NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CHƯƠNG 7 ppt

• Lên men là sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất hữu ích cho con người trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật... • Một số môi trường phức tạp được pha chế bằng cách hoà tan các chất tự

•Chương 7

CÔNG NGHỆ LÊN MEN

•I.KHÁI QUÁT VỀ SỰ LÊN MEN CN

•II SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO

•III DINH DƯỠNG VÀ NGUYÊN LIỆU

• IV HỆ THỐNG THIẾT BỊ

• V VẬN HÀNH

• VI LÊN MEN CITRIC ACID

I KHÁI QUÁT VỀ SỰ LÊN MEN CÔNG NGHIỆP.

• 1 Sự lên men.

• Lên men là sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất

hữu ích cho con người trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật

• - Nuôi vi sinh vật với quy mô lớn (10 lit đến 1.000.000 lít) gọi là sự lên men công nghiệp (industrial fermentation).

2 Ưu thế của tế bào VSV

• – Kích thước nhỏ, hấp thu nhanh và đồng hóa ở

tốc độ cao.

• – Nguồn nguyên liệu đơn giản : phế phụ phẩm rẻ

tiền.

• – Chúng có thể thực hiện rất nhiều các phản

ứng hoá sinh khác nhau.

• – Thích ứng với thiết bị của nhà máy.

• – Dễ dàng sử dụng KTDT để tăng sản lượng và biến đổi sản phẩm cuối.

• – Có khả năng tạo các chất đối quang hay đối

hình (enantiomer)

•3 Sơ đồ tổng quát và ba

công đoạn chính

II SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ

BÀO

• 1 Tỉ lượng (Stoichiometry) của tế bào

• 2 Phản ứng tăng trưởng

• 3 Động học (Kinetics) của sự tăng trưởng

III NGUỒN DINH DƯỠNG VÀ

NGUYÊN LIỆU BAN ĐẦU

• 1 Môi trường tự nhiên và tổng hợp

• 2 Nước.

• 3 Nguồn carbon

• 4 Nguồn nitrogen.

5 Các nguyên tố khác và vitamin.

6 Các chất phá bọt.

1 Môi trường tự nhiên và tổng hợp

• Môi trường tự nhiên phức tạp khác với môi trường tổng hợp có nguồn gốc động, thực vật, thành phần hoá học

chính xác của các vật liệu này đến nay chưa biết hoặc xác định rất khó khăn

• Một số môi trường phức tạp được pha chế bằng cách hoà tan các chất tự nhiên và tiếp theo được xử liù bằng thủy giải, làm trong hay bổ sung các chất dinh dưỡng, kích thích tố tăng trưởng hay các nguyên tố vi lượng

Môi trường tổng hợp (synthetic) có thành phần xác

định.

2 Nước

• Chất lượng nước rất quan trọng trong sản xuất các sản

phẩm từ VSV Ví dụ : rượu bàu đá ngon nổi tiếng của

Bình Định chỉ có thể được sản xuất từ nước suối

BàuĐá (bàu có nghĩa một thủy vực).

• Trong sản xuất vaccine, nguồn nước phải qua

nhiều công đoạn làm tinh sạch, chưng cất 2 lần rồi mới được sử dụng để nuôi các chủng VSV.

• Lên men trong môi trường nước có ưu điểm là độ đồng nhất cao, dễ dàng theo dõi pH và nhiệt độ ;

nhược điểm là khi chiết suất sản phẩm thì tỉ lệ nước

cao gây tốn kém năng lượng và thời gian.

3 Nguồn carbon

• Trong sản xuất từ VSV, nguồn carbon chủ yếu là đường đơn như glucose,

oligosaccharide (lactose, saccharose) ;

những đường này thường từ nguyên liệu ban đầu là mật rỉ đường và thường được xử liù để có glucose

4 Nguồn nitrogen

Thông dụng nhất là cung cấp nitrogen vô cơ

dưới dạng muối ammonium (như ammonium

phosphate), nitrogen hữu cơ thường được cung cấp như amino acid hoặc sản phẩm thủy giải từ protein.

a Nguồn nitrogen tổng hợp : SA , DAP (Diammonium phosphate) , urê.

b Nguồn nitrogen tự nhiên : Nước chiết của bắp ( corn

stup liquor ) , cao bắp , có nhiều acid amin ( 15 loại ) ,

Cao nấm men,

5 Các nguyên tố khác và vitamin

• Ngoài nguồn C và N, môi trường dinh dưỡng

cần đủ các nguyên tố đa lượng và vi lượng khác như P, S, K, Na, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, Co,…

Ngoài các vitamin có sẵn trong cơ chất ban đầu, trong một số quy trình cần bổ sung vitamin như

biotin.

