Ứng dụng công nghệ chăm sóc sức khỏe con người

Ứng dụng công nghệ chăm sóc sức khỏe con người

Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

Khoa Công Nghệ Sinh Học

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ GENE TRONG CHĂM SÓC

SỨC KHỎE NGƯỜI

Giảng viên: TS TRẦN HOÀNG DŨNG

Tháng 04/2012

Chương 1 CẤU TRÚC GENE, SỰ BIỂU HIỆN GENE VÀ CƠ SỞ

PHÂN TỬ CỦA DI TRUYỀN

1. GIỚI THIỆU

Từ khi thuật ngữ “gene” được đặt ra bởi nhà thực vật học Đan Mạch WilhelmJohannsen vào năm 1909, khái niệm gen được mở ra Lúc đầu, gen được cho là mộtthực thể trừu tượng không có một ý nghĩa vật chất – cấu trúc nào Nó có ý nghĩa đốivới những nhà tự nhiên học quan tâm đến sự di truyền của những biến đổi có lợicung cấp vật liệu cho tiến hóa

Vào những năm đầu thập niên 50, thí nghiệm của Seymour Benzer trên locusrII của T4 bacteriophage đã giúp định nghĩa gene dưới dạng một đơn vị chức năng,gọi là “cistron” Khái niệm cistron mô tả cistron là một chuỗi DNA liên tục mã hóacho một polypeptide thông qua sự phiên mã ra RNA Nghiên cứu sâu hơn củaCharles Yahofsky và Harvey Itano đã cho ra giả thuyết “1 cistron-1 polypeptide”.Khái niệm gene-protein được xác định độc lập bởi Sydney Brenner và CharlesYanofsky và mô hình operon do Francois Jacob và Jacques Monod đưa ra vàonhững năm đầu thập niên 60 cũng tán thành khái niệm cistron này Mô hình operongiải thích sự phiên mã một cistron được điều hòa như thế nào, trong khi mô hìnhgene-protein chứng minh rằng một đột biến trên gene (cistron) gây ra sự biến đổitrình tự amino acid trên protein Vì vậy, mô hình điều hòa sự biểu hiện cistron (gene)thông qua tương tác promoter-operator đã giúp thống nhất những khía cạnh về cấutrúc và chức năng của gene thành một khái niệm gene duy nhất

Khái niệm gene này đã được xem xét một lần nữa thông qua những khám pháđộc lập được công bố vào năm 1977 bởi Phillip Sharp và Richard Roberts, theo sau

đó là một chuỗi những công bố tương tự Những khám phá này chứng minh rằnggene không nhất thiết tồn tại như là một chuỗi DNA liên tục mà nó còn có thể tồntại một cách ngắt quãng: vùng mã hóa của một gene (cistron) bị ngắt quãng bởinhững trình tự không mã hóa xen kẽ (intron) Gene được phiên mã cho ra một chuỗidài gọi là “heterogeneous nuclear RNA” (hnRNA) hay “tiền-mRNA” (pre-mRNA).Việc xử lý những “tiền-mRNA” liên quan đến ba sự kiện: gắn mũ chụp (capping),polyadenyl hóa và cắt nối (splicing) Gắn mũ chụp là gắn thêm một cái “mũ” (m7G)vào base đầu tiên của mRNA ở đầu 5′; polyadenyl hóa là việc gắn thêm một chuỗidài các nucleotide Adenyl (khoảng 200-250 ở eukaryote) vào đầu 3′ của mRNA; vàcắt nối (splicing) là việc loại bỏ các đoạn intron tạo thành mRNA trưởng thành.Những vùng gene có hiện diện trên tiên-mRNA mà không hiện diện trên mRNAtrưởng thành được gọi là “intron”, những đoạn hiện diện trên mRNA trưởng thànhgọi là “exon” Thuật ngữ exon và intron được đưa ra bởi Walter Gilbert

Sự phát triển của khái niệm gene từng phần (gồm exon và intron) trên đãkhông làm mất đi khái niệm cistron, nó vẫn đúng đối với những gene không có

intron như ở những gene prokaryote và một số eukaryote Thuật ngữ “cistron” hiệnnay đã được thay thế bằng thuật ngữ “khung đọc mở” (ORF).

Cùng với sự hiểu biết ngày càng cao về cấu trúc và chức năng của gene, quátrình và sự điều hòa phiên mã, sau phiên mã, dịch mã và sau dịch mã, đã có nhiềukhám phá đầy bất ngờ, thách thức khái niệm gene từng phần Một vài trong sốnhững khám phá này như gene tái cấu trúc, promoter khác thường, những giai đoạnkhác nhau của sự cắt nối khác thường bao gồm cả những exon bên cạnh intron, genechồng lấp (nested genes), trans-splicing mRNA, sự sắp xếp RNA (RNA editing) vàcắt nối protein (protein splicing) đã nhấn mạnh hơn nữa tính lưu động của cấu trúcgene eukaryote vượt qua khỏi mô hình exon-intron Quan điểm truyền thống về sựtương ứng một đối một giữa gene, mRNA và trình tự polypeptide đã không còn làmột chủ đề phổ biến nữa; nó có thể thích hợp với nhiều gen eukaryote nhưng khôngphải tất cả

Mặc dù có nhiều ngoại lệ đối với quan hệ giữa trình tự polypeptide, mô hình exon-intron vẫn là mô hình chủ yếu trong việc tìm hiểu cấutrúc phân tử và chức năng của những gene eukaryote Bài tiểu luận này sẽ thảo luận

gene-mRNA-về cấu trúc của gene eukaryote điển hình và sự biểu hiện của chúng

2. CẤU TRÚC GENE

Có thể định nghĩa một gene là toàn bộ trình tự nucleic acid cần cho sự tổnghợp một phân tử sản phẩm có chức năng (polypeptide hay RNA) Dựa vào địnhnghĩa này, một gen bao gồm nhiều hơn những đoạn nucleotide mã hóa cho trình tựacid amin của một protein Một gen bao gồm cả những trình tự DNA cần cho việctổng hợp một phân tử RNA Ở những gen eukaryote, những vùng điều khiển phiên

mã được gọi là enhancer có thể nằm ở vị trí cách vùng mã hóa 50 kb hoặc hơn.Những vùng không mã hóa quan trọng khác ở eukaryote là những trình tự đánh dấu

sự cắt ở đầu 3′ và sự polyadenyl hóa, gọi là vùng poly (A), và đánh dấu sự cắt nối(splicing) những đoạn RNA phiên mã, được gọi là vùng cắt nối Đột biến trênnhững tín hiệu chế biến RNA này làm ngăn chặn sự biểu hiện của một mRNA chứcnăng và do đó ngăn chặn biểu hiện ra polypeptide Mặc dù hầu hết các gene đềuđược phiên mã ra mRNA mã hóa cho protein, tuy nhiên rõ ràng là một số trình tựDNA được phiên mã thành những RNA không mã hóa cho protein (ví dụ, tRNA vàrRNA) Tuy nhiên, vì những DNA mã hóa cho tRNA và rRNA có thể gây ra nhữngkiểu hình đặc biệt khi nó bị đột biến, nên những vùng DNA này thường được quy làgene tRNA và rRNA, mặc dù sản phẩm cuối cùng của chúng không phải là protein.Ngoài ra còn có nhiều loại RNA khác cũng được phiên mã từ gene không mã hóaprotein

2.1.Monocistron – Polycistron

Những phân tử mRNA ở vi khuẩn đều là polycistron, nghĩa là một phân tửmRNA (ví dụ mRNA mã hóa từ operon Trp) chứa vùng mã hóa cho một vài proteinhoạt động với nhau trong cùng một quá trình sinh học Ngược lại, hầu hết mRNA ở

eukaryote đều là monocistron, nghĩa là mỗi phân tử mRNA chỉ mã hóa cho mộtprotein duy nhất Sự khác nhau giữa các mRNA monocistron và polycistron nàytương ứng với sự khác nhau cơ bản trong quá trình dịch mã của chúng (sẽ được nói

rõ ở các phần sau)

Trong một phân tử mRNA polycistron ở vi khuẩn, vùng gắn ribosome nằm ởgần vị trí bắt đầu vùng mã hóa protein, hay những cistron trong mRNA Sự khởi sựdịch mã có thể bắt đầu tại bất cứ vị trí nào trong những vị trí này, sản xuất ra nhiềuloại protein khác nhau (hình 1a) Tuy nhiên đối với hầu hết những mRNAeukaryote, cấu trúc đầu mũ chụp 5′ chỉ thị cho sự gắn vào của ribosome và dịch mãbắt đầu tại vị trí codon AUG gần nhất (hình 1b)

Hình 1: So sánh cấu trúc gene, sự phiên mã và dịch mã ở prokaryote và

eukaryote (a) Operon tryptophan (tryp) ở E.coli gồm 5 gene (màu xanh dương) mã hóa cho những enzyme cần thiết cho sự tổng hợp tryptophan Toàn bộ operon được phiên mã từ một promoter thành một phân tử mRNA dài và liên tục (màu đỏ) Sự dịch mã mRNA này bắt đầu tại 5 vùng khác nhau, tạo ra 5 protein khác nhau (màu xanh lá) Trật tự của các gene này trong nhiễn sắc thể của vi khuẩn song song tương ứng với thứ tự chức năng liên tiếp của các protein được mã hóa trong con đường tổng hợp tryptophan.

(b) 5 gene mã hóa cho các enzyme cần cho quá trình tổng hợp tryptophan ở nấm men (Saccharomyces cerevisiae) nằm trên 4 nhiễm sắc thể khác nhau (IV, V, VII và XI) Mỗi gene được phiên mã từ promoter của chính nó tạo ra đoạn phiên mã

sơ cấp được chế biến thành phân tử mRNA chức năng mã hóa cho ra một protein đơn lẻ Chiều dài của các nhiễm sắc thể trên được thể hiện ở bên phải và tính bằng kilobase (10 3 base).

2.2.Intron – Exon

Khác với những gene không chứa intron ở vi khuẩn và nấm men, hầu hết nhữnggene ở động vật và thực vật đa bào đều chứa những đoạn intron được loại bỏ trongsuốt quá trình chế biến mRNA Trong nhiều trường hợp, những đoạn intron trong mộtgene dài hơn đáng kể so với exon Ví dụ, trong một gene mã hóa cho một protein cókích thước trung bình chứa khoảng 50.000 cặp base, hơn 95% là intron và nhữngvùng không mã hóa ở đầu 5′ và 3′ Nhiều phân tử protein lớn ở những sinh vật bậccao có những domain lặp lại, được mã hóa bởi những gen bao gồm những đoạn exontương tự lặp đi lặp lại và xen kẽ bởi những đoạn intron có chiều dài biến thiên

2.3.Sự tổ chức các gene và DNA không mã hóa trên nhiễm sắc thể

Bộ gene của nhiều sinh vật chứa rất nhiều DNA không chức năng So sánhban đầu trên tổng DNA nhiễm sắc thể trong mỗi tế bào ở nhiều loài gợi ý rằng đa sốDNA ở các sinh vật không mã hóa cho RNA hay có bất kỳ một chức năng cấu trúchay điều hòa nào rõ ràng Ví dụ ở nấm men, ruồi giấm, gà và người được nhận thấy

là có lượng DNA trong bộ nhiễm sắc thể tương ứng với cấp độ phức tạp của chúng(lượng DNA lần lượt là 12; 180; 1300; và 3300 Mb) Tuy nhiên, trong số động vật

có xương, những loài có lượng DNA trong mỗi tế bào lớn nhất lại là lưỡng cư những loài chắc chắn là ít phức tạp hơn so với người cả về cấu trúc lẫn hành vi Rấtnhiều loài thực vật cũng có số lượng DNA nhiều hơn đáng kể so với người Ví dụnhư tulip có số lượng DNA gấp 10 lần so với người Ngoài ra, lượng DNA trongmỗi tế bào cũng biến thiên đáng kể giữa những loài có quan hệ gần gũi với nhau.Việc giải trình tự và xác định chi tiết các đoạn exon trên DNA nhiễm sắc thể

-đã chứng minh rằng bộ gen của những sinh vật eukaryote bậc cao chứa lượng lớnDNA không mã hóa Ví dụ như, chỉ một phần nhỏ (khoảng 80 kb) trên cụm gene β-globin ở người là mã hóa cho protein (hình 2) Hơn nữa, so với những vùng DNAkhác ở động vật có xương, cụm gene β-globin thường giàu những trình tự mã hóacho protein, và những đoạn intron trên gene globin ngắn hơn đáng kể so với nhữngđoạn intron trên nhiều gene khác ở người Ngược lại, một đoạn DNA 80 kb ở nấm

men S cerevisiae chứa nhiều trình tự mã hóa gần nhau, rất ít intron và DNA không

mã hóa Mật độ gene biến thiên rất lớn giữa những vùng DNA nhiễm sắc thể ngườikhác nhau, từ những vùng “giàu gene” như cụm gene β-globin cho đến những vùng

“sa mạc” nghèo gene Trong số 94% DNA bộ gene người được giải trình tự, chỉkhoảng 1,5% là tương ứng với các trình tự mã hóa protein (các đoạn exon) Hầu hếtcác đoạn exon ở người chứa từ 50-200 cặp base mặc dù đoạn exon ở đầu 3’ ở nhiềuđơn vị phiên mã dài hơn nhiều Độ dài những đoạn intron ở người cũng biến thiênđáng kể: nhiều đoạn dài khoảng 90 cặp base, một số khác thường dài hơn rất nhiều,trung bình 3,3 kb Xấp xỉ 1/3 DNA bộ gene người được cho là được phiên mã thànhnhững đoạn tiền-mRNA, nhưng khoảng 95% những trình tự này đều là intron, đượcloại bỏ trong quá trình cắt nối RNA

Hình 2: So sánh mật độ gene trên một vùng ≈ 80 kb ở người và nấm men [Phần (a), xem F S Collins và S M Weissman, 1984, Prog Nucl Acid Res

Mol Biol 31:315; phần (b), xem S.G Oliver và cs, 1992, Nature 357:28.]

