Tinh sạch Protein

Tinh sạch Protein

Tinh sạch protein

I Giới thiệu chung

Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng

ta có thể xác định được trình tự

acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức

năng sinh hóa của các protein đó Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa

protein chỉ có thể thực hiện với

những protein tinh sạch và từ

những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X

Vì vậy, quá trình tinh sạch protein không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất nhưng nhìn chung một quá trình tinh sạch protein cũng cần đi qua các bước

căn bản sau:

1 Nhận biết protein mục tiêu

2 Ly trích protein từ tế bào

3 Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên kết ái lực

4 Phân tách protein bằng điện di trên gel

5 Xác định trọng lượng và khối lượng của protein

II Nhận biết protein mục tiêu

Kết quả của sự tinh sạch là một

mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ở đây là một loại protein

mà nhà sinh hóa quan tâm Mẫu

protein này chỉ là một phân đoạn

chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một

cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật Để xác định được

protein mục tiêu từ hỗn hợp

protein, nhà sinh hóa cần thực hiện một thử nghiệm dựa vào đặc tính

của protein đó Nếu protein mục

tiêu là một enzyme thì thử nghiệm

sẽ được thực hiện dựa trên hoạt

tính của enzyme đó Cụ thể như với enzyme lactate dehydrogenase, một enzyme có vai trò trong việc sản

xuất năng lượng từ glucose cũng

như tổng hợp glucose từ lactate, để xác định enzyme này thì dựa trên phản ứng của nó trong tế bào

Sau đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 340nm của Nicotinamide adenine

dinucleotide (NADH), ta có thể đo được lượng ánh sáng được hấp thụ

ở bước sóng 340nm trong một đơn

vị thời gian để xác định hoạt tính của enzyme lactate dehydrogenase Trên thực tế việc tìm ra một thử

nghiệm hiệu quả thường rất khó,

nhưng nếu có được một cách thử

nghiệm càng đặc hiệu thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả Tuy nhiên,

để chắc chắn quá trình tinh sạch

hoạt động tốt, chúng ta còn cần một thông số là lượng protein có trong hỗn hợp được thử nghiệm Hiện

nay có rất nhiều phương pháp phát hiện nhanh và chính xác nồng độ protein Dựa vào 2 thông số thực

nghiệm là hoạt tính enzyme và

nồng độ protein, ta có thể xác định hoạt tính riêng của enzyme tức là tỉ

lệ hoạt tính enzyme với hàm lượng protein có trong mẫu thử nghiệm Hoạt tính riêng càng cao thì quá

trình tinh sạch càng hiệu quả hay

nói cách khác, mục tiêu của việc

tinh sạch là làm tăng tối đa hoạt

tính riêng

III Ly trích protein từ tế bào

Khi đã tìm ra thử nghiệm phù hợp

và chọn được nguồn protein, chúng

ta cần phân đoạn dịch tế bào thành nhiều phần và xác định xem phần nào chứa nhiều protein mục tiêu Quá trình tìm phân đoạn mục tiêu được phát triển bằng sự mày mò qua từng thí nghiệm Bước đầu tiên

là phá vỡ màng tế bào, tạo thành hỗn hợp đồng chất Sau đó phân đoạn hỗn hợp bằng ly tâm, dịch nổi chứa phân tử có trọng lượng thấp, những phân tử có trọng lượng cao

hơn lắng xuống đáy ống ly tâm Dịch nổi lại được ly tâm lần nữa với lực mạnh hơn để tạo cặn và dịch nổi mới Tiến trình này, được gọi là ly tâm phân đoạn, sẽ tạo được nhiều phân đoạn khác nhau với tỉ trọng giảm dần, mỗi phân đoạn này chứa hàng trăm phân tử protein khác nhau, sẽ được tinh sạch sau khi đã qua thử nghiệm hoạt tính Thông thường, một phân đoạn có hoạt tính cao sẽ là nguồn vật liệu cho các kỹ thuật tinh sạch hiệu quả