Tinh sạch protein (tt) pps

IV.3 Sắc ký Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc đị

Tinh sạch protein

(tt)

IV Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên kết ái lực

Hàng ngàn protein đã được tinh sạch

ở dạng có hoạt tính dựa trên những

đặc tính căn bản như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực

Thông thường, một hỗn hợp protein

sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách,

mỗi giai đoạn dựa trên một đặc tính nhất định, để cuối cùng là một protein tinh sạch Ở mỗi bước phân tách, thử nghiệm xác định hoạt tính và xác định nồng độ protein đều được thực hiện Lượng đáng kể protein tinh sạch,

khoảng vài miligram, có thể giúp ta biết được cấu trúc không gian ba

chiều và cơ chế phản ứng của nó Vì vậy, sản lượng toàn phần là một điểm quan trọng của quá trình tinh sạch

Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa bằng muối, màng bán dẫn, sắc ký

IV.1 Tủa bằng muối

Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein

sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi là tủa bằng muối (salting out)

Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng

độ muối nhất định Vì vậy, hiện tượng

tủa bởi muối có thể được dùng để

phân đoạn protein Ví dụ như

fibrinogen tủa ở nồng độ muối

ammonium sulfate 0.8 M trong khi

phải đến nồng độ 2.4 M, albumin mới kết tủa Hiện tượng này được sử dụng

để tăng nồng độ của một dung dịch

protein loãng chứa các phân đoạn có hoạt tính của các bước tinh sạch

trước Nếu cần thiết, lượng muối có thể được loại bỏ bằng sự thẩm tách

IV.2 Sự thẩm tách

Protein có thể được phân tách bằng sự thẩm tách thông qua màng bán dẫn, chẳng hạn màng cellulose với nhiều

lỗ Những phân tử có cấu trức không gian nhất định lớn hơn dường kính

của lỗ sẽ bị giữ lại bên trong túi thẩm tách, trong khi đó, những phân tử nhỏ

hơn và các ion sẽ đi qua các lỗ đó ra ngoài túi Kỹ thuật này dùng để loại

bỏ muối hay tách những phân tử nhỏ, nhưng với kỹ thuật này không phân biệt được các loại protein với nhau

IV.3 Sắc ký

Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân

tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể

được sử dụng ngay cho việc định

lượng và định danh

Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động

và mẫu cần phân tách Trong đó, tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha cố định và pha di động Trong tinh sạch protein, có bốn

phương pháp được ứng dụng nhiều

nhất là sắc ký lọc gel dựa vào kích

thước của phân tử (size exclusion

chromagraphy), sắc ký trao đổi ion

dựa vào điện tích của phân tử (ion

exchange chromagraphy), sắc ký ái

lực dựa vào ái lực của phân tử với

một loại phân tử khác (affinity

chromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng

có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy)

IV.3.1 Sắc ký lọc gel

Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước

phân tử Mẫu sẽ được nạp vào đầu

một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ

polymer không tan nhưng có tính

hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay

polyacrylamide Sephadex,

Sepharose, và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn

những hạt có lỗ với đường kính chuẩn

là 100µm (0.1mm) Những phân tử

nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra

ngoài trước Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào

được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽ

phải đi qua đoạn đường dài hơn,

quanh co nên sẽ ra sau cùng

IV.3.2 Sắc ký trao đổi ion

Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang

một điện tích tương ứng với điểm pH

đó Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein Phương

pháp này gọi là phương pháp sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein)

mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose

(CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc

ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích

dương Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột

diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion

âm, thì tương tác với phân tử mang

điện tích âm Vì thế, những protein

cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha

động, những ion này sẽ thế phân tử

protein tương tác với các hạt mang

điện tích Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương,

do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích

Hình 1: minh họa sắc ký trao đổi ion

Hình 2: minh họa cơ chế giữa

protein trong hệ sắc ký trao đổi ion (a) Những hạt mang điện tích dương

sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm Protein tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó

(b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với

hạt cũng như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein

IV.3.3 Sắc ký ái lực

Đây là một phương pháp rất hiệu quả

và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein Kỹ thuật này dựa

trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học chuyên biệt Ví

dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi

cho qua cột mang những phân tử

glucose bằng liên kết cộng hóa trị

Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó

có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không

Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch

glucose đậm đặc vào Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn với

Concanavalin A thay thế những phân

tử glucose nối với cột

Hình 3: minh họa cho cơ chế tinh sạch Concanavalin A bằng sắc ký ái

lực

Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên

mã, những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA Hỗn hợp protein

thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắn vào thể

mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự

và được giữ lại Trong thí dụ này, yếu

tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao Ngoài ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng

nguyên và kháng thể để tinh sạch

kháng nguyên hay kháng thể Nhìn

chung, sắc ký ái lực có thể được dùng

để tách một protein vốn có khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột,

cột này sẽ được rửa lại để loại bỏ

những protein không tạo được nối,

cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao

hay thay đổi điều kiện để làm giảm

lực liên kết Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi

tương tác giữa protein và phân tử

được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao

IV.3.4 Sắc ký lỏng cao áp

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một

dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột

có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể Bản thân vật liệu

tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng

và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ

vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp Kết quả thực

có sự phân giải cao và phân tách

nhanh