Sự khác nhau đáng kể về lượng DNA không chức năng ở những sinh vật đơnbào và đa bào có thể là do những áp lực chọn lọc khác nhau trong suốt quá trình tiếnhóa Ví dụ như, những vi sinh vật cần phải cạnh tranh lượng chất dinh dưỡng cógiới hạn trong môi trường, do đó việc kiểm soát trao đổi chất là một đặc điểm thenchốt Vì sự tổng hợp DNA không chức năng cần có nhiều thời gian và năng lượngcho nên có lẽ đã có áp lực chọn lọc để loại bỏ DNA không chức năng trong suốt quátrình tiến hóa của vi sinh vật Mặt khác, chọn lọc tự nhiên ở những loài động vật cóxương phần lớn dựa vào hành vi của chúng Năng lượng đầu tư vào việc tổng hợpDNA là không đáng kể so với năng lượng trao đổi chất cần cho sự vận động của cácbắp cơ; do đó có rất ít áp lực chọn lọc để loại bỏ DNA không chức năng này

2.4.Cấu trúc gene mã hóa protein điển hình ở eukaryote

Cấu trúc của một gene mã hóa protein điển hình ở eukaryote được minh họa ởhình dưới đây Có 3 phần chính: một vùng cánh 5′ (5′-flank) ở đầu 5′ của gene; mộtvùng được phiên mã ở giữa; và một vùng cánh 3′ (3' -flank) ở đầu 3′ của gene.Promoter nằm ở đầu 5′ của gene

Hình 3: Cấu trúc một gene eukaryote điển hình Trên hình thể hiện mạch sense, mạch khuôn, TATA box, vị trí mũ chụp (vị trí bắt đầu phiên mã), tín hiệu poly(A) (AATAAA ở DNA và AAUAAA ở RNA), vị trí cho và nhận sự ghép nối trên intron (GT…AG ở DNA; GU…AG ở RNA), cũng như quá trình chế biến tiền-mRNA Trên hình cho thấy đoạn exon 1 và một phần nhỏ ở đầu 5′ của đoạn exon 2 là những đoạn không mã hóa, do đó chúng cấu tạo nên 5'- UTR.

2.4.1 Vùng được phiên mã

Vùng phiên mã của một gene gồm 3 phần: một vùng 5′ không được dịch mã(5′-UTR – 5′ -untranslated region), một vùng mã hóa amino acid (còn được gọi làkhung đọc mở hay ORF), và vùng 3′ không được dịch mã (3′-UTR)

Đối với bất kỳ một gene nào, chỉ một trong hai mạch của DNA là được phiên

mã Mạch được phiên mã được gọi là mạch khuôn (template) hay mạch antisense.Mạch không được phiên mã kia được gọi là mạch sense vì hai lý do: đầu tiên, trình

tự của những base trong mạch không phiên mã tương tự như trình tự base ở mRNA(ngoại trừ T ở DNA thay vì U ở RNA) cho nên trình tự những codon ở mRNA đượcphản ánh ở trình tự base của mạch không phiên mã; thứ hai, tính phân cực 5′ →3′ ởmạch không phiên mã cũng tương tự như mRNA Tất cả những gene nằm trên cùngmột DNA nhiễm sắc thể có thể sẽ không được phiên mã từ cùng một mạch DNA.Đối với một vài gene, một mạch có thể là mạch khuôn, trong khi đối với nhữnggene khác, mạch kia có thể là mạch khuôn Do sự phiên mã luôn diễn ra theo chiều

5′→3′, và do mạch DNA khuôn và RNA được tổng hợp từ nó là đối song song, nên

vị trí của promoter tự động xác định mạch nào của DNA có thể được dùng làmmạch khuôn cho sự phiên mã

Sự biểu hiện đầu và 3′-UTR có liên quan đến cả mRNA và gene Vùng UTR của một gene (và mRNA) là toàn bộ trình tự từ vị trí bắt đầu phiên mã (vùng

5′-mũ chụp) cho đến nucleotide trước codon khởi sự dịch mã (ATG ở mạch khôngphiên mã – sense strand của DNA; AUG ở mRNA) Tương tự, vùng 3′-UTR củamột gene (và mRNA) là toàn bộ trình tự bắt đầu sau codon kết thúc dịch mã(TAG/TGA/TAA ở mạch không phiên mã của DNA; UAG/UGA/UAA ở mRNA)cho đến nucleotide trước đuôi poly(A) (hình 3) Do đó, hai vùng 5′- và 3′-UTR củamột gene bao gồm tất cả những exon không mã hóa, những phần không mã hóa củaexon và thỉnh thoảng gồm cả intron

2.4.2 Vùng cánh 5' của gene

2.4.2.1 Promoter

Mô hình operon được đề xuất bởi Jacob và Monod đã đưa ra khái niệmpromoter như là một phần không thể thiếu của gene hay đơn vị phiên mã, là nơi màRNA polymerase gắn vào Với những tiến bộ về kỹ thuật tạo dòng phân tử, người ta

đã phân tích và xác định được rất nhiều các trình tự promoter thông qua phân tíchxóa bỏ (deletion analysis) Đặc điểm quan trọng nhất của trình tự promoter đó làchúng điều khiển sự khởi sự phiên mã của một gene đặc hiệu, và vị trí của chúngđược cố định tương đối so với vị trí bắt đầu phiên mã

Do sự phiên mã được tiến hành theo chiều 5′→3′, và RNA vừa mới tổng hợp

có định hướng đối song song với mạch khuôn DNA nên vị trí của promoter sẽ tựđộng quyết định mạch nào trong hai mạch DNA của gene đó sẽ được phiên mã Córất nhiều vùng promoter được gọi là “promoter trung tâm” (core/basal promoter),

“promoter lân cận” (proximal promoter) và “promoter ngoại biên” (distal promoter)dựa trên chức năng và khoảng cách của chúng so với điểm khởi đầu phiên mã Đôilúc những trình tự điều hòa phiên mã này nằm ở vùng thượng nguồn của promotertrung tâm được gọi chung là những “trình tự promoter thượng nguồn” (upstreampromoter elements) Ngoài promoter ra còn có những trình tự DNA khác cũng đónggóp trong việc điều hòa sự biểu hiện gene bao gồm enhancer, silencer, vùng điềukhiển locus (LCR) và những trình tự cách ly (insulator elements)

Thông thường, vị trí bắt đầu phiên mã được quyết định bởi hộp TATA và trình

tự khởi đầu, hoặc đối với những promoter không có hộp TATA, vị trí này đượcquyết định bởi trình tự khởi đầu và trình tự promoter hạ nguồn, tất cả đều nằm bêntrong promoter trung tâm Vùng promoter trung tâm giúp hình thành phức hợp tiềnkhởi sự phiên mã (PIC) ở gần vị trí bắt đầu phiên mã Phức hợp PIC bao gồm RNApolymerase và những nhân tố phiên mã chung (GTFs) – những nhân tố cần cho sựkhởi sự phiên mã bởi RNA pol II Tuy nhiên, hiệu quả và tính đặc hiệu trong việcnhận biết promoter phụ thuộc vào một vài trình tự khác (và những protein tương tác

với chúng) nằm xa hơn về phía thượng nguồn trong promoter lân cận Vùngpromoter lân cận là nơi gắn của một nhóm các nhân tố phiên mã khác – các nhân tốhoạt hóa phiên mã Những protein hoạt hóa này tương tác với những cấu trúc cơbản Một vài các nhân tố hoạt hóa có thể có tính đặc hiệu với mô và được gọi là

“những nhân tố phiên mã đặc hiệu” hoặc “nhân tố hoạt hóa đặc hiệu mô”

a) Promoter trung tâm

Promoter trung tâm là trình tự tiếp giáp, dẫn dắt sự khởi đầu phiên mã chínhxác bởi RNA poly II Nó là vị trí gắn của RNA poly II và các GTF Thông thường

nó dài khoảng 35 cặp base và kéo dài cả về phía thượng nguồn lẫn hạ nguồn của vịtrí bắt đầu phiên mã (-35 đến +35) Promoter trung tâm có thể chứa hai hay nhiềuhơn trong số các motif sau: hộp TATA , trình tự khởi đầu (Inr) và trình tự promoter

hạ nguồn (DPE)

b) Promoter lân cận

Promoter lân cận dài khoảng 250 cặp base và có thể kéo dài cả hai phía của vịtrí bắt đầu phiên mã (-250 đến +250) Tuy nhiên, theo tài liệu, những trình tự xa hơn-250 về phía thượng nguồn cũng được gọi là “trình tự promoter lân cận” Thôngthường nó là nơi gắn các nhân tố phiên mã đặc hiệu hoặc nhân tố hoạt hóa Hai trình

tự hoạt hóa phiên mã nằm trong promoter này gồm hộp CAAT và hộp GC HộpCAAT gắn nhân tố phiên mã NF-I (nuclear factor I, còn gọi là NF-Y, CTF và CBF),nằm ở vị trí khoảng nucleotide 75 phía thượng nguồn tính từ vị trí bắt đầu phiên mã

và có trình tự thỏa hiệp là GG(T/C)CAATCT Hộp GC có trình tự thỏa hiệp làGGGCGG, nằm ở vị trí nucleotide 90 phía thượng nguồn tính từ vị trí bắt đầu phiên

mã, là nơi gắn nhân tố phiên mã Sp1 (specificity protein 1) Hộp CAAT và GC hoạtđộng giống như các trình tự enhancer vì chúng có thể hoạt hóa sự phiên mã khiđược đặt ở một trong hai hướng bên trong promoter lân cận

c) Promoter ngoại biên

Thuật ngữ “promoter ngoại biên” được dùng để chỉ các trình tự nằm xa hơn vềphía thượng nguồn của promoter trung tâm Có rất nhiều ví dụ về sự kết hợp giữapromoter lân cận và promoter ngoại biên trong việc điều hòa phiên mã Cả haipromoter của gene đều thể hiện sự đặc hiệu đối với mô và chứa nhiều các trình tựđiều hòa phiên mã đặc biệt, được nhận biết bởi các nhân tố phiên mã đặc hiệu mô.Ngoài ra, thỉnh thoảng những trình tự bên trong intron cũng đóng vai trò khôngthể thiếu trong việc điều hòa tăng cường phiên mã được gọi là những trình tự giốngpromoter bên trong intron (Salguerro S và cs, 2000) Nhóm tác giả cho rằng một vàiintron cũng có đặc điểm tương tự promoter,như trình tự giống TATA, hộp CAAT

2.4.2.2 Các trình tự điều hòa khác (Enhancer, Silencer, LCR, Insulator)

Rất nhiều các trình tự điều hòa phiên mã có thể nằm ở vị trí cách xa genekhoảng một vài kb cả về hai phía tính từ vị trí bắt đầu phiên mã Một vài trong sốnhững trình tự này kích hoạt sự phiên mã như enhancer và LCR, trong khi một sốkhác hoạt động như những tác nhân ức chế phiên mã như silencer Những vùng này

chứa những trình tự nhận biết nhiều loại protein gắn DNA đặc hiệu với trình tự cóliên quan đến sự điều hòa phiên mã.

a) Enhancer và Silencer

Enhancer có thể giúp tăng cường tốc độ phiên mã bằng cách tăng cường vậndụng promoter Chúng là vị trí gắn của các nhân tố hoạt hóa phiên mã đặc hiệu Mộtđoạn enhancer có thể điều khiển sự phiên mã của nhiều hơn một gene theo kiểukhông phụ thuộc vào vị trí và chiều hướng Những trình tự enhancer có thể nằm ở vịtrí gần với vị trí bắt đầu phiên mã, phía thượng nguồn lẫn hạ nguồn và thậm chí còn

có thể nằm bên trong intron Hộp CAAT và GC đề cập ở trên là những trình tựenhancer đóng vai trò không thể thiếu trong promoter lân cận ở hầu hết các gene.Người ta cho rằng enhancer đem những nhân tố hoạt hóa gắn vào nó tương tác vớinhững nhân tố phiên mã gắn với promoter bằng cách uốn cong DNA Từ đó, chúnglàm tăng nồng độ các nhân tố hoạt hóa gần promoter và những nhân tố này tươngtác trực tiếp hoặc gián tiếp với promoter để khởi sự quá trình phiên mã

Ngược lại với enhancer là silencer, chúng ức chế sự phiên mã bằng cách gắnvới những nhân tố ức chế phiên mã, từ đó hoạt động như là yếu tố điều hòa âm.Silencer có thể hoạt động không phụ thuộc vào chiều, vị trí và khoảng cách, vàchúng cũng có thể nằm bên trong intron

b) Vùng điểu khiển locus (LCR)

LCR (locus control region) là một loại trình tự tăng cường phiên mã khác.LCR tăng cường sự phiên mã của một cụm các gene liên kết với nhau bằng cách tạo

ra một hình dáng nhiễm sắc thể mở bên cạnh locus Từ đó, LCR có thể tác độngmạnh đến mức độ hoạt động của một vùng nhiễm sắc chất điển hình (euchromatic)của một nhiễm sắc thể LCR được xác định đầu tiên ở locus β -globin ở người

c) Insulator

Insulator (trình tự cách ly) là một trình tự ranh giới gene quan trọng Khi gắnvào những protein gắn insulator, chúng sẽ bảo vệ promoter khỏi những tác động củacác yếu tố điều hòa gần đó Insulator có hai dạng chức năng: chức năng ngăn chặnenhancer và chức năng hàng rào dị nhiễm sắc chất (heterochromatin)

Chức năng ngăn chặn enhancer liên quan đến việc ngăn chặn sự tương tácgiữa một enhancer và promoter khi insulator nằm ở vị trí giữa hai trình tự này, và từ

đó ngăn chặn sự hoạt hóa của enhancer đối với promoter Vì một enhencer có thểtác động đến nhiều hơn một promoter nên chức năng ức chế có thể ngăn chặn tácđộng bừa bãi của một enhancer lên nhiều promoter và bắt buộc chúng chỉ tác độnglên một promoter đặc hiệu

Chức năng hàng rào dị nhiễm sắc chất (heterochromatin barrier) liên quan đếnviệc bảo vệ một vùng nhiễm sắc chất điển hình (bao gồm những gene với nhữngpromoter hoạt động) khỏi việc trở thành dị nhiễm sắc chất bằng cách bất hoạt tácđộng xâm lấn của dị nhiễm sắc chất gần kề Một số insulator sở hữa cả hai chứcnăng ngăn chặn và hàng rào, trong khi một số khác chỉ có một chức năng

10 base Sự hình thành cấu trúc thòng lọng này làm cho RNA poly ngừng lại, từ đókết thúc sự phiên mã.