6 Các chất phá bọt

• Trong quá trình sục khí, bọt tạo ra nhiều lớp ngăn cách không khí Các chất phá bọt

thường dùng là các loại dầu : dầu dừa, dầu đậu

nành, dầu hướng dương, dầu hạt cải, dầu cá

không có mùi, dầu silicol 1% Dầu phải đạt yêu

cầu : hoạt tính phá bọt cao, mùi dễ chịu, màu

sáng và không có tạp chất.

IV HỆ THỐNG THIẾT BỊ

• 1 Các thiết bị trước lên men.

• 2 Nhu cầu oxygen và các kiểu lên men

• 3 Bioreactor (Bồn lên men

-fermentor)

• 4 Các thiết bị sau lên men.

Các kiểu lên men :

• – Lên men bề mặt : Môi trường lỏng chứa trong khay

với với chiều sâu không quá 5cm và tế bào mọc lớp

trên bề mặt tiếp xúc trực tiếp với không khí.

• – Nuôi cấy lắc dùng trong phòng thí nghiệm, oxygen

cung cấp cho môi trường bị khuấy trộn nhờ máy lắc.

• – Lên men bán rắn : Cơ chất rắn ẩm để lớp mỏng trên

khay.

• – Lên men chìm (submerged fermentation) là kiểu lên

men chủ yếu trong công nghiệp.

3 Bioreactor

• Bioreactor (fermenter) là vật chứa (vessel) các tế bào, chiết xuất tế bào hay các enzyme thực hiện phản ứng sinh học

• Đây là thiết bị có dung tích từ 10-100 lít đến

100000 lít, được làm bằng thép không rỉ, có hệ thống đo lường và điều chỉnh nhiệt độ, pH và

oxygen hoà tan Bioreactor thường có hình trụ với một hệ thống cánh quạt như chân vịt tàu

thủy nhằm trộn đều và cung cấp oxygen.

Hệ thống nhân giống đến bioreactor 100m3

• Mẫu bioreactor phải thỏa mãn các đòi hỏi khác như sau :

• – Các vật cản : làm tăng hiệu quả khuấy.

• – Kiểm soát phá bọt : tự động việc phá bọt.

• – Kiểm soát nhiệt độ : mật độ tế bào tăng lên,

nhiệt tỏa ra và nước lạnh được lưu thông trong các vòng trao đổi nhiệt hay vỏ bọc bồn lên men.

• – Kiểm soát pH : giữ pH ổn định.

• – Các cửa phụ : bổ sung tế bào nuôi và các chất

môi trường.

4 Các thiết bị sau lên men

• – Thiết bị tách tế bào : Các bồn lắng, các

loại máy li tâm, bộ lọc ép hoặc lọc chân

không trống quay Đây là các thiết bị

thường sử dụng trong công nghệ thực

phẩm.

• – Thiết bị phá vỡ tế bào : Dùng thu nhận các sản phẩm nội bào.

• – Thiết bị cô đặc : Làm bốc hơi, lọc màng,

trao đổi ion, hấp thu.

• – Thiết bị dùng cho phản ứng tạo sản

phẩm.

• – Thiết bị kết tinh dùng cho một số sản

phẩm như bột ngọt (monosodium

glutamate – MSG), citric acid

• – Sắc kí dùng cho tinh chế sản phẩm

• − Thiết bị sấy.

• – Các thiết bị để chế biến và bảo quản sản phẩm như rửa, sấy

V VẬN HANH QUY TRÌNH LEN

MEN

•

Hệ thống nhân giống trong phòng thí nghiệm với các bioreactor 10 lít − 20 lít

2 Các thông số kiõ thuật của

bioreactor

• Điều cần thiết là phải theo dõi và kiểm soát các

thông số nuôi cấy như lượng oxygen hoà tan, pH,

nhiệt độ và sự khuấy trộn trong quá trình nuôi

cấy Sự thay đổi các thông số này có ảnh hưởng lớn đến quá trình tạo thành sản phẩm và ổn

định hoạt tính sản phẩm.

