc ở 720C trong 15 giây)

b) Phương pháp lọc

• Dùng cho vật lỏng, trong và có độ nhạy tương đối yếu nhưng không chịu được nhiệt độ cao trên

600C Vật đem lọc qua một màng lọc xốp có những lỗ với đường kính nhỏ hơn đường kính của tế bào vi sinh vật nhỏ nhất Vi trùng sẽ bị giữ lại trên màng lọc còn dung dịch đi qua sẽ vô trùng.

• Màng xốp có thể bằng sứ, amiante, cellulose… Trong các phòng vô trùng hiện đại thường dùng màng bông thủy tinh lọc khí để hạn chế nhiễm.

c) Diệt trùng bằng bức xạ

• Tia tử ngoại (UV), tia X và các tia phóng xạ ion hoá như tia alpha, beta, gamma, … đều có khả năng diệt trùng Tia tử ngoại thường được dùng nhất trong diệt trùng không khí các bệnh viện hoặc các phòng cấy vi sinh vật Tia tử ngoại chỉ diệt trùng bề mặt, không thấm sâu vào phẩm vật

d) Phương pháp hoá học

ƒ Nhiều hoá chất có khả năng diệt trùng Rượu

cồn (trên 70o ) thường được dùng để sát trùng

ngoài da Oxyde ethylene thường dùng để khử

trùng các dụng cụ làm bằng plastic.

ƒ Ngoài ra, nhiều hoá chất khác nhau như

phenol, formaline,… cũng là những chất sát trùng có thể dùng khử trùng phòng cấy, cần lưu

ý một số chất sát trùng có tác dụng độc với người.

ƒ Có nhiều phương pháp khử trùng khác nhau

Tùy đối tượng, tùy tính chất công việc mà sử dụng phương pháp này hay phương pháp khác.

IV GIỮ GIỐNG VÀ CHỌN GIỐNG

• Giống là yếu tố quan trọng đầu tiên chi phối giá thành sản phẩm Công nghiệp VSV thành công lớn nhờ vào các giống có năng suất

cao

1 Bảo tàng giống

• Để có các chủng năng suất cao, công việc căn bản đầu tiên là thu thập rất nhiều chủng từ thiên nhiên, lập bộ sưu tập giống (culture collection) và giữ chúng trong các bảo tàng giống (museum) Các nước có công nghiệp VSV phát triển đều có bảo tàng giống lớn như ATCC (American Type Culture Collection − Mĩ),… Các bảo tàng lớn lưu giữ hàng trăm nghìn, thậm chí hàng triệu chủng đã được định danh và mô tả các đặc tính sinh học.

• Các chủng vi khuẩn thường được sấy thăng hoa (đông khô – lyophilization) trong các ống thủy tinh (ampule) hàn kín

và giữ trong nitrogen lỏng ở 192OC (ở nhiệt độ này trao đổi chất của tế bào hầu như dừng lại) Các chủng mốc và nấm giữ ở nhiệt độ lạnh Các hình sau minh hoạ một số công cụ dùng giữ giống của một Bảo tàng giống ở Nhật Bản.

2 Tầm soát giống

• Tầm soát có định hướng (goal-oriented screening) các chủng từ thiên nhiên hay bảo tàng giống là công việc cần thiết để tiến tới tạo ra giống sản xuất Trong CNSH, có nhiều ví dụ thành công điển hình trong tầm soát như :

• – Tìm ra chủng tạo penicillin đầu tiên tăng trưởng tốt trong bồn lên men khuấy (well-mixed fermenter) từ vết mốc trên trái bưởi ở Peoria (Illinois,Mĩ).

• – Chủng VSV đầu tiên sản sinh cephalosporin phân lập từ nước thải ở Sardinia.