Kết thúc phiên mã phụ thuộc vào rho được phát hiện ở khoảng phân nửa cácgene của E coli Rho là một nhân tố kết thúc phiên mã gắn vào RNA, là một protein

có hoạt tính helicase và ATPase phụ thuộc RNA Vùng kết thúc phiên mã phụ thuộcvào rho thường là giàu C và nghèo G Trong suốt quá trình phiên mã, nhân tố rhogắn lên trên RNA đang được kéo dài ở vị trí dài khoảng 75 nucleotide và phíathượng nguồn của vùng kết thúc phiên mã Sử dụng hoạt tính ATPase của nó, rho dichuyển dọc theo RNA và có lẽ với vận tốc nhanh hơn RNA pol di chuyển trên mạchkhuôn Khi RNA pol ngừng tại vị trí kết thúc, rho bắt kịp nó và sử dụng hoạt tínhhelicase để tách đoạn mạch lai giữa DNA-RNA, từ đó kết thúc sự phiên mã và giảiphóng RNA và RNA pol

Ở Eukaryote người ta vẫn chưa biết nhiều về sự kết thúc phiên mã Tuy nhiênngười ta có thể khái quát nó dựa trên những hiểu biết hiện tại Mỗi loại RNA pol sửdụng một cơ chế kết thúc phiên mã khác nhau Đối với pol I và III, việc dừng lại ởtrình tự kết thúc ở vùng cánh 3' có vẻ đóng vai trò quan trọng trong việc kết thúcphiên mã và giải phóng RNA và pol Những nhân tố giúp dừng phiên mã có thểkhông nhất thiết là những nhân tố giải phóng Những tín hiệu kết thúc cũng nhưnhững nhân tố kết thúc và giải phóng có thể rất khác nhau ở những loài eukaryotekhác nhau

3. SỰ BIỂU HIỆN GENE

3.1.Đơn vị phiên mã

Ở vi khuẩn, một đơn vị phiên mã bao gồm một cụm các gen tạo nên mộtoperon, được phiên mã từ một promoter xác định thành một đoạn phiên mã duynhất Nói cách khác, ta có thể phân biệt được gene và đơn vị phiên mã ở prokaryote.Ngược lại, ở eukaryote hầu hết các gene và đơn vị phiên mã là như nhau, và haithuật ngữ này thường có thể được sử dụng thay thế cho nhau Tùy thuộc vào sốphận của đoạn phiên mã sơ cấp, đơn vị phiên mã ở eukaryote được phân thành 2dạng: đơn vị phiên mã đơn giản và đơn vị phiên mã phức tạp

Một đơn vị phiên mã đơn giản (simple transcription unit) tạo ra một đoạnphiên mã sơ cấp, đoạn phiên mã này sẽ được chế biến để tạo ra một dạng mRNAduy nhất, mã hóa cho một protein đơn lẻ Tất cả đột biến trên các đoạn exon, intron

và những vùng điều hòa phiên mã đều có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện củaprotein được mã hóa bởi một đơn vị phiên mã đơn giản (hình 4).

Hình 4: Đơn vị phiên mã đơn (simple transcription unit) Một đơn vị phiên mã đơn giản gồm một vùng mã hóa cho một protein, kéo dài

từ mũ chụp đầu 5’ cho đến vùng poly(A) ở đầu 3’ và các vùng điều hòa có liên quan Các đoạn intron nằm xen kẽ giữa các đoạn exon (hình chữ nhật màu xanh) và được loại bỏ trong suốt quá trình chế biến các tiền-mRNA và do đó không hiện diện trên phân tử mRNA chức năng đơn cistron (monocistron) Những đột biến trên vùng điều hòa phiên mã (đột biến a, b) có thể làm giảm hay ngăn chặn sự phiên mã, từ

đó làm giảm hay xóa bỏ sự tổng hợp protein được mã hóa Một đột biến bên trong đoạn exon (đột biến c) có thể tạo ra một protein bất thường Một đột biến bên trong đoạn intron (đột biến d) cho ra vị trí cắt nối mới, kết quả tạo ra một mRNA bị cắt nối không bình thường, mã hóa cho ra một protein mất chức năng.

Trong khi đó, đơn vị phiên mã phức (complex transcription unit) khá phổ biến

ở sinh vật đa bào và đoạn phiên mã RNA sơ cấp có thể được chế biến theo nhiềucách, dẫn đến hình thành các mRNA chứa những đoạn exon khác nhau Mỗi mRNAđều là monocistron và được dịch mã thành một polypeptide duy nhất, với sự dịch

mã khởi sự ở AUG đầu tiên trên mRNA Trong hình 6, có nhiều loại mRNA khácnhau có thể được tạo thành theo ba cách: (i) Sử dụng những vị trí nối khác nhau tạo

ra những mRNA có cùng những exon ở đầu 5′ và 3′ nhưng khác nhau ở những exonbên trong; (ii) Sử dụng những vị trí poly(A) khác nhau tạo ra những mRNA có cùngnhững exon đầu 5′ nhưng khác ở những exon đầu 3′; (iii) Sử dụng những promoterkhác nhau tạo ra những mRNA khác nhau ở những exon đầu 5′ nhưng giống nhau ởnhững exon đầu 3′ Một gene được biểu hiện một cách có chọn lọc ở hai hay nhiềuloại tế bào khác nhau thì thường được phiên mã từ những promoter khác nhau đặchiệu với loại tế bào

Hình 5: Đơn vị phiên mã phức (complex transcription unit) Đơn vị phiên mã phức tạo ra những đoạn phiên mã sơ cấp có thể được chế biến theo nhiều cách khác nhau: (i) Nếu một đoạn phiên mã sơ cấp có chứa những vị trí cắt nối khác nhau, nó có thể được chế biến thanh những mRNA với cùng những exon ở đầu 5’ và 3’ nhưng khác nhau ở những exon bên trong; (ii) Nếu một đoạn phiên mã sơ cấp có hai vị trí poly(A), nó có thể được chế biến thành các mRNA với những exon đầu 3’ khác nhau; (iii) Nếu các promoter khác nhau (f hoặc g) được kích hoạt ở những dạng tế bào khác nhau, thì mRNA1 - được sản xuất ở một dạng tế bào mà trong đó promoter f được kích hoạt - sẽ có một exon (1A) khác với mRNA2 - được sản xuất ở một dạng tế bào khác mà trong đó promoter g được kích hoạt và exon 1B được sử dụng thay cho 1A Những đột biến ở những vùng điều hòa (a và b) và những đột biến bên trong exon (c) giống nhau ở những mRNA khác nhau có ảnh hưởng đến những protein mã hóa bởi cả hai mRNA được chế biến khác nhau đó Ngược lại, những đột biến bên trong các đoạn exon (d và e) khác nhau ở những mRNA khác nhau chỉ có tác động ảnh hưởng đến protein được mã hóa từ mRNA đó Đối với những gene được

i)

ii)

iii)

phiên mã từ những promoter khác nhau ở các dạng tế bào khác nhau, những đột biến ở các vùng điều hòa khác nhau (f và g) chỉ có tác động ảnh hưởng ở dạng tế bào mà trong đó đoạn promoter đó được hoạt hóa.

Hình dưới đây mô tả ba cách chế biến RNA khác nhau xảy ra trong quá trìnhbiệt hóa giới tính ở Drosophila Thông thường một mRNA được tạo ra từ một đơn

vị phiên mã phức ở một vài dạng tế bào, và một mRNA khác được tạo ra ở nhữngdạng tế bào khác Ví dụ như sự khác nhau ở cách ghép nối ở những đoạn phiên mãfibronectin sơ cấp ở tế bào fibroblast và tế bào gan sẽ quyết định liệu protein tiết ra

có bao gồm những domain đóng vai trò bám vào bề mặt tế bào hay không

Hình 6: Chuỗi điều hòa cắt nối điều khiển sự định đoạt giới tính ở phôi

Drosophila Chuỗi điều hòa cắt nối điều khiển sự định đoạt giới tính thông qua sự biểu hiện của các gene sxl (sex-lethal), tra (transformer) và dsx (double-sex) ở phôi Drosophila Hình chỉ thể hiện các đoạn exon (hình chữ nhật) và intron (đường gạch đen) - nơi xảy ra sự điều hòa cắt nối Đường đứt khúc màu đỏ thể hiện sự cắt nối (splicing) tiền-mRNA ở con cái và tương tự đường màu xanh thể hiện sự cắt nối ở con đực Đường dọc màu đỏ bên trong các đoạn exon biểu thị các codon stop bên trong khung đọc - cái ngăn chặn sự tổng hợp protein chức năng Chỉ những phôi cái mới sản xuất protein Sxl chức năng - protein ức chế việc cắt nối giữa exon 2 và

3 trong tiền-mRNA sxl (a) và giữa exon 1 và 2 trong tiền-mRNA tra (b) (c) Ngược lại, việc gắn mang tính điều phối của protein Tra và hai protein SR, Rbp1 và Tra2, hoạt hóa việc cắt nối giữa exon 3 và 4 và sự cắt/polyadenyl hóa A n ở đầu 3’ của exon 4 ở tiền-mRNA dsx ở phôi cái Ở phôi đực – phôi thiếu Tra chức năng – protein SR không gắn vào exon 4, và do đó exon 3 được nối vào exon 5 Các protein Dsx khác nhau sản sinh ở phôi đực và cái - kết quả của chuỗi điều hòa cắt nối - có tác dụng ức chế sự phiên mã các gene cần thiết cho sự biệt hóa giới tính của giới tính kia [Sửa lại từ M J Moore và cs, 1993, in R Gesteland và J Atkins, eds., The RNA World, Cold Spring Harbor Press, trang 303-357.]

Đối với trường hợp đơn vị phiên mã phức, quan hệ giữa một đột biến và mộtgene không phải lúc nào cũng trung thực hay trực tiếp Một đột biến ở cùng mộtvùng điều hòa hay một đoạn exon ở những mRNA khác nhau sẽ ảnh hưởng đến tất

cả những protein khác nhau được mã hóa bởi cùng một đơn vị phiên mã phức Mặtkhác, những đột biến trên một exon chỉ hiện diện ở một trong số những mRNAkhác nhau thì chỉ ảnh hưởng đến protein được mã hóa bởi mRNA đó

3.2.Sự phiên mã ở gene mã hóa protein và sự hình thành mRNA chức năng

Khái niệm đơn giản nhất của gene đó là một “đơn vị DNA bao gồm thông tinchỉ định sự tổng hợp của một chuỗi polypeptide hay một phân tử RNA chức năng(như tRNA).” Và một phần rất lớn trong gene mang thông tin để tạo nên phân tửprotein, và chính những bản sao RNA của những gene mã hóa protein này cấu thànhnên những phân tử mRNA của tế bào Ở virus một phân tử DNA chỉ chứa một vàigene, trong khi ở những động thực vật bậc cao một phân tử DNA ở mỗi nhiễm sắcthể có thể chứa đến vài ngàn gene

Quá trình tổng hợp RNA (phiên mã) chỉ đơn giản là sự sao chép lại ngôn ngữgồm bốn base của DNA bao gồm A, G, C và T thành ngôn ngữ gồm bốn base tương

tự của RNA, chỉ trừ U thay thế cho T Mặt khác, quá trình tổng hợp protein là sựphiên dịch lại ngôn ngữ trên thành ngôn ngữ 20 amino acid của protein Dưới đây làquá trình hình thành mRNA chức năng từ các gene mã hóa protein điển hình

3.2.1 Sự polymer hóa ribonucleotide

Như đã đề cập ở trên, trong suốt quá trình phiên mã, một mạch của DNA đóngvai trò là mạch khuôn, quyết định thứ tự của các monomer ribonucleosidetriphosphate (rNTP) để hình thành một chuỗi RNA bổ sung Các base trên mạchDNA khuôn bắt cặp với các rNTP bổ sung, cái mà sau đó được gắn lại với nhautrong phản ứng polymer hóa được xúc tác bởi RNA polymerase Sự polymer hóaliên quan đến sự ăn mòn bởi 3' oxygen trên chuỗi RNA đang dài ra lên α phosphatecủa nuclotide tiếp theo, hình thành nên liên kết phosphodiester và giải phóngpyrophosphate (Ppi) Theo cơ chế này thì phân tử RNA luôn luôn được tổng hợp từđầu 5'  3' (hình 7)

Hình 7: Sự polymer hóa ribonucleotide bởi RNA polymerase trong quá trình

phiên mã Các ribonucleotide sắp được gắn vào đầu 3' của mạch RNA được chỉ định bởi

sự bắt cặp giữa base tiếp theo trên mạch DNA khuôn và ribonucleoside triphosphate (rNTP) bổ sung Một liên kết phosphodiester được hình thành khi RNA polymerase xúc tác một phản ứng giữa 3' O của mạch đang dài ra với α phosphate của một rNTP bắt cặp chính xác Mạch RNA luôn được tổng hợp theo hướng 5'  3' và ngược lại với chiều phân cực của mạch khuôn DNA.

