Tinh sạch protein (p-3) doc

Tinh sạch protein p-3 Phân tách protein bằng điện di trên gel Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng

Tinh sạch protein (p-3)

Phân tách protein bằng điện di trên gel

Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách

là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật

điện di

1 Điện di một chiều

Một phân tử có mang điện tích sẽ

di chuyển trong điện trường Hiện tượng này, được đặt tên là điện di, giúp hướng tới một kỹ thuật rất

mạnh để phân tách protein và các đại phân tử khác như DNA và

RNA Vận tốc di chuyển (v) của

một protein (hay bất kỳ phân tử

nào) trong điện trường phụ thuộc vào lực điện trường (E), điện tích thực của protein (z) và hệ số ma sát

(f)

Lực điện Ez kéo phân tử mang điện tích tới điện cực trái dấu bị cản trở bởi lực kéo của độ nhớt fv tăng lên

do sự ma sát giữa phân tử đang

chuyển động với môi trường Lực

ma sát phụ thuộc vào cả khối

lượng, hình dạng của phân tử đang

di chuyển lẫn độ nhớt (η) của môi trường Với một khối cầu có bán

kính là r, ta có

Điện di luôn được thực hiện trên

gel (hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vì gel giống như một cái ray

phân tử sẽ làm tăng sự phân tách Những phân tử nhỏ hơn kích thước

lỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyên

qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không di chuyển Những phân tử có kích

thước trung bình di chuyển trong

gel với nhiều vận tốc khác nhau

điện di được thực hiện trên một

bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng Hướng của dòng điện từ trên xuống

Gel polyacrylamide, được tạo thành

từ sự polymer hóa acrylamide và sự liên kết chéo của

methylenebisacrylamide, được

chọn làm môi trường cho điện di vì

nó có tính trơ về mặt hóa học và

được tạo hình nhanh chóng Điện di

là một cách lọc qua gel mà theo đó tất cả các phân tử, không xét về

kích thước, sẽ bị tác động một lực

để di chuyển trong cùng một chất nền Gel ở đây có thể xem tương

đương với một hạt trong cột lọc

gel

Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di

trên acrylamide dưới điều kiện đã

bị biến tính Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium

dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu Mercaptoethanol

(2-thioethanol) hay dithiothreitol cũng

có thể được thêm vào để làm giảm

số nối disulfide Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối

lượng của protein Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của bản thân protein ban đầu; vì thế, điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng

kể đến điện tích của phức hợp

Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di Khi điện di

kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie

blue Những đánh dấu phóng xạ có thể được phát hiện bằng cách đặt

một tấm phim chụp x quang lên

miếng gel, quá trình này gọi là

phóng xạ tự ghi

Những protein nhỏ di chuyển

nhanh trong gel, trong khi những

protein lớn ở phía đầu, gần vị trí

nạp mẫu Tính di động của phần

lớn các chuỗi polypeptide dưới

những điều kiện như thế tỉ lệ với

khối lượng của chúng Tuy nhiên, cũng có vài protein giàu

carbohydrate và protein màng

không tuân theo mối tương quan

này SDS-PAGE có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao Chỉ với lượng nhỏ khoảng

0.1ug (~2pmol) protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie

blue và thậm chí ít hơn (~0.02ug)

vẫn có thể được phát hiện khi

nhuộm bằng bạc Những protein

chênh lệch về khối lượng khoảng 2% (ví dụ: 40 kD và 41 kD hay

khác nhau khoảng 10 acid amin) có thể phân biệt được bằng

SDS-PAGE

Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng ta đánh giá kết quả của quá trình tinh sạch Với những phân đoạn đầu

tiên, kết quả là dãy gồm rất nhiều protein Nhưng qua mỗi bước tinh sạch, số lượng protein sẽ giảm và

sẽ có một băng ngày càng đậm

Vạch đó tương ứng với protein mục tiêu

2 Điện di dựa vào điểm đẳng điện

Các protein còn có thể được phân tách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acid amin có tính acid và số acid

amin có tính base của chúng Điểm đẳng điện của một protein (pI) là

điểm pH mà ở đó điện tích thực của

nó bằng 0 Tại điểm pH này, tính di động của protein trong điện trường cũng bằng 0 bởi vì z trong công