• Đây là công việc phức tạp nên cần có sự phối hợp chặt

chẽ giữa các nhà VSV học, sinh học, hoá học và phải tiến hành qua nhiều bước Ví dụ như tầm soát chủng VSV sản sinh một loại enzyme cần qua 8 bưóc :

• 1) Chọn chủng VSV thích hợp nhất ; 2) Chủng này tạo

enzyme năng suất cao trong thời gian ngắn khi lên men

chìm ; 3) Chủng tạo enzyme từ cơ chất rẻ tiền ; 4) Tế

bào dễ tách khỏi dịch lên men ; 5) Enzyme ngoại bào thì

tốt hơn và dễ chiết tách khỏi dịch lên men ; 6) VSV không gây bệnh ; 7) Không tạo độc tố và các chất có hoạt tính sinh học khác ; 8) Chủng ổn định về mặt di truyền và kháng bacteriophage.

3 Chọn giống đột biến

• Các thành tựu của công nghiệp VSV không thể tách rời với những tiến bộ

nhảy vọt trong chọn lọc các chủng có

năng suất cao Các phương pháp chọn lọc

đột biến được ứng dụng vào chọn giống

làm tăng năng suất tạo các sản phẩm, làm biến đổi bản chất hoá học các chất và

khắc phục một số nhược điểm của chủng

được dùng trong sản xuất công nghiệp

• Phương pháp chọn giống này có

các đặc điểm :

• – Thu nhận kết quả rất nhanh.

• – Chỉ đánh giá sản phẩm thu

được, không quan tâm các biến đổi sinh lí, sinh hoá.

• Phương pháp chọn giống đột biến được sử dụng để tạo các chủng sản sinh ra nhiều amino acid (như glutamic acid) hay các nucleotide Ngoài ra còn có thể nhận các đột biến liên quan đến cơ chế điều hoà trao đổi chất :

• – Các đột biến cơ cấu (constitutive mutants) : tạo sản phẩm không cần chất cảm ứng (inducer).

• – Các đột biến kháng ức chế ngược là các đột biến tạo sản phẩm nhiều mà không bị ức chế bởi sản phẩm cuối (end product repression).

• Phương pháp này đã đem lại những thành tích ngoạn mục, góp phần tích cực cho sự phát triển của công nghiệp lên men vi sinh như :

• – Chủng Penicillium notatum Oxford sinh ra 5mg/l penicillin, tiếp theo chủng Penicillium chrysogenum

năng suất cao hơn và nay đạt 60000mg/l.

• – Chủng Corynebacterium glutamicum tạo glutamic

acid đạt 100g/l (ban đầu 20g/l).

• – Serratia marcescens sinh ra biotin đạt 600mg/l.

• – Siêu sản xuất riboflavin do 2 chủng nấm mốc

Eremothecium ashbyii và Ashbya gossypii với sản lượng

hơn 20g/l.

• Các chủng đột biến sản sinh một lượng chất lớn hơn rất nhiều so với nhu cầu của tế bào, thậm chí lớn hơn nhiều lần khối lượng khô của nó :

• - Ashbya gosspii sinh ra riboflavin gấp

40000 lần nhu cầu của nó

- Pseudomonas denitrificans sinh ra

vitamin B12 gấp 100000 lần nhu cầu của nó

4 Tạo các giống vi sinh vật nhờ kĩ

thuật di truyền

• E coli, Saccharomyces cerevisiae là những

đối tượng đầu tiên sử dụng KTDT để tạo

ra các chủng sản xuất các r-protein người,

tiếp đó là nhiều VSV khác.

V CÁC NHÓM VI SINH CÔNG

NGHIỆP CHỦ YẾU

• 1 Vi khuẩn lactic

Nguồn gốc của lên men lactic acid công nghiệp có từ năm 1857, khi L Pasteur

xuất bản cuốn sách “Mémoire sur la

fermentation applelée lactique” (Ghi nhớ

về sự lên men lactic) nổi tiếng của ông.

− Các đặc điểm sinh học gồm :

• + Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que,

không bào tử Căn cứ vào sự lên men lactic, có thể phân biệt 2 loại : vi khuẩn lên men lactic đồng hình và

dị hình Nhóm đồng hình gồm các loài : L casei, L plantarum, L delbrueckii ssp bulgaricus, L helveticus, Streptococcus thermophilus, Chúng tạo sản phẩm

chính chủ yếu là lactic acid Các chủng sản xuất trong công nghiệp thuộc loại này Nhóm dị hình sản sinh lactic acid và một số sản phẩm phụ khác như acetic

acid, ethanol, CO2 Chúng gồm các loài như L brevis,

L kefir, Leuconostoc lactis.