3.2.1 Các giai đoạn phiên mã [1]

Trong suốt quá trình khởi sự phiên mã, RNA polymerase nhận biết và gắn vàomột vị trí đặc hiệu – promoter trên DNA mạch đôi (Hình 9-bước 1) Những RNApolymerase nhân cần rất nhiều nhân tố protein khác nhau – các nhân tố phiên mãchung – để giúp chúng định vị promoter và khởi đầu sự phiên mã Sau khi gắn vàopromoter RNA polymerase tháo gỡ hai mạch DNA để các ribonucleotidetriphosphate có thể tiếp cận được với các base trên mạch khuôn Các RNApolymerase trong tế bào tháo gỡ khoảng 14 cặp base xung quanh vị trí bắt đầu phiên

mã trên DNA (bước 2) Sự khởi sự phiên mã được cho là hoàn tất khi hai

ribonucleotide của một chuỗi RNA được nối với nhau bằng liên kết phosphodiester(bước 3).

Hình 8: Ba bước của quá trình phiên mã Trong suốt quá trình khởi sự phiên mã, RNA polymerase tạo nên một bóng phiên mã và bắt đầu sự polymer hóa các ribonucleotide (rNTP) tại vị trí bắt đầu nằm bên trong vùng promoter Khi một vùng của DNA được phiên mã, mạch còn lại

đã tách ra được phục hồi trở lại thành cấu trúc xoắn kép Đầu 5’ của mạch RNA rời khỏi RNA polymerase thông qua một rãnh bên trong enzyme Sự kết thúc dịch mã xảy ra khi polymerase gặp một trình tự kết thúc đặc hiệu.

Sau khi một vài ribonucleotide đã được gắn vào, RNA pol tách khỏi promoter

và các nhân tố phiên mã chung Trong suốt giai đoạn kéo dài mạch, RNA pol chạydọc theo mạch DNA khuôn từng base một, đồng thời tháo gỡ mạch đôi DNA ở phíatrước nó và phục hồi mạch đôi ở phía nó vừa đi qua (bước 4) Lần lượt từngribonucleotide một được thêm vào đầu 3' của mạch RNA mới sinh trong giai đoạnkéo dài phiên mã bởi polymerase Enzyme này vẫn duy trì một vùng tháo gỡkhoảng 14 cặp base, được gọi là bóng phiên mã Khoảng chừng 8 nucleotide ở đầu

Kết thúc

Khởi sự

Kéo dài

Bước 5: Tại vị trí ngừng phiên mã, polymerase giải phóng RNA đã hoàn thành và rời khỏi DNA

Bước 4: Polymerase di chuyển theo chiều 3'  5' của mạch khuôn, tháo gỡ mạch đôi DNA và gắn các rNTP vào mạch RNA

Bước 2: Polymerase tháo gỡ mạch đôi DNA gần vị trí bắt đầu phiên

mã tạo thành bóng phiên mã

Bước 3: Polymerase xúc tác hình thành liên kết phosphodiester giữa hai rNTP đầu tiên

Bước 1: Polymerase gắn vào promoter trên mạch đôi DNA

3' của mạch RNA đang tổng hợp vần còn bắt cặp base với mạch DNA khuôn trongbóng phiên mã Phức hợp kéo dài phiên mã bao gồm RNA polymerase, DNA khuôn

và mạch RNA đang dài ra Phức hợp này cực kỳ ổn định

Trong quá trình kết thúc phiên mã, phân tử RNA đã hoàn thành, hay đoạnphiên mã sơ cấp, được giải phóng khỏi RNA polymerase và polymerase tách khỏimạch khuôn DNA (bước 5) Những trình tự đặc biệt trên DNA khuôn ra tín hiệucho RNA polymerase kết thúc phiên mã Sau khi được giải phóng, RNA pol tự do

có thể phiên mã cho cùng một gene một lần nữa hoặc một gene khác

3.3.Biến đổi tiền-mRNA thành mRNA chức năng ở Eukaryote [1] [3]

Ở các tế bào prokaryote không có nhân, sự dịch mã một phân tử mRNA thànhprotein có thể bắt đầu từ đầu 5' của mRNA ngay trong lúc đầu 3' vẫn đang đượctổng hợp bởi RNA polymerase Nói cách khác, sự phiên mã và dịch mã có thể xảy

ra đồng thời ở prokaryote Tuy nhiên, ở tế bào eukaryote nhân được tách khỏi tế bàochất – nơi dịch mã xảy ra nên không gian của hai quá trình phiên mã và dịch mã làkhác nhau Hơn nữa các đoạn phiên mã sơ cấp mới chỉ là những tiền-mRNA, cầnphải trải qua một vài biến đổi – gọi chung là quá trình chế biến RNA để hình thànhnên một phân tử mRNA chức năng (RNA trưởng thành) Phân tử mRNA này sau đóphải được vận chuyển ra tế bào chất trước khi nó có thể được dịch mã thành protein

Vì vậy, sự phiên mã và dịch mã không thể nào xảy ra đồng thời ở những tế bàoeukaryote

3.3.1 Gắn mũ chụp 5’ [1] [3]

Đầu tiên, tất cả các tiền-mRNA ở eukaryote đều được biến đổi ở hai đầu của

nó, và những biến đổi này được giữ lại trên mRNA trưởng thành Tại đầu 5' củachuỗi RNA vừa mới được tách khỏi RNA pol II, ngay lập tức nó được tác động bởimột vài các enzyme kết hợp tổng hợp nên mũ chụp 5', một 7-methylguanylate liênkết với nucleotide cuối cùng của RNA bằng một liên kết 5', 5' triphosphate

Mũ chụp được viết làm7Gppp, viết tắt là m7G haym7G Cấu trúc mũ chụp m7Gkinh điển được gọi là “cap0”, hiện diện ở tất cả các mRNA eukaryote Cap0 đượcthêm vào theo một phản ứng gồm ba bước: đầu tiên, đầu phosphate tận cùng (γ-phosphate) được thủy phân bởi RNA 5′ triphosphatase từ triphosphate củanucleotide đầu tiên của tiền-mRNA thành diphosphate; tiếp theo, RNAguanylyltransferase xúc tác sự kết hợp giữa một GMP và diphosphate củanucleotide đầu tiên này thông qua liên kết 5′-5′, nhờ đó khôi phục lại triphosphate ởtận cùng; cuối cùng, RNA (guanine-7)-methyltransferase xúc tác sự methyl hóa vịtrí N7 của guanine Ở động vật có vú, hoạt động của triphosphatase nằm ở đầu N vàhoạt động của guanylyltransferase nằm ở đầu C của cùng một polypeptide, nhưng ởnấm men, chúng được xúc tác bởi những enzyme riêng biệt

Hình 9: Những cấu trúc mũ chụp trên mRNA ở eukaryote

Ở eukaryote bậc thấp, quá trình gắn mũ chụp chỉ tạo ra cap0 Ở eukaryote bậc cao, quá trình gắn mũ chụp có thể tạo ra cap1 và cap2 bằng những biến đổi như methyl hóa 2'-O trên ribose của nucleotide 1 và 2 của tiền-mRNA, sự methyl hóa N 6 của base đầu tiên trên tiền-mRNA nếu như base đầu tiên là adenine.

Những enzyme gắn mũ chụp được đưa đến tiền-mRNA bằng cách gắn vàodomain đầu C (CTD) được phosphoryl hóa của RNA polymerase II (RNA pol II).Đuôi CTD chứa nhiều đoạn gồm 7 peptide lặp đi lặp lại có tính bảo tồn cao vớitrình tự thỏa hiệp (consensus sequence) là Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser(YSPTSPS) Số lượng lặp lại biến thiên từ 26 ở nấm men đến 52 ở động vật có vú.Năm trong số bảy amino acid trong motif thỏa hiệp này là những điểm tiếp nhậnphosphate, và sự phosphoryl hóa là một sự biến đổi sau dịch mã chủ yếu của đuôi

CTD in vivo Sự mất khả năng đi vào quá trình chế biến của những đoạn phiên mã

tạo ra bởi RNA pol I và III được cho là do sự mất đuôi CTD ở những enzyme này.Việc gắn mũ chụp có hai chức năng chủ yếu: (1) ngăn chặn sự phân hủymRNA trước khi trưởng thành, do đó làm tăng tính ổn định của mRNA; (2) đónggóp vào quá trình khởi sự dịch mã – một quá trình phụ thuộc vào mũ chụp Ngoài

ra, những phát hiện gần đây chỉ ra rằng mũ chụp cũng đóng một vai trò chủ yếutrong việc ức chế dịch mã điều hòa bởi miRNA (microRNA-mediated translationalsilencing)

3.3.2 Gắn đuôi poly(A) [1]

Sự biến đổi ở đầu 3' của tiền-mRNA liên quan đến sự phân cắt bởi mộtendonuclease để có được một nhóm 3'-hydroxyl tự do – vị trí gắn một chuỗi cácadenylic acid bởi enzyme poly(A) polymerase Kết quả tạo ra một đuôi poly(A)khoảng 100-250 base đối với động vật có xương Poly(A) polymerase là một phầncủa phức hợp các protein có thể định vị và phân cắt một đoạn phiên mã tại vị trí đặchiệu và sau đó thêm vào các adenyl theo một quá trình mà không cần có mạch khuôn

3.3.3 Cắt nối (splicing) [1]

Bước cuối cùng trong quá trình biến đổi của nhiều loại mRNA ở eukaryote đó

là cắt nối RNA (RNA splicing): quá trình cắt bỏ những đoạn intron bên trong đoạnphiên mã và tiếp sau đó là quá trình nối lại các đoạn exon mã hóa

Hình 10: Tổng quan quá trình chế biến RNA tạo RNA trưởng thành ở

eukaryote Gene β-globin chứa ba exon mã hóa protein (vùng mã hóa, màu đỏ) và hai intron không mã hóa xen kẽ (màu xanh) Những đoạn intron làm đứt quãng trình tự mã hóa protein giữa các codon cho amino acid 31 và 32, 105 và 106 Sự phiên mã các gene mã hóa protein ở eukaryote bắt đầu trước trình tự mã hóa cho amino acid đầu tiên và kéo dài qua khỏi trình tự mã hóa cho amino acid cuối cùng, kết quả tạo ra những vùng không mã hóa (màu xám) ở cuối đoạn phiên mã sơ cấp (tiền-mRNA) Những vùng không được dịch

mã (UTR) này được giữ lại trong suốt quá trình trên Đầu 5’ được gắn thêm mũ chụp (m 7 Gppp) trong suốt quá trình hình thành đoạn phiên mã RNA Đoạn phiên mã này kéo dài qua khỏi vùng poly(A) (poly(A) site) Sau quá trình cắt tại vùng poly(A) và quá trình thêm vào một chuỗi A tại đầu 3’, quá trình cắt nối (splicing) tháo bỏ các đoạn intron và nối các đoạn exon lại với nhau tạo thành phân tử mRNA β-globin trưởng thành gồm 147 codon mã hóa cho amino acid.

Những phân tử mRNA chức năng tạo thành bởi quá trình biến đổi trên vẫn còngiữ các vùng không mã hóa hay những vùng không được dịch mã (UTR) 5' và 3' ỞmRNA động vật có vú, 5'-UTR có thể dài khoảng một trăm nucleotide hoặc hơn, và3'-UTR có thể dài đến một vài kilobase mRNA ở prokaryote thường cũng có 5'-UTR và 3'-UTR, nhưng chúng ngắn hơn nhiều so với mRNA eukaryote, thường íthơn khoảng 10 nucleotide.

3.4.Cắt nối luân phiên (Alternative splicing) [1]

Việc cắt nối RNA theo những cách khác nhau – cắt nối luân phiên – làm tăng

số lượng protein biểu hiện từ một gene đơn lẻ Như đã nói ở trên, ngược lại với cácgene ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ, đa số các gene ở eukaryote đa bào bậc cao đềuchứa rất nhiều intron Như chúng ta đã biết, nhiều protein ở eukaryote bậc cao cómột cấu trúc bậc bốn gồm nhiều domain khác nhau Những domain lặp lại của mộtprotein thường được mã hóa bởi một exon hoặc một số lượng nhỏ các exon mã hóanhững trình tư amino acid giống nhau hoặc gần như giống nhau Những đoạn exonlặp lại như vậy được cho là đã tiến hóa từ sự sao bản ngẫu nhiên một đoạn DNAnằm giữa hai vùng trong những đoạn intron gần kề, kết quả là sự chèn vào mộtchuỗi các đoạn exon lặp lại được tách nhau bởi những intron Sự hiện diện của cácđoạn intron khác nhau ở nhiều gene eukaryote cho phép biểu hiện các protein khácnhau có liên quan đến nhau từ một gene duy nhất bằng cách cắt nối theo nhiều kiểukhác nhau – cắt nối luân phiên Ở những eukaryote bậc cao, việc cắt nối luân phiên

là một cơ chế quan trọng trong việc sản xuất nhiều dạng khác nhau của một protein

ở nhiều dạng tế bào khác nhau

Ví dụ như fibronectin, một protein kết dính ngoại bào gồm nhiều domain đượctìm thấy ở động vật có vú Gene fibronectin chứa rất nhiều exon, được nhóm vàomột vài vùng tương ứng với các domain đặc trưng của protein Những nguyên bàosợi sản xuất các mRNA fibronectin có chứa các exon EIIIA và EIIIB; những exonnày mã hóa cho những trình tự amino acid gắn chặt vào những protein trên màng tếbào của nguyên bào sợi Do đó, dạng fibronectin này gắn nguyên bào sợi vào chấtnền ngoại bào Việc cắt nối luân phiên đoạn phiên mã sơ cấp fibronectin ở tế bàogan tạo ra mRNA thiếu các exon EIIIA và EIIIB Kết quả là fibronectin được tiếtvào máu bởi tế bào gan sẽ không gắn chặt vào nguyên bào sợi hay hầu hết tất cả cácdạng tế bào khác, cho phép chúng lưu hành trong dòng máu Tuy nhiên trong quátrình hình thành cục máu đông, những domain gắn fibrin của fibronectin từ tế bào gangắn vào fibrin, một trong những thành phần cốt yếu của cục máu đông Fibronectinsau khi gắn vào sẽ tương tác với các integrin trên màng của các tiểu cầu hoạt hóa trôingang qua, từ đó mở rộng cục máu đông bằng cách gắn thêm tiểu cầu vào

Hình 11: Sự cắt nối (splicing) tiền-mRNA fibronectin ở nguyên bào sợi và tế

bào gan Gene fibronectin (trên cùng) kích thước ≈ 75 kb bao gồm nhiều exon Các đoạn exon EIIIB và EIIIA (màu xanh lá) mã hóa cho các domain gắn kết những protein đặc hiệu trên

bề mặt nguyên bào sợi mRNA fibronectin được sản xuất trong nguyên bào sợi có chứa các exon EIIIA và EIIIB, trong khi ở tế bào gan, những exon này bị loại bỏ khỏi mRNA fibronectin (Các đoạn intron trong sơ đồ không được vẽ theo tỉ lệ, trên thực tế hầu hết chúng đều dài hơn nhiều so với các đoạn exon.)