thức (1) bằng 0 Mỗi một protein có một pI riêng; ví dụ như pI của

cytochrome C, một protein vận

chuyển ion có tính base cao, là

10.6, trong khi pI của albumin

huyết thanh, một protein có tính

acid trong máu, là 4.8 Giả định cho

một hỗn hợp protein chạy trong

điện trường trong một miếng gel

với một khuynh độ pH, không có

sự hiện diện của SDS Mỗi protein

sẽ di chuyển cho đến khi nó đến vị trí mà tại đó pH bằng pI của nó

Dựa vào hiện tượng này, ta có

phương pháp phân tách protein dựa vào điểm đẳng điện của protein để tạo Khuynh độ pH, trước hết là cho vào gel một hỗn hợp

polyampholyte (những polymer

nhỏ đa điện tích) có nhiều giá trị pI, sau đó điện di hỗn hợp này Điện di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả năng phân

biệt được sự chênh lệch pI khoảng 0.01 hay những protein khác nhau

chỉ một đơn vị điện tích cũng có

thể được phân tách bằng phương pháp này

3 Điện di hai chiều

Đây là một phương pháp có khả

năng phân tách cao do sư kết hợp SDS-PAGE với điện di dựa vào

điểm đẳng điện Mẫu protein đầu tiên sẽ được chạy điện di dựa vào điểm đẳng điện sau đó, đặt khoảng gel có chứa protein vừa được điện

di lên tấm gel SDS-polyacrylamide theo phương nằm ngang Protein sẽ chịu một điện trường theo chiều

dọc Kết quả là một mô hình các

điểm được phân tách hai chiều,

chiều ngang theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng Khả

năng phân tách của phương pháp

này được chứng minh khi hơn một ngàn protein của vi khuẩn E coli

có thể được phân tách trong một

lần chạy điện di

Những protein được phân tách từ tế bào ở các điều kiện sinh lý khác

nhau có thể phân tách được bằng

phương pháp này, sau đó cường độ của tính hiệu sẽ được xác định Với cách này, những protein cụ thể sẽ được thấy ở dạng mạnh hay yếu tùy vào tình trạng sinh lý Tuy nhiên, phương pháp này có một hạn chế là

có rất nhiều protein được phân tách

nhưng lại phân biệt rõ Để khắc

phục hạn chế này, người ta kết hợp điện di hai chiều với kỹ thuật khối phổi

4 Đánh giá kết quả tinh sạch

protein

Sau mỗi bước tinh sạch, những

thông số sau cần được ghi nhận để

có thể đánh giá quá trình tinh sạch protein:

- Protein tổng số: lượng protein có trong một phân đoạn Thông số này tính bằng cách nhân nồng độ một phần của phân đoạn với tổng thể

tích của phân đoạn đó

- Hoạt tính tổng: hoạt tính của

enzyme trong phân đoạn đó Thông

số này được tính bằng cách nhân hoạt tính của enzyme có trong

lượng mẫu được xét nghiệm với

tổng thể tích của phân đoạn đó

- Hoạt tính riêng: bằng hoạt tính

tổng chia cho protein tổng số

- Yield: hoạt tính còn lại sau mỗi bước tinh sạch được thể hiện bằng phần trăm hoạt tính của dịch chiết thô với hoạt tính trong dịch chiết khởi đầu là 100%

- Mức tinh sạch: chỉ mức độ tinh

sạch, được tính bằng cách chia hoạt tính riêng, được tính sau mỗi bước tinh sạch, với hoạt tính riêng của

dịch chiết ban đầu

Qua theo nghiên cứu khảo nghiệm, người ta thấy rằng sau mỗi bước

tinh sạch, mức độ tinh sạch tăng lên trong khi yield lại giảm Thật vậy, với kỹ thuật SDS-PAGE, nếu ta

nạp một lượng mẫu nhất định vào mỗi giếng trên bản gel ứng với một bước tinh sạch, ta sẽ thấy số băng

sẽ giảm tỉ lệ với mức độ tinh sạch trong khi tỉ lệ lượng protein mục

tiêu với tổng số protein hiện diện sẽ tăng

Vì vậy, đánh giá quá trình tinh sạch phải dựa cả vào 2 thông số mức độ tinh sạch và yield Một quá trình

tinh sạch tốt sẽ có mức độ tinh sạch

cao và chỉ số yield thấp Nếu chỉ số yield cao còn mức độ tinh sạch thấp

có nghĩa là còn nhiều tạp nhiễm

trong mẫu (nhiều protein ngoài

protein mục tiêu) và làm phức tạp việc giải thích thí nghiệm