3 Các phương thức lên men

• Cung cấp môi trường dinh dưỡng theo nhiều phương thức khác nhau.

• – Lên men gián đoạn hay từng mẻ (Bath

fermentation) Đây là dạng lên men được sử dụng đầu tiên khi bắt đầu có công nghiệp lên

men Môi trường nuôi cho một lần vào bồn lên

men, cấy giống và thực hiện lên men đến thu sản phẩm

• Xong một mẻ hay một đợt như vậy, làm lại mẻ mới.

− Lên men gián đoạn bổ sung (fed-bath fermentation) dinh dưỡng : Khi dinh dưỡng giảm, có thể bổ sung thêm

• − Lên men liên tục (Continuous fermentation) :

Trong quá trình lên men, nguồn dinh dưỡng đầu

vào được bổ sung liên tục và dịch lên men (gồm các tế bào và sản phẩm tạo ra) được lấy bớt ra

liên tục và như vậy tạo được cân bằng hợp liù

• Phương thức này làm cho các điều kiện trong

bioreactor luôn ở trạng thái ổn định, sản phẩm tạo

ra tốt hơn Môi trường đi ra có thể để lắng tế bào rồi lấy bổ sung lại

• Một ưu thế khác là không phải nhân giống lại sau

mỗi mẻ và thời gian lên men có thể kéo dài hơn.

Lên men liên tục Lên men liên tục để lắng tế

bào và bổ sung

4 Điều khiển phản ứng sinh học

• Thông thường, quá trình nuôi trải qua 2 giai

đoạn đòi hỏi những điều kiện khác nhau Ở giai

đoạn đầu cần các điều kiện cho tế bào sinh sản

nhanh, nhiều để tạo sinh khối (biomass) lớn Ở

giai đoạn sau các tế bào được khống chế để thực

hiện tối đa các phản ứng mong muốn

5 Thu sản phẩm và tinh chế

• Thu sản phẩm là công việc tốn kém Chi phí này chiếm

tơí 50% giá thành hoặc cao hơn Các kiõ thuật của công

nghệ hoá học, công nghệ thực phẩm được sử dụng chủ

yếu ở bước này Khó khăn lớn đầu tiên là tách nước

của tế bào ra khỏi sản phẩm Tiếp theo, từ dịch lên

men thu đúng sản phẩm mong muốn.

• Tất cả các bước liên quan chặt chẽ với nhau,

nhưng các bước đầu đa dạng, biến hoá và khó kiểm soát,

vì tế bào rất nhạy với những thay đổi của ngoại cảnh dù rất nhỏ

VI QUY TRÌNH SẢN XUẤT

CITRIC ACID

• Quá trình sản xuất citric acid thương phẩm sẽ giúp hình dung rõ

hơn về CNLM Citric acid là acid hữu cơ chính xếp thứ hai trong các sản phẩm của công nghiệp lên men, chỉ sau ethanol công

nghiệp Sản lượng trên thế giới ước tính khoảng 700000 tấn/năm.

• 1 Các đặc điểm của lên men citric acid

• – Chủng giống : Aspergillus niger là nấm sợi tạo nhiều bào tử màu đen, thích nghi pH thấp (2,5 − 3,5) và nhu

cầu tiêu thụ oxygen cao Bào tử được sử dụng trong nhân giống Đa số các chủng sản xuất cho sản lượng đạt trên 90% so với lượng glucose nguyên liệu.

(1) Sinh khối vi sinh vật : sản xuất chính là sinh khối

nấm men làm bánh mì và protein đơn bào.

• (2) Enzyme vi sinh vật : enzyme vi sinh vật có ưu điểm là

được sản xuất với số lượng rất lớn, nhanh nhờ kỹ thuật

lên men.

• Các enzyme từ VSV phổ biến : amylase,

• β-glucanase, amyloglycosidase, glucose isomerase,

glucose oxidase, cellulase, hemicellulase, pectinase,

invertase, protease, lactase, lipase, streptokinase…

•NĂM NHÓM SẢN PHẨM :

• -Sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và cuối:

• các amino acid, nucleotide, lactic acid, acetic

acid, ethanol,

• - Sản phẩm thứ cấp : kháng sinh, chất ức chế

enzyme, alkaloid,

(3) Sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật : các chất

trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp

• (4) Sản phẩm tái tổ hợp: nhờ kỹ thuật di

truyền : các gene từ sinh vật cấp cao có thể chuyển vào các vi sinh vật nhận có khả năng tổng hợp protein lạ.