Có hơn 20 dạng fibronectin khác nhau đã được xác định, mỗi loại được mãhóa từ một mRNA khác nhau, được cắt nối khác nhau và chứa sự kết hợp đặc trưngcác đoạn exon của gene fibronectin Gần đây, việc giải trình tự lượng lớn cácmRNA được tách từ các mô khác nhau và so sách các trình tự của chúng với DNA

bộ gene biểu thị rằng gần 60% các gene người là được biểu hiện thông qua sự cắtnối luân phiên mRNA Rõ ràng là, sự cắt nối luân phiên RNA giúp mở rộng sốlượng các protein được mã hóa từ bộ gen ở những sinh vật đa bào bậc cao

3.5.Quá trình dịch mã tổng hợp protein [1]

Mặc dù DNA chứa thông tin cho sự tổng hợp protein và mRNA truyền đạtnhững thông tin mã hóa từ DNA, hầu hết các hoạt động sinh học đều được tiến hànhbởi những protein Như chúng ta đã biết, trình tự các amino acid trên mỗi proteinquyết định cấu trúc ba chiều và hoạt động của nó Vì lý do này, việc kết hợp cácamino acid theo đúng thứ tự như được mã hóa từ DNA mang tính quyết định đốivới sự hình thành các protein có chức năng và do đó quan trọng trong hoạt độngbình thường của tế bào sinh vật

3.5.1 Các loại RNA tham gia dịch mã

Dịch mã là toàn bộ quá trình mà các trình tự nucleotide của một mRNA được

sử dụng để chỉ dẫn và kết hợp các amino acid vào trong một chuỗi polypeptide Ở tếbào eukaryote, sự tổng hợp protein xảy ra trong tế bào chất, nơi có ba dạng phân tửRNA phối hợp cùng thực hiện quá trình dịch mã:

1 RNA thông tin (mRNA) mang thông tin di truyền được phiên mã từ DNAtheo dạng một chuỗi các bộ trình tự gồm 3 nucleotide, gọi là codon, mỗi codon định

rõ một amino acid riêng biệt

2 RNA vận chuyển (tRNA) là chìa khóa cho việc giải mã các codon trênmRNA Mỗi loại amino acid được gắn vào một loại tRNA riêng biệt và được vậnchuyển vào đầu đang tổng hợp của chuỗi polypeptide tRNA thích hợp với amino

acid gắn vào nó được chọn lọc ở mỗi bước bởi vì mỗi phân tử tRNA riêng biệt đềuchứa một trình tự gồm ba nucleotide, gọi là anticodon, mà có thể bắt cặp với codon

bổ sung của nó trên mRNA

3 RNA ribosome (rRNA) kết hợp với một nhóm các protein hình thành nênribosome – những cấu trúc phức tạp chạy dọc theo phân tử mRNA, xúc tác cho sựgắn kết các amino acid vào chuỗi polypeptide Chúng cũng gắn tRNA và nhiềuprotein phụ khác cần thiết cho sự tổng hợp protein Ribosome bao gồm một tiểuphần lớn và một tiểu phần nhỏ và mỗi cái đều chứa phân tử rRNA của riêng nó

3.5.2 Các bước tổng hợp protein

Tương tự như quá trình phiên mã, quá trình dịch mã có thể chia thành ba giaiđoạn – khởi sự, kéo dài và kết thúc dịch mã Cơ chế dịch mã về cơ bản đều giốngnhau ở tất cả các dạng tế bào prokaryote và eukaryote Dưới đây là quá trình dịch

mã ở các tế bào eukaryote

Codon AUG (Methionine) đóng vai trò là codon khởi sự ở đa số các mRNA

Sự khởi đầu dịch mã để bắt đầu tổng hợp protein ở codon khởi đầu đóng vai trò chủchốt để từ đó thiết lập nên khung đọc chính xác cho cả phân tử mRNA Cảprokaryote lẫn eukaryote đều có hai tRNA methionine khác nhau: tRNAiMet khởi sựtổng hợp protein và tRNAMet gắn Methionine trên chuỗi protein đang tổng hợp Cảhai tRNA này đều được gắn methionine bởi cùng một enzyme aminoacyl-tRNAsynthetase (MetRS) Nhưng chỉ có Met-tRNAiMet (methionine hoạt hóa đã gắn vàotRNAiMet) là có thể gắn vào vị trí thích hợp trên tiểu phần nhỏ của ribosome, vị trí

P, để bắt đầu tổng hợp chuỗi polypeptide Còn Met-tRNAMetbình thường và tất cảcác tRNA đã gắn amino acid khác đều chỉ gắn vào vị trí A của ribosome

3.5.2.1 Khởi sự dịch mã

Khởi sự dịch mã thường xảy ra ở gần AUG ở gần phía đầu 5' nhất của mRNA.Trong suốt giai đoạn đầu của dịch mã, ribosome tập hợp một mRNA và một tRNAkhởi sự đã được hoạt hóa và được định vị chính xác tại codon khởi đầu Các tiểuphần lớn và nhỏ của ribosome chưa tham gia vào dịch mã được giữ tách rời nhaubằng cách gắn vài hai nhân tố khởi sự eIF3 và eIF6 (ở eukaryote) (hình 12) Phứchợp tiền khởi sự dịch mã (preinitiation complex) hình thành khi phức hợp eIF3-tiểuphần 40S được gắn bởi eIF1A và một phức hợp bậc ba của Met-tRNAiMet, eIF2 vàGTP (Hình 13-bước 1) Tế bào có thể điều hòa sự tổng hợp protein bằng cáchphosphoryl hóa một serine trên eIF2 gắn vào GDP; phức hợp được phosphoryl hóakhông có khả năng trao đổi GDP bằng GTP và không thể gắn vào Met-tRNAiMet, do

đó ức chế sự tổng hợp protein

Hình 12: Các tiểu phần ribosome trước dịch mã Khi một ribosome phân tách ra vào cuối quá trình dịch mã, các tiểu phần 40S

và 60S liên kết với các nhân tố khởi sự eIF3 và eIF6 tạo nên những phức hợp khởi

sự cho một quá trình dịch mã mới.

Trong suốt quá trình khởi sự, đầu mũ chụp 5' của một mRNA được gắn bởitiểu phần eIF4E của phức hợp gắn mũ chụp eIF4 Phức hợp mRNA-eIF4 sau đótách khỏi phức hợp tiền khởi sự thông qua một tương tác của tiểu phần eIF4G vàeIF3, tạo nên phức hợp khởi sự dịch mã (bước 2) Phức hợp khởi sự sau đó sẽ trượtdọc theo mRNA trong khi hoạt tính helicase của eIF4A sử dụng năng lượng từ sựthủy phân ATP để tháo gỡ cấu trúc bậc hai của RNA Phức hợp dừng lại khitRNAiMet anticodon nhận biết được codon khởi đầu – AUG đầu tiên phía hạ nguồn(bước 3) Sự nhận biết codon khởi đầu dẫn đến sự thủy phân GTP liên kết với eIF2,đây là một quá trình không đảo ngược nhằm ngăn chặn sự trượt xa hơn nữa củaphức hợp khởi sự Việc lựa chọn AUG khởi sự thuận tiện hơn nhờ các nucleotideđặc biệt xung quanh nó gọi là trình tự Kozak (được xác định bởi Marilyn Kozak):

(5') ACCAUGG (3') Adenyl đứng trước AUG (gạch dưới) và Guanine ngay sau nó

là hai nucleotide quan trọng nhất, ảnh hưởng đến hiệu quả của sự khởi đầu dịch mã.Khi tiểu phần nhỏ của ribosome cùng với Met-tRNAiMet được định vị tạicodon khởi đầu, sự kết hợp với tiểu phần lớn 60S của ribosome hoàn tất hình thànhnên ribosome 80S Quá trình này cần có hoạt động của một nhân tố khác – eIF5 và

sự thủy phân một GTP liên kết với nó (bước 4) Việc kết nối những phản ứng gắn kếtvào sự thủy phân GTP làm cho nó trở thành một quá trình không đảo ngược, từ đócác tiểu phần của ribosome không tách rời nhau cho đến khi toàn bộ mRNA đượcdịch mã và sự tổng hợp protein kết thúc Sau quá trình này là quá trình kéo dài phiênmã: chuỗi polypeptide đang dài ra vẫn gắn vào tRNA tại vị trí P trên ribosome

Ở eukaryote, ribosome – bộ máy tổng hợp protein – bắt đầu dịch mã trongvòng khoảng 100 nucleotide của đầu mũ chụp 5' của hầu như toàn bộ mRNA của tếbào Tuy nhiên, một vài mRNA của tế bào có chứa một vị trí tiếp nhận ribosomebên trong (IRES) nằm ở vị trí xa hơn phía hạ nguồn Ngoài ra, ở một vài mRNAvirus thiếu mũ chụp 5', sự dịch mã được khởi đầu tại vị trí IRES bởi bộ máy dịch

mã của tế bào chủ eukaryote bị nhiễm

Hình 13: Khởi sự phiên mã ở eukaryote Bước 1 và 2: Các thành phần khác gắn vào phức hợp tiểu phần 40S-eIF3 hình thành phức hợp khởi sự dịch mã Bước 3: Phức hợp khởi sự trượt dọc mRNA và đặt tiểu phần nhỏ cùng với Met-tRNAi Met vào vị trí codon khởi đầu Bước 4: Tiểu phần lớn 60S gắn vào hình thành ribosome 80S sẵn sàng cho dịch mã Hai nhân tố khởi sự, eIF2 (bước 1) và eIF5 (bước 4) là những protein gắn GTP, và GTP này được thủy phân trong suốt quá trình khởi

sự [Hình sửa lại từ R Mendez và J D Richter, 2001, Nature Rev Mol Cell Biol 2 :521.]

3.5.2.2 Kéo dài dịch mã

Phức hợp 80S ribosome – Met-tRNAiMetnằm đúng vị trí bây giờ đã sẵn sàngcho sự thêm vào các aminoacid Giống như trường hợp khởi sự, sự kéo dài chuỗicũng cần một nhóm các protein đặc biệt gọi là các nhân tố kéo dài (EF) Những

bước chủ yếu trong quá trình kéo dài bao gồm sự đi vào của aminoacyl-tRNA, sựhình thành liên kết peptide và sự chuyển động của ribosome theo từng codon mộtdọc theo mRNA Sau khi quá trình khởi sự hoàn thành, Met-tRNAiMetđược gắn vào

vị trí P trên 80S ribosome Vị trí này của ribosome được gọi là vị trí P bởi vì đây là

vị trí tRNA gắn với chuỗi polypeptide đang dài ra Aminoacyl-tRNA thứ hai ở dạng

phức hợp bậc ba liên kết với EF1α∙GTP được đưa vào trong ribosome và gắn vào vịtrí A - nơi gắn vào của tRNA đã được aminoacyl hóa (bước 1) Nếu anticodon củaaminoacyl-tRNA kế tiếp (thứ hai) bắt cặp chính xác với codon thứ hai trên mRNA,GTP trong phức hợp EF1α∙GTP bị thủy phân Sự thủy phân GTP xúc tiến thay đổihình dạng của ribosome, dẫn đến việc gắn chặt của aminoacyl-tRNA vào vị trí A vàgiải phóng phức hợp EF1α∙GDP (bước 2) Sự thay đổi hình dạng này còn đặt đầu 3'

đã được aminoacyl hóa của tRNA ở vị trí A gần với đầu 3' của Met-tRNAiMet ở vịtrí P Sự thủy phân GTP và sự gắn chặt sau đó sẽ không xảy ra nếu anticodon trênaminoacyl-tRNA kế tiếp không bắt cặp được với codon tại vị trí A Trong trườnghợp này, phức hợp bậc ba sẽ rời khỏi, để lại vị trí A trống có thể kết hợp với nhữngphức hợp aminoacyl-tRNA–EF1α∙GTP khác cho đến khi có một tRNA thích hợpbắt cặp bổ sung gắn vào Hiện tượng này đóng góp vào tính trung thực, chính xáccủa việc gắn aminoacyl-tRNA vào vị trí A