• + Vi khuẩn nhiệt trung và chịu nhiệt : Dãy

nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi

khuẩn lactic nhiệt trung (mesophilic) là 28

− 45oC và của vi khuẩn lactic chịu nhiệt

(thermophilic) là 45 − 62oC

• + Khá nhạy cảm với các acid : Sự lên men

lactic acid bị ức chế mạnh mẽ ở pH 5 và ngừng ở pH dưới 4,5, mặc dù vi khuẩn sản sinh lactic acid như sản phẩm biến dưỡng chính.

• + Vi khuẩn lactic là sinh vật kị khí không bắt

buộc Do đó, trong thực tế khi nồng độ

oxygen thấp thì hoạt động sống được duy trì bình thường, nhưng không bắt buộc luôn phải như vậy.

• + Vi khuẩn lactic có các nhu cầu dinh dưỡng

phức tạp : Các nhu cầu này bao gồm các

vitamin, amino acid và thậm chí là các peptide ngắn

• + Nguồn carbon là glucose, fructose,

lactose, maltose và sucrose Vài chủng vi

khuẩn lactic có thể sử dụng tinh bột như L

amylophilus và L amylovorus.

• − Các chủng sản xuất chủ yếu :

Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus, L bulgaricus.

2 Pseudomonas

• − Đặc điểm hình thái học chung cho

Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que,

di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử

• − Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không

lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen

• − Các ứng dụng của Pseudomonas :

• + Tích lũy polyester polyhydroxybutyrate (PHB) dự

trữ là một đặc tính quan trọng của các Pseudomonas

hiếu khí PHA (polyhydroxyalkanoate) được tạo ra

chủ yếu từ Pseudomonas oleovorans và Alcaligenes

eutropus.

• + Sản xuất protease chịu nhiệt và các lipase Lipase

P của P fluorescens và lipase CC của Candida

cylindrica được dùng nhiều nhất.

• + Một loại amylase dùng sản xuất các maltooligosaccharide từ tinh bột

• + Trifluoromethylbenzene bị hydroxyl hoá thành

diol tương ứng nhờ Pseudomonas putid Diol được tạo

ra từ toluen được dùng để sản xuất các chất trung gian chiral prostaglandin.

• + Một số chủng dùng sản xuất công nghiệp acrylamide

• + Pseudomonas putida tạo thành các alcohol có

hoạt tính quang học từ những cơ chất là achiral hoặc racemic, … , trong sự biến đổi acid isobutyric thành acid (S)-beta-hydroxybutyric

• + Ứng dụng tiềm ẩn nhờ khả năng phân giải nổi tiếng các hợp chất xenobiotic, đặc biệt là những chất hữu cơ bị halogen hoá, thuốc diệt cỏ, plastic, dung môi và những chất tẩy nhờn

Một số loài Pseudomonas phân giải glyphosate

của thuốc diệt cỏ.

• Pseudomonas syringae có một

protein màng làm nhân đông đá (ice nucleation) để nước dễ đóng băng Vi khuẩn này gây hại cho cây trồng, nhưng protein của nó được dùng làm tuyết nhân tạo.

3 Bacillus

Gram dương, hình que, có khả năng tạo nội bào tử, chịu nhiệt, hiếu khí Khoảng

150 loài cực đoan : chịu nhiệt, chịu lạnh,

ưa kiềm, ưa acid Một số loài có thể thực hiện chuyển hoá sinh học

• − Các ứng dụng chủ yếu :

• + Món ăn truyền thống của Nhật “itohiki – natto” đã có từ 400 năm, được chế biến từ đậu

nành dưới tác động của Bacillus natto (Bacillus

subtilis) Sản lượng 108kg/năm.

• + Bacillus thuringensis : thuốc trừ sâu vi sinh và nguồn gen Bt.

• B.licheniformis và B amyloliquefaciens : alpha

amylase chiu nhiệt.

• B alcalophilus : serine protease subtilin trong

bột giặt.