• (5) Quá trình biến đổi vật chất (chuyển hóa

sinh học): tế bào vi sinh vật được sử dụng

chuyển đổi một chất thành chất khác có

cấu trúc liên quan và có giá trị thương mại cao hơn.

CHƯƠNG VIII

CÁC SẢN PHẨM CỦA CÔNG NGHỆ

LÊN MEN

• I TỔNG QUAN VỀ CÁC SẢN PHẨM CỦA CNLM

• II SẢN XUẤT SINH KHỐI VI SINH VẬT

• III CÔNG NGHIỆP VACCINE

• IV PROTEIN ĐƠN BÀO (SCP)

• V CÔNG NGHIỆP RƯỢU BIA VÀ CỒN NHIÊN LIỆU

• VI CÁC METABOLITE SƠ CẤP

• VII CÔNG NGHỆ THUỐC KHÁNG SINH (ANTIBIOTICS)

• VIII CHUYỂN HOÁ SINH HỌC

• IX CÁC BIOPOLYMER VÀ BIOSURFACTANT

• X CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHAI KHOÁNG

I TỔNG QUAN VỀ CÁC SẢN

PHẨM CỦA CNLM

1 Các nhóm sản phẩm căn bản

• a) Sinh khối vi sinh vật : Gồm giống ban đầu cho sản xuất, nấm men bánh mì và men chăn nuôi, vaccine, protein đơn bào, phân vi sinh, chế phẩm diệt côn trùng, probiotic.

• b) Enzyme vi sinh vật : Phổ biến hiện nay là amylase, β-glucanase, amyloglycosidase, glucose isomerase, glucose oxidase, cellulase, hemicellulase, pectinase, invertase, protease, lactase, lipase, streptokinase…

α-• c) Các sản phẩm trao đổi chất : Gồm các sản phẩm sơ cấp và thứ cấp Sản phẩm sơ cấp gồm rượu bia, amino acid, acid

hữu cơ, nucleotide, vitamin,…

• Sản phẩm thứ cấp gồm thuốc kháng sinh, lipid VSV, sidephore, các chất tăng trưởng và chất có hoạt tính sinh học.

• d) Sản phẩm tái tổ hợp gen : Các r-protein và các sản phẩm khác được tạo ra nhờ các tế bào vi sinh vật chuyển gen.

• e) Sản phẩm của chuyển hoá sinh học gồm các steroid, vitamin C, acrylamide,… được sản xuất bằng tế bào VSV hoặc enzyme.

• f) Các biopolymer và biosurfactant : Các polysacchride ngoại bào như xanthan, gellan, alginat vi sinh, celluose vi khuẩn,… và các chất hoạt động bề mặt (biosurfactant) được sản xuất bằng CNLM.

II SẢN XUẤT SINH KHỐI VI SINH VẬT

1 Giống ban đầu cho các quy trình lên men vi sinh vật

Khâu này phải đảm bảo 2 điều kiện :

• − Đủ số lượng tế bào cần thiết.

• − Các tế bào có số lượng lớn nhưng hoạt tính không thay đổi.

Trong đa số quy trình, các tế bào sinh sản tốt trong điều kiện thổi khí đủ Tuy nhiên, trong một số trường hợp tế bào lên men yếm khí, nếu thổi khí mạnh tế bào sinh sản nhanh có thể sản phẩm kém chất lượng

2 Sản xuất men bánh mì

Men bánh mì thực chất là sinh khối tế bào

nấm men Saccharomyces cerevisiae được nuôi

trong môi trường giàu đường (mật rỉ đường) có bổ sung phosphore và ammonium như DAP (diammonium phosphate), urea,…

3 Phân vi sinh (Microbial Fertilizer)

• – Phân vi khuẩn Rhizobium : Đây là vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với rễ cây (có trong

nốt sần của cây họ Đậu) Ngoài Rhizobium

cộïng sinh, người ta còn sử dụng các vi khuẩn

cố định đạm dạng tự do như Azospirillum ở rễ

cây lúa.