Với Met-tRNAiMet khởi đầu ở vị trí P và aminoacyl-tRNA thứ hai gắn chặtvào vị trí A, nhóm α-animo của amino acid thứ hai phản ứng với methionie đã đượchoạt hóa (liên kết ester) trên tRNA khởi đầu, tạo thành một liên kết peptide Phảnứng peptidyltransferase được xúc tác bởi rRNA lớn, giúp định hướng những phân tửtương tác một cách chính xác

Tiếp theo sự tổng hợp liên kết peptide, ribosome được dịch chuyển dọc theomRNA một khoảng cách bằng một codon Sự dịch chuyển này được xúc tiến bởi sựthủy phân của GTP trong phức hợp EF2∙GTP Sự dịch chuyển này làm chotRNAiMet, bây giờ đã không còn methionine nữa, được chuyển vào vị trí E (Exit)trên ribosome; đồng thời, tRNA thứ hai, bây giờ đã được gắn cộng hóa trị vào mộtdipeptide (một peptidyl-tRNA), được dịch chuyển vào vị trí P (bước 4) Từ đó sựdịch chuyển trả hình dạng ribosome về một trạng thái mà vị trí A được mở và cókhả năng tiếp nhận một tRNA đã được aminoacyl hóa khác tạo phức hợp vớiEF1α∙GTP, bắt đầu một chu trình kéo dài chuỗi khác

Sự lặp lại của chu trình kéo dài thêm các amino acid từng cái một vào đầu Ccủa polypeptide đang kéo dài như được chỉ dẫn từ trình tự mRNA cho đến khi gặpcodon kết thúc Ở những chu trình tiếp theo, sự thay đổi hình dạng xảy ra ở bướchai đẩy tRNA không được acyl hóa ra khỏi vị trí E Trong lúc chuỗi polypeptide trởnên dài hơn, nó len lỏi qua một rãnh ở tiểu phần lớn của ribosome và rời khỏi ở một

vị trí đối diện với vị trí tương tác với tiểu phần nhỏ

Hình 14: Chu trình kéo dài chuỗi peptidyl trong quá trình dịch mã ở eukaryote Khi ribosome 80S kết hợp với Met-tRNAi Met ở vị trí P của ribosome, một phức hợp bậc ba mang amino acid thứ 2 (aa 2 ) gắn vào vị trí A (bước 1) Sự thủy phân GTP trong phức hợp EF1α∙GTP gây ra sự thay đổi hình dạng của ribosome (bước 2) Sau đó rRNA lớn xúc tác sự hình thành liên kết peptide giữa Met i và aa 2 (bước 3) Sự thủy phân GTP trong phức hợp EF2∙GTP gây ra một biến đổi hình dạng khác của ribosome, dẫn đến sự dịch chuyển một codon dọc theo mRNA và chuyển tRNAi Met không còn acyl hóa vào vị trí E

và tRNA với đoạn peptide vào vị trí P (bước 4) Chu trình có thể bắt đầu lại với việc gắn một phức hợp bậc ba mang aa 3 vào vị trí A đang được mở Trong chu trình thứ hai và những chu trình tiếp theo, tRNA tại vị trí E bị đẩy ra trong bước thứ 2 do sự biến đổi hình dạng gây ra bởi sự thủy phân GTP trong phức hợp EF1α∙GTP [Hình sửa lại từ K H Nierhaus và cs, 2000, trong R A Gerrett và cs, eds., The Ribosome: Structure, Function, Antibiotivà cs, and Cellular Interactions, ASM Press, p 319.]

3.5.2.3 Kết thúc dịch mã

Giai đoạn cuối cùng của quá trình dịch mã cũng cần những tín hiệu phân tử cótính đặc hiệu cao, quyết định số phận của phức hợp mRNA-ribosome-tRNA-peptidyl Có hai dạng nhân tố giải phóng (RF) đặc hiệu đã được phát hiện Ởeukaryote, eRF1 (có hình dạng tương tự tRNA) có vẻ hoạt động bằng cách gắn vào

vị trí A của ribosome và nhận biết codon kết thúc một cách trực tiếp Giống nhưmột vài nhân tố khởi sự và kéo dài đã đề cập ở trên, nhân tố giải phóng thứ hai ởeukaryote, eRF3, là một protein gắn GTP Phức hợp eRF3∙GTP hoạt động phối hợpvới eRF1 để xúc tiến sự phân cắt peptidyl-tRNA, từ đó giải phóng chuỗi protein vừahoàn thành Ở vi khuẩn có hai nhân tố giải phóng (RF1 và RF2) cũng có chức năngtương tự như eRF1 và một nhân tố gắn GTP (RF3) tương tự như eRF3

Hình 15: Sự kết thúc dịch mã ở eukaryote Khi một ribosome mang một chuỗi protein mới được tổng hợp đi đến codon kết thúc (UAA, UGA, UAG), nhân tố giải phóng eRF1 đi vào phức hợp ribosome, có thể là tại vị trí A hoặc gần đó cùng với phức hợp eRF3∙GTP Đi kèm với sự thủy phân GTP là sự phân cắt chuỗi peptide khỏi tRNA tại vị trí P và sự giải phóng các tRNA cùng với hai tiểu phần của ribosome.

Sau khi giải phóng khỏi ribosome, protein mới được tổng hợp sẽ gấp cuộnthành hình dạng không gian ba chiều nhờ những protein gọi là chaperone Nhữngnhân tố giải phóng khác sau đó sẽ xúc tiến sự tách ra của ribosome, giải phóng cáctiểu phần, mRNA và tRNA kết thúc Từ đó lại bắt đầu một vòng dịch mã mới

3.5.3 Polysome và sự tái sử dụng ribosome

Quá trình dịch mã của một phân tử mRNA ở eukaryote để có được một protein

có kích cỡ trung bình cần khoảng 30-60 giây Có hai hiện tượng làm tăng đáng kể

tốc độ tổng hợp protein của tế bào: quá trình dịch mã đồng thời một phân tử mRNAbởi nhiều ribosome và việc tái sử dụng nhanh chóng các tiểu phần ribosome sau khichúng rời khỏi từ đầu 3' của mRNA Sự dịch mã đồng thời một mRNA bởi nhiềuribosome có thể thấy rõ trên hình hiển vi điện tử và bằng phân tích lắng tụ(sedimentation analysis) cho thấy mRNA gắn vào những ribosome mang nhữngchuỗi polypeptide đang được tổng hợp Những cấu trúc này được gọi là polyribosomehay polysome, có hình vòng tròn trên hình hiển vi điện tử ở một vài loại mô Nhữngnghiên cứu sau đó trên tế bào nấm men đã giải thích hình dạng vòng tròn củapolyribosome và gợi ý cách thức tái sử dụng ribosome một cách hiệu quả.

Hình 16: Mô hình vòng polysome và sự tái sử dụng các tiểu phần ribosome

Có thể có rất nhiều các ribosome cùng lúc dịch mã cho một phân tử mRNA của eukaryote Vòng tròn polysome được ổn định bằng tương tác giữa các protein gắn tại hai đầu 3' và 5' Khi một ribosome hoàn thành sự dịch mã và tách rời khỏi đầu 3', các tiểu phần tách riêng đó có thể nhanh chóng tìm thấy vùng mũ chụp 5' gần đó và khởi đầu một quá trình tổng hợp protein khác.

Những nghiên cứu này cho thấy rằng những bản sao của một protein được tìmthấy ở tất cả các tế bào eukaryote, protein gắn poly(A) (PABPI), có thể tương tácvới cả đuôi poly(A) của mRNA lẫn tiểu phần 4G của eIF4 ở nấm men Hơn nữa,tiểu phần 4E của eIF4 ở nấm men gắn vào đầu 5' của một mRNA Những tương tácnày làm cho hai đầu của một phân tử mRNA có thể được gắn kết bởi những proteincan thiệp, tạo nên vòng tròn mRNA Bởi vì hai đầu của một polysome tương đốigần với nhau nên những tiểu phần ribosome vừa mới rời khỏi đầu 3' được định vịgần đầu 5', làm cho sự tái khởi đầu xảy ra bởi tương tác giữa tiểu phần 40S với eIF4gắn vào mũ chụp 5' Con đường xoay vòng này xảy ra ở nhiều tế bào eukaryote vàgiúp tăng cường sự tái sử dụng ribosome và từ đó làm tăng hiệu quả tổng hợpprotein của tế bào

3.6.Sự định vị và biến đổi sau dịch mã của protein

Số phận ban đầu của một protein được quyết định bởi những trình tự peptidengắn trên mỗi chuỗi polypeptide Đoạn peptide tín hiệu này dài khoảng 20-30

amino acid, gắn vào những phần tử nhận biết tín hiệu Những phần tử này sẽ gắnvào một thụ thể bên trong mạng lưới nội chất Điều này làm cho đoạn peptide có thể

đi vào bên trong lumen của mạng lưới nội chất cùng với chuỗi polypeptide vừa mớidịch mã Đoạn peptide tín hiệu này sau đó sẽ bị cắt bỏ khỏi chuỗi bởi enzymepeptidase Những protein được định trù vào trong những bào quan trong tế bào nhưlysosome và peroxisome cần có sự biến đổi bằng cách thêm vào những trình tự mụctiêu và được vận chuyễn vào những thụ thể tín hiệu mục tiêu

Sự thêm vào những trình tự mục tiêu để xúc tiên sự định vị là một ví dụ về sựbiến đổi của chuỗi polypeptide vừa mới tổng hợp, một quá trình được gọi là biếnđổi sau dịch mã Những ví dụ khác bao gồm sự hình thành các liên kết disulphide,

sự phân cắt các polypeptide vận chuyển, hydroxyl hóa và phosphoryl hóa

Sự hình thành các liên kết disulphide đóng vai trò quan trọng cho sự gấp cuộn

và hình thành cấu trúc không gian ba chiều của protein Ví dụ như, đột biến trênFGFR3 gây ra sự hình thành thêm các liên kết disulphide giữa những thụ thể bêncạnh dẫn đến tình trạng gây tử vong gọi là chứng loạn sản thanatophoric Sự thất bạitrong việc phân cắt đoạn peptide vận chuyển trong procollagen để hình thành nêncollagen trưởng thành gây ra một tình trạng cử động quá mức ở khớp nối gọi là hộichứng Ehlers-Danlos typr VII Sự hydroxyl hóa lysine và proline cần thiết cho sựhình thành hydroxylysine và hydroxyproline Sự vắng mặt của enzyme lysinehydroxylase gây ra một hội chứng khác gọi là hội chứng Ehler-Danlos type VI, mộttình trạng liên quan đến thị giác yếu Cuối cùng, sự phosphoryl hóa là một sự kiệnchủ yếu trong qua trình truyền tín hiệu ở tất cả các tế bào

3.7.Sự điều hòa biểu hiện gene

Như chúng ta đã biết, cấu trúc và chức năng của mỗi loại tế bào đều đượcquyết định bởi các protein mà nó chứa, vì vậy việc điều hòa sự biểu hiện của gene làmột lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử tế bào Thông thường, việc quyếtđịnh khởi sự phiên mã của một gene mã hóa cho một protein nào đó là một cơ chếchủ yếu trong việc điều khiển sự sản xuất của protein đó trong tế bào Bằng cáchđiều khiển sự khởi sự phiên mã, một tế bào có thể điều hòa những protein nào mà

nó sản xuất và tốc độ sản xuất của nó Khi sự phiên mã của một gene bị ức chế,mRNA tương ứng cùng với protein mà nó mã hóa được tổng hợp với một tốc độthấp Ngược lại, khi sự phiên mã của một gene được kích hoạt, cả mRNA và protein

mã hóa được sản xuất rất nhanh

Ở hầu hết các vi khuẩn và các sinh vật đơn bào, sự biểu hiện gene được điềuhòa chủ yếu để điều chỉnh bộ máy enzyme và những thành phần cấu trúc của tế bào

để thích nghi với sự thay đổi của môi trường Như vậy, ở một thời điểm nào đó, một

tế bào vi khuẩn thường chỉ tổng hợp những protein mà nó cần cho sự tồn tại dướinhững điều kiện nhất định Ngoài ra, ở những sinh vật prokaryote này quá trìnhphiên mã và dịch mã hầu như xảy ra cùng lúc nên sự điều hòa biểu hiện gene chỉchủ yếu ở giai đoạn khởi sự phiên mã

Ở những sinh vật đa bào, sự biểu hiện gene phần lớn được hướng vào sự đảmbảo đúng những gene cần biểu hiện ở một loại tế bào nhất định vào đúng thời điểmtrong quá trình phát triển phôi, biệt hóa mô cũng như trong những giai đoạn pháttriển, điều kiện sinh lý khác nhau Do đặc tính cấu tạo của tế bào và sinh vậteukaryote và sự tách biệt về không gian và thời gian giữa hai quá trình phiên mã vàdịch mã, sự điều hòa biểu hiện gene ở eukaryote có thể xảy ra ở nhiều cấp độ hơn sovới prokaryote: điều hòa ở cấp độ nhiễm sắc chất và cấu trúc của bộ gene; điều hòa

ở cấp độ khởi đầu phiên mã; điều hòa ở cấp độ kéo dài phiên mã, ổn định mRNA vàcắt nối luân phiên (alternative splicing); điều hòa dịch mã; và điều hòa sau dịch mã.Tuy nhiên, tựu chung lại, cấp độ điều hòa biểu hiện gene chủ yếu của eukaryotecũng giống như các tế bào prokaryote đó là cấp độ khởi đầu phiên mã

4. CƠ SỞ CỦA DI TRUYỀN

Những đại phân tử DNA này chứa những thông tin quyết định trình tự aminoacid, cấu trúc và chức năng của tất cả những protein trong một tế bào, hay nói cáchkhác chúng chứa thông tin cần thiết để xây dựng nên tế bào và mô của một sinh vật

Sự sao chép lại những thông tin này một cách chính xác ở tất cả các loài đảm bảotính kế tục di truyền từ đời này sang đời khác và đóng vai trò then chốt cho sự pháttriển bình thường của một cá thể

4.2.Sự sao chép DNA – cơ sở phân tử của di truyền

James D Watson và Francis Crick cho ra đời mô hình cấu trúc DNA năm

1953, sử dụng công trình tinh thể học tia X của Rosalind Franklin, chứng tỏ rằngDNA có cấu trúc xoắn kép[30][31] Sự bắt cặp các base bên trong mô hình xoắn képDNA của Watson và Crick gợi ý rằng mạch DNA mới được tổng hợp bằng cách sửdụng mạch sẵn có (mạch mẹ) làm khuôn để hình thành nên mạch con mới bổ sungvới mạch mẹ Như vậy có hai cơ chế được suy ra từ mô hình này: cơ chế bảo tồn vàbán bảo tồn Trong cơ chế bảo tồn, hai mạch con tạo ra một phân tử DNA mạch đôimới với mạch đôi mẹ vẫn nguyên vẹn Trong cơ chế bán bảo tồn, mạch mẹ đượctách ra và mỗi cái tạo ra một phân tử mạch đôi với mạch con bắt cặp base với mạch

mẹ M Meselson và W F Stahl đã tìm ra bằng chứng cho thấy mạch đôi DNAđược sao chép theo cơ chế bán bảo tồn

Như vậy, việc sao chép một mạch khuôn DNA tạo thành mạch bổ sung là mộtđặc điểm chung của sự sao chép DNA và phiên mã từ DNA ra RNA Ở cả haitrường hợp, thông tin trên mạch được bảo toàn Ở một vài virus, những phân tửRNA mạch đơn đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp mạch RNA bổ sunghoặc mạch DNA.