• – Phân vi sinh hỗn hợp gồm nhiều tác dụng như phân hủy phức hợp lignocellulose, cố định đạm không khí, làm tan các hợp chất phosphore để cây trồng dễ hấp thu,…

4 Chế phẩm diệt côn trùng

(Insecticides)

• Có nhiều vi khuẩn và virus gây bệnh và diệt côn

trùng 3 loài vi khuẩn hiện được dùng làm chế phẩm

diệt côn trùng là Bacillus thuringiensis (BT), B

sphaericus và B popilliae

• Vi khuẩn BT có thể nuôi trong bioreactor dễ dàng và nó tạo bào tử chứa protein tinh thể nội độc tố (δ-

endotoxin) diệt côn trùng.

• Nhiều chủng B thuringiensis tạo độc tố có hoạt tính diệt các loài Lepidoptera (bướm và bướm đêm),

Diptera (ruồi, muỗi mắt (midges) và muỗi) hay

Coleoptera (bọ cánh cứng).

5 Probiotic (Chế phẩm trợ sinh)

Probiotic, hay còn gọi là chế phẩm trợ sinh, chứa

các VSV sống (vô hại hoặc có lợi) có tác dụng làm cải thiện cân bằng VSV trên cơ thể vật chủ.

Probiotic tác dụng theo 4 cơ chế chủ yếu:

1) Trung hoà độc tố

2) Cạnh tranh với mầm bệnh

3) Thay đổi chuyển hoá của VSV

4) Kích thích tính miễn dịch của chủ thể

III CÔNG NGHIỆP VACCINE

• Ở các nước đang phát triển, bệnh truyền

nhiễm vẫn chiếm 30 – 50 % các trường hợp

tử vong Các vaccine là công cụ quan trọng

và có hiệu quả nhất để chống lại chúng.

1 Các loại vaccine

a) Vaccine cổ điển

• − Vaccine vi khuẩn chết : Ho gà, Sốt thương

hàn.

• − Độc tố vi khuẩn bất hoạt : Bạch hầu, Uốn ván.

• − Vaccine virus sống : Bại liệt, Quai bị, Sởi,

Rubella, Sốt vàng da.

• − Vaccine virus bất hoạt : Cúm.

b) Vaccine công nghệ gen

• − Vaccine tái tổ hợp : Viêm gan B.

2 Vaccine cổ điển

a) a) Có 2 loại vaccin cổ điển

• − Vaccine sống chứa các chủng vi khuẩn hay virus bị

làm yếu Nó được sản xuất từ sinh khối vi khuẩn và sau đó xử lí bằng nhiệt, bằng muối nồng độ cao hoặc formalin để tế bào yếu đi và có thể chết, khi tiêm nó vào cơ thể sẽ kích thích tạo kháng thể Những chủng yếu như vậy phần lớn nhận được qua các quá trình làm hoàn toàn theo kinh nghiệm

• − Vaccine chết gồm hoặc là những tế bào nguyên

vẹn của vi khuẩn bị làm chết hoặc là các protein độc tố bị bất hoạt (được gọi là các giải độc tố – toxoid).

b) Những vấn đề của vaccine cổ điển

• – Trước hết là mối nguy hiểm của việc phục

hồi tình trạng gây bệnh.

• – Nguy hiểm khác là các virus dùng trong

vacccine cổ điển phải cho phát triển trên các tế bào nuôi cấy có thể đã nhiễm sẵn các virus khác

• – Một hạn chế khác là ngay cả các tác nhân gây bệnh bị làm yếu cũng có thể gây bệnh cho người có hệ miễn dịch suy yếu

• – Rắc rối chính của loại vaccine cổ điển

chết là chúng có khả năng gây những phản

ứng phụ trầm trọng.– Có khả năng các VSV hay các độc tố trong vaccine chưa bị diệt hay bất hoạt hoàn toàn và có thể gây hại cho người

3 Vaccine công nghệ gen

• Sự phát triển công nghệ gen đã tạo khả năng sản xuất các loại vaccine mới, vaccine công nghệ gen Một số

nhằm vào những mục tiêu mới, một số khác chỉ đơn giản là làm cho vaccine cổ điển hiệu quả hơn và ít gây phản ứng phụ

• Vaccine cổ điển là những sản phẩm của tác nhân gây bệnh, hoặc là VSV sống hoặc là chất tiết cuả chúng Ngược lại, vaccine mới được sản xuất bởi những vi

sinh vật an toàn, không gây bệnh như E coli hay nấm

men và có thể sản xuất chúng cả khi tác nhân gây

bệnh không thể nuôi cấy