4.2.1 Đoạn mồi

Giống như RNA, DNA được tổng hợp từ những đơn phân deoxynucleoside triphosphate (dNTP) Và cũng giống như sự tổng hợp RNA, sự tổng hợp DNA luôndiễn ra theo chiều từ 5'  3' vì mạch được phát triển từ sự hình thành một liên kếtphosphoester giữa 3' oxygen của mạch đang dài ra và α phosphate của một dNTP.Như đã đề cập ở phần trên, RNA polymerase có thể tìm kiếm vị trí bắt đầu phiên

5-mã thích hợp trên mạch đôi DNA và khởi sự tổng hợp một phân tử RNA bổ sungvới mạch DNA Ngược lại, DNA polymerse không thể khởi sự tổng hợp chuỗi ngay

từ đầu mà thay vào đó, chúng cần có một mạch RNA hoặc DNA ngắn, gọi là đoạnmồi primer, để bắt đầu sự phát triển của chuỗi Với một mồi bắt cặp với mạc khuôn,DNA polymerase gắn các deoxynucleotide vào nhóm hydroxyl tự đo ở đầu 3' củađoạn mồi theo sự chỉ định bởi trình tự trên mạch khuôn

Khi đoạn mồi là RNA, mạch con được tạo thành là RNA ở đầu 5' và là DNA ởđầu 3'

4.2.2 Sự tháo gỡ mạch đôi và chĩa ba sao chép

Để mạch đôi DNA có chức năng như là mạch khuôn trong suốt sự sao chép,hai mạch xoắn quấn vào nhau phải được tháo gỡ để các base có thể bắt cặp được vớicác base của dNTP Sự tháo gỡ này của mạch DNA mẹ được tiến hành nhờ enzymehelicase, bắt đầu tại những đoạn đặc biệt trên DNA gọi là điểm bắt đầu sao chép(replication origin) Trình tự của những điểm này khác nhau rất lớn ở những sinhvật khác nhau mặc dù chúng thường chứa A, T Khi các enzyme helicase đã tháo gỡmạch DNA ở điểm bắt đầu, một loại RNA polymerase đặc biệt gọi primase đến đểtạo nên đoạn mồi RNA ngắn bổ sung với mạch khuôn đã tháo gỡ Đoạn mồi tronglúc vẫn bắt cặp với mạch DNA, nó được kéo dài bởi một DNA polymerase, từ đótạo nên mạch con mới

Hình 17: Sơ đồ tổng hợp DNA ở mạch tới và mạch chậm tại chĩa ba sao chép Các nucleotide được thêm vào bởi DNA polymerase ở mỗi mạch con theo chiều từ 5'

 3' Mạch tới được tổng hợp liên tục từ một đoạn mồi RNA (màu đỏ) ở đầu 5' Mạch chậm được tổng hợp không liên tục từ nhiều đoạn mồi RNA được tạo ra một cách gián đoạn mỗi khi một vùng mới của mạch đôi được tách ra Sự kéo dài những đoạn mồi ban đầu tạo ra những đoạn Okazaki Khi mỗi đoạn này được kéo dài gần đến đoạn trước nó, đoạn mồi sẽ bị tháo gỡ và những đoạn này được nối lại với nhau Quá trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tổng hợp được toàn bộ mạch chậm.

Vùng DNA mà tại đó tất cả những protein tập hợp lại để tiến hành sao chéptổng hợp mạch con được gọi là chĩa ba sao chép Khi sự sao chép diễn ra, chĩa basao chép và những protein liên quan rời khỏi điểm bắt đầu Như đã biết, việc táchmạch mạch đôi DNA tạo nên một áp lực xoắn lên những đoạn xoắn kép lân cận Áplực này được giải phóng bởi enzyme topoisomerase I Để cho DNA polymerase cóthể chạy dọc theo và sao chép DNA, helicase phải liên tục tách mạch vàtopoisomerse phải tháo bỏ siêu xoắn được tạo thành từ đó Một vấn đề phức tạptrong hoạt động của chĩa ba sao chép DNA nảy sinh từ hai tính chất: hai mạch củaDNA mẹ là đối song song, và DNA polymerase (cũng giống như RNA polymerase)

có thể gắn các nucleotidr vào mạch mới chỉ theo chiều 5'  3' Sự tổng hợp của mộtmạch con gọi là mạch tới, có thể tiến hành một cách liên tục từ một đoạn mồi RNAtheo hướng 5'  3', cùng hướng di chuyển của chĩa ba sao chép Vấn đề đến từ việctổng hợp mạch con khác, gọi là mạch chậm

Bởi vì sự phát triển của mạch chậm cần phải xảy ra theo hướng 5'  3' nênviệc sao chép mạch khuôn của nó cần phải xảy ra theo hướng ngược lại với chiều dichuyển của chĩa ba sao chép Một tế bào hoàn thành việc này bằng cách tổng hợpmột đoạn mồi mới dài khoảng vài trăm base trên mạch mẹ thứ hai Mỗi đoạn primernày bắt cặp vào mạch khuôn của chúng và được kéo dài theo hướng 5'  3', tạo nênnhững đoạn không liên tục gọi là đoạn Okazaki (đặt tên theo người phát hiện rachúng Reiji Okazaki) Đoạn mồi RNA của mỗi đoạn Okazaki được tháo bỏ và thay

thế bằng sự phát triển của những đoạn Okazaki kế bên; cuối cùng một enzyme gọi

là DNA ligase gắn những đoạn gần nhau cho ra một mạch con hoàn chỉnh

4.2.3 Helicase, primase, DNA polymerase và các protein tham gia vào sao chép

Những nghiên cứu trên DNA virus, đặc biệt là DNA SV40, bộ gen vòng củamột virus gây nhiễm ở khỉ đã giúp các nhà khoa học hiểu chi tiết hơn về nhữngprotein ở eukaryote tham gia vào sự sao chép DNA Hình dưới đây minh họa nhiềuloại protein phối hợp vào việc sao chép SV40 DNA tại chĩa ba sao chép Nhữngphức hợp nhiều thành phần khác nhau này cho phép tế bào thực hiện một chuỗi các

sự kiện để hoàn thành được chức năng cần thiết của tế bào Trong bộ máy phân tửsao chép SV40 DNA, một hexamer của một protein virus gọi là T-antigen có nhiệm

vụ tách mạch đôi tại chĩa ba Tất cả những protein khác liên quan đến sự sao chépSV40 DNA được cung cấp bởi tế bào chủ Những đoạn mồi cho mạch con DNA ởmạch tới và mạch sau được tổng hợp bởi một phức hợp primase, và DNApolymerase α (Pol α), cái mà có nhiệm vụ kéo dài đoạn mồi RNA vớideoxynucleotide, tạo nên đoạn mồi hỗn hợp RNA-DNA

Đoạn mồi được kéo dài thành mạch con DNA bởi DNA polymerase (Pol) Pol

ít có khả năng sai sót hơn so với Pol α, nó tạo một phức hợp với Rfc (nhân tố saochép C) và PCNA (kháng nguyên nhân tăng sinh tế bào), cái mà thay thế phức hợpprimase-Pol α sau sự tổng hợp mồi

Sau khi DNA mẹ được tách thành những mạch khuôn đơn tại chĩa bao sao chép,

nó được gắn bởi nhiều bản sao của RPA (protein sao chép A) Việc gắn vào của RPAduy trì mạch khuôn ở một hình dạng không thay đổi tối ưu cho sự sao chép bởi DNApolymerase Những protein RPA gắn vào sẽ bị đẩy ra khỏi mạch mẹ bởi Pol α và Polkhi chúng tổng hợp những mạch bắt cặp bổ sung với những mạch mẹ

Ngoài ra ở eukaryote còn có những protein khác tham gia vào sao chép DNA.Enzyme topoisomerase kết hợp với mạch DNA mẹ ở phía trước helicase để giải bớt

áp lực xoắn gây ra bởi sự tách mạch ở mạch mẹ Ribonuclease H và FEN I tháo gỡribonucleotide tại đầu 5' của những đoạn Okazaki; những ribonucleotide này sẽđược thay thế bằng deoxynucleotide được thêm vào bởi DNA pol khi nó kéo dàiđoạn Okazaki ở phía thượng nguồn Những đoạn Okazaki liên tiếp được gắn vàonhau bởi DNA ligase qua những liên kết 5'  3' thông thường

Hình 18: Mô hình chĩa ba sao chép SV40 DNA và những protein liên quan Hexamer của T-antigen lớn (1) là một protein của virus có chức năng như một helicase giúp tách mạch DNA Những vùng mạch đợn của mạch khuôn được tách ra bởi T- antigen này được gắn bởi những bản sao của protein RPA (2) Mạch tới được tổng hợp bởi phức hợp DNA polymerase δ (Pol δ), PCNA và Rfc (3) Những đoạn mồi cho sự tổng hợp mạch chậm (màu đỏ, RNA; màu xanh, DNA) thì được tổng hợp bởi một phức hợp gồm DNA polymerase α (Pol α) và primase (4) Đầu 3' của mỗi đoạn mồi được tổng hợp bởi Pol α-primase sau đó sẽ được gắn bởi phức hợp PCNA-Rfc-Pol Phức hợp này tiếp tục tổng hợp kéo dài đoạn mồi (5) [Sơ đồ được sửa lại từ S J Flint và cs, 2000, Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control, ASM Press.]

4.2.4 Sự sao chép hai chiều

Theo lý thuyết, sự sao chép DNA từ một điểm bắt đầu có thể cho ra một chĩa

ba sao chép di chuyển theo một chiều Nhưng thật ra sự sao chép DNA thường xảy

ra theo hai chiều: có thể có hai chĩa ba sao chép ở cùng một điểm bắt đầu và chúng

di chuyển theo hai thướng ngược nhau Việc sao chép hai chiều này đã được chứngminh bởi một vài thí nghiệm Tế bào prokaryote và eukaryote đều sử dụng cơ chếsao chép hai chiều này Trong trường hợp SV40 DNA, sự sao chép được khởi sựbằng việc gắn hai helicase T-antigen vào một điểm khởi đầu duy nhất và việc tậphợp những protein khác tạo nên hai chĩa ba sao chép Hai chĩa ba này sau đó dichuyển theo hai hướng ngược nhau từ điểm khởi đầu với sự tổng hợp mạch tới lẫnmạch chậm xảy ra ở cả hai chĩa ba

Không giống như SV40 DNA, những phân tử DNA nhiễm sắc thể ở eukaryotechứa nhiều điểm bắt đầu khác nhau cách nhau khoảng vài chục cho đến vài trămkilobase Phức hợp nhận diện điểm bắt đầu là một protein gồm 6 tiểu đơn vị gọi là

ORC gán vào mỗi điểm và liên kết với những protein khác cần cho việc lắp nhữnghelicase gồm 6 protein MCM Hai helicase MCM ngược nhau tách hai mạch mẹ ởđiểm khởi đầu với những protein RPA gắn vào mạch đơn DNA đã tách ra Sự tổnghợp các đoạn mồi và những bước tiếp theo trong sao chép DNA được cho là giốngvới sự sao chép của SV40 DNA.

Hình 19: Hình hiển vi điện tử thể hiện sự sao chép hai chiều ở SV40 DNA [Xem G C Fareed và cs, 1972, J Virol 10:484; photographs courtesy of N P Salzman.]

Sự sao chép DNA tế bào và những sự kiện khác dẫn đến sự tăng sinh của tếbào được điều hóa rất chặt chẽ để chỉ sản xuất ra đúng số lượng tế bào thích hợp cấuthành nên mỗi mô trong suốt quá trình phát triển và sinh sống của một sinh vật.Cũng như sự phiên mã của hầu hết các gene, việc điều khiển ở bước khởi sự cũng là

cơ chế chủ yếu trong việc điều hòa sao chép DNA Sự hoạt hóa helicase MCM cầncho việc khởi sự sao chép được điều hòa bởi những protein kinase đặc biệt gọi làkinase phase S phụ thuộc cyclin (S-phase cyclin-dependent kinase) Những kinasephụ thuộc cyclin khác điều hòa những quá trình khác của sự tăng sinh tế bào, baogồm quá trình nguyên phân phức tạp mà nhờ đó một tế bào eukaryote phân chiathành hai tế bào con có bộ nhiễm sắc thể giống hệt tế bào mẹ

5. KẾT LUẬN – TRIỂN VỌNG TƯƠNG LAI

Trình tự bộ gene người là mỏ vàng cho những khám phá mới về sinh học phân

tử tế bào, những protein mới - nền tảng của các liệu pháp chữa bệnh hiệu quả - vàthậm chí còn cho những khám phá liên quan đến lịch sử sơ khai và tiến hóa của loài

người chúng ta Tuy nhiên, vì chỉ có khoảng 1.5% trình tự là mã hóa cho proteinnên việc tìm kiếm những gene mới giống như là mò kim trong đống cỏ khô vậy.Khác với bộ gene vi khuẩn do rất ít intron nên việc xác định các gene tương đối dễdàng Chỉ đơn giản tìm kiếm những đoạn khung đọc mở dài có thể giúp ta xác địnhhầu hết các gene Ngược lại, việc tìm kiếm các gene ở người thì cực kỳ phức tạp dohầu hết gene đều bao gồm rất nhiều những đoạn exon ngắn xen kẽ bởi những đoạnintron không mã hóa dài hơn rất nhiều Cho đến nay người ta chỉ xác định đượckhoảng phân nửa các gene ở người Và việc xác định các đơn vị phiên mã phức chỉbằng cách khảo sát trình tự DNA lại còn mang tính thử thách hơn nữa Những tiến

bộ trong phương pháp sinh tin học để xác định gene và mô tả đặc tính những bảnsao cDNA của những mRNA tách từ hàng trăm loại tế bào ở người có lẽ sẽ đưa đếnviệc khám phá ra những protein mới và sự hiểu biết về những quá trình sinh học,ứng dụng của chúng trong y học và nông nghiệp

Mặt khác, hiểu biết của chúng ta về những quá trình cơ bản của tế bào (saochép DNA, phiên mã và dịch mã) có lẽ sẽ không thay đổi nhiều trong tương lai vìchúng đã được đặt trên một nền tảng của vô số những bằng chứng từ những kết quảthí nghiệm Tuy nhiên, độ sâu hiểu biết của chúng ta sẽ tiếp tục tăng lên khi ngàycàng có nhiều khám phá chi tiết hơn về cấu trúc và tương tác giữa các bộ máy đạiphân tử liên quan Sự xác định cấu trúc không gian của RNA polymerase, các tiểuphần của ribosome và những protein trong sự sao chép DNA đã cho phép các nhànghiên cứu thiết kế được những phương pháp thử nghiệm sâu sát hơn nhằm khámphá cách hoạt động của những đại phân tử này Và sự hiểu biết chi tiết hơn có thể sẽcho phép thiết kế và tạo ra nhiều loại thuốc mới hiệu quả hơn trong chữa trị bệnh ởngười Ví dụ như, cấu trúc có độ phân giải cao của ribosome giúp chúng ta thấuhiểu hơn cơ chế kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn mà không làmảnh hưởng đến chức năng ribosome của vật chủ Phát hiện mới này có thể cho phépchúng ta tạo ra những kháng sinh hiệu quả hơn Tương tự, sự hiểu biết chi tiết vềnhững cơ chế điều hòa phiên mã những gene ở người có thể đưa đến những chiếnlược điều trị có thể làm giảm những phản ứng miễn dịch không thích đáng dẫn đếncác bệnh như đa xơ cứng (multiple sclerosis) và viêm khớp; làm giảm sự phân chia

tế bào không thích đáng trong ung thư; và những quá trình bệnh học khác

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Harvey Lodish, Arnold Berk và cs (2003), Molecular Cell Biology 5 th Edition,

Chapter 4: Basic molecular genetic mechanism, pp 101-145

[2] ] Harvey Lodish, Arnold Berk và cs (2003), Molecular Cell Biology 5 th Edition,

Chapter 10: Molecular structure of genes and chromosomes, pp 405-445

[3] Supratim Choudhuri and David B Carlson (2008), Genomivà cs: Fundamentals and Application, Chapter 1: Fundamentals of Structure-Function Analysis of

Eukaryoteic Protein-Coding Genes, pp 3-48, New York

Chương 2 TỔNG QUAN VỀ MICROARRAYGiới thiệu chung

DNA microarray analysis lần đầu tiên được mô tả vào giữa thập kỷ 1990 vàchúng được xem như là một phương tiện hữu ích cho việc khảo sát sự biểu hiệnđồng thời của hàng ngàn gen và đã nhanh chóng trở thành một phương tiện hữudụng cho việc nghiên cứu một loạt các quá trình sinh học Hầu hết tất cả nghiên cứuđều được thiết kế với một mục đích đơn giản là nhằm so sánh hai họ sinh học để tìmhiểu sự khác nhau trong việc biểu hiện gen của chúng, các gen này có chức năngliên quan đến một loạt các quá trình sinh học như là sự phát triển của các tế bào ungthư, các nguyên nhân dẫn đến bệnh hen suyễn, bệnh về tim, sự rối loạn về thầnkinh, hay là phân tích các yếu tố liên quan đến sự vô sinh Một lượng thông tin cógiá trị trong việc điều hòa nghĩa là hiện nay chúng đã có thể kiểm tra sự biểu hiệncủa một lượng lớn thông tin liên quan đến gen cũng như là RNA Các nghiên cứunày về mặt nguyên tắc phải đòi hỏi sử dụng các công nghệ kỹ thuật cho phép đồngthời phát hiện nhiều gen cùng một lúc với một khoảng thời gian ngắn nằm tronggiới hạn cho phép Do đó, trong chương này chúng tôi đề cập đến các phương phápphương tích sự biểu hiện của mRNA với một tần số cao

Chúng tôi chia chương này thành ba phần Phần một đề cập đến khả năng liênkết của DNA với chính bản thân nó; phần thứ hai đề cập đến vấn đề sử dụngphương pháp PCR (polymerase chain reaction) để khuếch đại một lượng lớn cáccDNA Và cuối cùng phần còn lại liên quan đến kỹ thuật dựa trên việc DNAsequencing để tiến hành định lượng các gen đã được gắn các dấu hiệu đánh dấu.Mỗi phương pháp kể trên đều có những ưu điểm riên của nó, tuy nhiên vẫn còn rấtnhiều hạn chế trong việc phân tích một lượng lớn thông tin biểu hiện của các gen.Trong khi đó, phân tích sự biểu hiện các gen dựa trên phương pháp sử dụng DNAmicroarray là một công cụ hữu ích trong việc phân tích một lượng lớn các gen Tuynhiên, nhược điểm duy nhất của nó là phải biết được trình tự các đoạn DNA đượcgắn trên phiến DNA microarray Hơn nữa, đây là một kỹ thuật rất tốn kém và xảy ramột vài vấn đề liên quan việc kiểm soát chất lượng và ít nhạy cảm Khác với việc sửdụng RT-PCR một phương pháp không tốn kém, tuy nhiên có một ưu thế trong việcxác định mức độ biểu hiện gen của các gen chưa biết Các phương pháp dựa trêngen sequencing như phương pháp Massively parallel signature sequencing(MPSS®) và serial analysis of gene expression (SAGE) cũng liên quan đến việcphân tích sự điều hòa các gen chưa biết nhưng các kỹ thuật này khá tốn kém và đòihỏi phải có một mức độ cơ sở hạ tầng nào đó cho phép sử dụng các kỹ thuật để đạtđược những kết quả tốt

Chúng tôi mong rằng việc trình bày theo sự phân bổ này có thể giúp chongười đọc có thể quyết định được phương pháp sử dụng nào tốt nhất cho các thínghiệm của mình

1 Giới thiệu DNA Microarrays

Rất nhiều phương pháp sinh học phân tử và hóa sinh đều là những công cụ hỗtrợ cho việc sử dụng phương pháp microarray Ví dụng như Biochip có một kíchthước nhỏ hơn khá nhiều so với một chiếc tem thư nhưng lại cho phép đo lường sựbiểu hiện đồng thời của hàng ngàn gen Biochip không chỉ thích hợp cho việc phântích sự biểu hiện gen và cho việc sắp xếp các mà còn được ứng dụng cho việc chuẩn

bị và phân tích mẫu Hiện nay, đã có rất nhiều nỗ lực hướng tới việc phát triển các

hệ thống các “lab-on-chip” tích hợp và tự động Trong một tương lai không xa, các

hệ thống như thế này sẽ trở thành một công cụ hữu ích trong việc chẩn đoán liênquan đến các gen và một vài các lĩnh vực khác trong các nghiên cứu liên quan đếngen, và trở thành một công cụ phân tích chính xác và giảm được chi phí tiêu tốn.Bên cạnh ứng dụng trong lĩnh vực microtechnology, một trong những lĩnh vực quantrọng gần đây là ứng dụng trong lĩnh vực nanotechnology, sự phát triển của công cụthang đo nanometer (10-9met) Việc thu nhỏ của mức độ này cung cấp khá nhiều lợiích khác nhau bao gồm việc giảm thiểu chi phí các sản phẩm, tăng tính tự động, tínhmềm dẻo của phương pháp Lĩnh vực ứng dụng biochip trong việc thiết kế nucleicarray thích hợp cho việc ứng dụng nanotechnology Mục tiêu của chương này nhằmtổng kết lại các quá trình chính trong việc thiết kế các microarrays hay “DNAchips” như một công cụ phân tích biểu hiện như một tần số cao và trong tương lai sẽngày càng phát triển hành một công cụ hữu ích

Thông tin các gen được mã hóa từ bộ genome người được đánh giá khoảng từ30,000 đến 40,000 gen, tổng cộng các đoạn có thể lên tới mười phần trăm tổng số3,2 tỷ nucleotide ((Lander và cs, 2001; Venter và cs, 2001; Zhuo và cs, 2001) Tuynhiên, trong thời điểm ghi nhận, Chỉ duy nhất một phần mười số lượng các genđược biết rõ về cấu trúc chức năng của các protein và enzyme mà chúng mã hóa.Hầu như các chuỗi nucleic acids đã được xác định trên nhiễm sắc thể, những thôngtin biểu hiện gen trong cơ sở dữ liệu vần còn gặp nhiều hạn chế Do đó, hầu như cấutrúc, chức năng protein mà các chuỗi trình tự mã hóa protein (ESTs) vẫn chưa đượcbiết đến Một tiêu điểm của các nghiên cứu liên quan đến y dược và hóa sinh là tạo

ra lượng thông tin về gen để giải thích cơ chế đồng hóa của tế bào, và đã trở thànhmột trong những cơ hội thách thức và đầy tiềm năng phát triển, nhưng ứng dụngnày khá thú vị và nhiệm vụ này đã tốn mất khá nhiều thời gian trong vài thập kỷqua Những quá trình này tiến hành càng nhanh bởi việc ứng dụng DNA microarraytrong việc phân tích sự biểu hiện của gen

2 Lịch sử phát minh DNA microarray.

Đầu tiên có thể kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick(1953), cho thấy có thể tách DNA thành hai mạch đơn (biến tính) khi xử lý nhiệthoặc dung dịch kiềm Năm 1961, Marmur & Doty mô tả quá trình ngược lại, hồitính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và lai phân tử Các nghiên cứu này gợi

ra cách phân tích axit nucleotide dựa trên mối liên hệ trình tự giữa chúng và cácphương pháp lai phân tử phát triển nhanh chóng.

Vào cuối những năm 1960, Pardue, Gall; Jones và Roberson tìm ra phương pháplai in situ (sau này kết hợp với mẫu dò đánh dấu huỳnh quang gọi là FISH) Phươngpháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính, sao cho DNA tạo thànhmạch kép với mẫu dò, ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trongphương pháp microarray Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, chophép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979

Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lênmột màng lọc theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cs(1979) đưa ra Trong kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên giá thể và laivới mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu) Saiki và cs (1989) đưa ramột cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng vàđích để phân tích được đánh dấu Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thểkhông thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos (1991) Đầunhững năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được Ried và cs;Balding & Ward giới thiệu để phân tích nhiều loại mẫu dò với phương pháp FISH.Hiện nay, phương pháp này được sử dụng để phân tích so sánh mRNA từ nhữngnguồn khác nhau

Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide đượctổng hợp in situ Năm 1994, Hoheisel và cs tăng mật độ chấm (spot) bằng cách dùngrobot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể giúp tăng tốc độ quá trình, giảm sai sót chắcchắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tínhchính xác vị trí

Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay Kỹthuật này phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCRkhông thể thiếu trong sinh học hiện nay

3 Nguyên tắc hoạt động của DNA microarray như thế nào?

3.1 Cấu trúc và chức năng của DNA microarray

DNA microarray function sử dụng các phương pháp, kỹ thuật lai phân tử cơbản được phát triển bởi Edward Southern và sử dụng khá thường xuyên kỹ thuậtSothern và Northern Blots.(Alwine và cs, 1977; Brown, 1993; Brown &Mackey,1997; Dyson, 1991; Southern, 1975) Điểm chủ yếu của phương pháp này là việc laichuyên biệt giữa chuỗi DNA đơn với nhau dựa trên nguyên lý kết hợp các base củaWatson-Crick Tính chuyên biệt kết hợp này có thể bị giảm trong những điều kiện

cụ thể làm giảm khả năng kết hợp ngăn cản quá trình lai giữa trong như các điểmmismatch ở một vị trí riêng lẻ trên một chuỗi của phân tử DNA

DNA microarrays, các chuỗi nucleic acid đã biết chuỗi trình tự được cố địnhtrên phiến mẫu Mẫu nucleic acid kiểm định được tiến hành đánh dấu và tiến hànhlai với các chuỗi nucleic acid đã cố định trên mẫu Dưới những điều kiện thích hợp,