luan van che bien ruou vang pptx

66 Bảng 4.1: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong g

LỜI CẢM ƠN

Với khoảng thời gian hơn bốn năm ngồi trên ghế giảng đường, và đặc biệt là hơn bốn tháng làm luận văn tốt nghiệp vừa qua, em đã trưởng thành rất nhiều trong việc nghiên cứu cũng như trong rèn luyện nhân cách bản thân Để có được những điều này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tất cả các quý thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa, và đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm, những người đã giúp đỡ và dìu dắt em rất nhiều trên con đường trở thành một kỹ sư, một trí thức trẻ trong tương lai

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy Lê Văn Việt Mẫn và cô Tôn Nữ Minh Nguyệt đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho em trong thời gian làm luận văn vừa qua

Con xin cảm ơn bố mẹ đã hết lòng yêu thương, chăm sóc và cổ vũ tinh thần cho con, giúp con vượt qua được những giai đoạn khó khăn nhất trong công việc cũng như trong cuộc sống Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè tôi, những người đã cho tôi hiểu thế nào là một tình bạn chân thành và đẹp đẽ, những người đã luôn ở bên cạnh tôi động viên và giúp đỡ tôi

TpHCM, ngày 10 tháng 01 năm 2007

Sinh viên Nguyễn Thị Hiền Lương

MỤC LỤC

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

Chương 2: TỔNG QUAN 3

2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯỢU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 3

2.1.1 Rượu vang 3

2.1.2 Nho 4

2.1.3 Nấm men 8

2.2 CỐ ĐỊNH NẤM MEN 11

2.2.1 Sơ lược một số vấn đề về kỹ thuật cố định tế bào 11

2.2.2 Các chất mang cố định nấm men trong sản xuất rượu vang 13

2.2.3 Cố định nấm men trong gel alginate 18

2.2.4 Một số tính chất của nấm men cố định 24

2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG 30

2.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường 30

2.3.2 Ảnh hưởng của pH 34

2.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng SO2 36

2.3.4 Ảnh hưởng của tannin 38

2.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 39

2.4 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 42 2.4.1 Dùng kỹ thuật cố định để khắc phục một số vấn đề trong sản xuất rượu vang42 2.4.2 Dùng kỹ thuật cố định trong một số phương pháp lên men 45

2.4.3 Dùng kỹ thuật cố định trong sản xuất một số loại rượu vang 48

Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51

3.1 NGUYÊN LIỆU 51

3.1.1 Nho 51

3.1.2 Nấm men 52

3.1.3 Alginate 52

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52

3.2.1 Mục đích và nội dung nghiên cứu 52

3.2.2 Phương pháp cố định nấm men trong gel alginate 54

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá trình lên men rượu vang nho sử dụng nấm men cố định trong gel alginate 55

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến động học quá trình lên men rượu vang nho, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate 56

3.2.5 Xử lý kết quả 56

3.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 58

3.3.1 pH 58

3.3.2 Nồng độ chất khô 58

3.3.3 Hàm lượng đường khử 58

3.3.5 Hàm lượng nitơ ammonium 61

3.3.6 Hàm lượng tannin 62

3.3.7 Hàm lượng sulfur dioxide 62

3.3.8 Hàm lượng ethanol 63

3.3.9 Hàm lượng acid tổng 65

3.3.10 Hàm lượng acid dễ bay hơi 65

3.3.11 Mật độ tế bào 65

Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 66

4.1 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE 66

4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sinh trưởng của nấm men 66

4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sử dụng cơ chất trong quá trình lên men 70

4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình tạo sản phẩm 80

4.1.4 Kết luận chung 89

4.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG TANNIN ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE 90

4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình sinh trưởng của nấm men 90

4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình sử dụng cơ chất trong quá trình lên men 94

4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình tạo sản phẩm 102

4.2.4 Kết luận chung 109

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110

5.1 KẾT LUẬN 110

5.2 KIẾN NGHỊ 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO 111

Danh mục các bảng

Chương 2: TỔNG QUAN 3

Bảng 2.1: Thành phần của dịch nho và rượu vang thông thường 3 Bảng 2.2: Thành phần các một số acid hữu cơ chính trong dịch nho đỏ và rượu vang đỏ 6 Bảng 2.3: Các đặc tính mong muốn của nấm men vang 10 Bảng 2.4: So sánh các kỹ thuật cố định tế bào 12 Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang 14 Bảng 2.6: Tốc độ sử dụng cơ chất và hình thành sản phẩm của nấm men cố định trong gel

alginate và nấm men tự do 26

Bảng 2.7: Các hợp chất hương chính của rượu vang tạo bởi nấm men cố định và nấm men

tự do trong khoảng nhiệt độ 15 – 20oC 29

Bảng 2.8: Thành phần của rượu vang trắng lên men bằng 4 loại nấm men cố định trong

gel alginate và nấm men tự do 30

Bảng 2.9: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá trình lên men trong

quá trình lên men tĩnh rượu vang ở 30oC bởi tế bào cố định sấy thăng hoa (freeze-dried gluten supported biocatalyst – FGB), tế bào tự do sấy thăng hoa (freef reeze-dried cells – ffdc) và tế bào cố định chưa qua sấy (wet gluten supported biocatalyst – WGB) 33

Bảng 2.10: Các nguyên nhân cơ bản gây ra hiện tượng kéo dài thời gian lên men hoặc quá

trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn rất cao 44

Bảng 2.11: Năng suất sinh cồn trong quá trình lên men dịch nho bởi nấm men cố định trên

kissiris, -alumina và alginate tại 7, 13 và 27oC 47

Bảng 2.12: Các hợp chất dễ bay hơi tạo thành trong suốt quá trình lên men liên tục rượu

vang sử dụng nấm men cố định trên miếng táo và quá trình lên men tĩnh sử dụng nấm men tự do Quá trình lên men được thực hiện ở 30oC 48

Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51

Bảng 3.1: Thành phần của dịch nho sau khi ép 52 Bảng 3.2: Các chất bổ sung vào dịch nho khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường

ban đầu đến quá trình lên men 56

Bảng 3.3: Các chất bổ sung vào dịch nho khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin

ban đầu đến quá trình lên men 56

Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 66

Bảng 4.1: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đại

của nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 69

Bảng 4.2: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng đường sót trong quá

trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 72

Bảng 4.3: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường cực đại

của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 74

Bảng 4.4: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường riêng cực

đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 74

Bảng 4.5: Độ lên men ứng với hàm lượng đường ban đầu khác nhau 75 Bảng 4.6: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến thời gian lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 75

Bảng 4.7: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình

trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 76

Bảng 4.8: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng cồn đạt được trong

quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 81

Bảng 4.9: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại

trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 82

Bảng 4.10: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng

cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 83

Bảng 4.11: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung

bình của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 84

Bảng 4.12: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn

trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 86

Bảng 4.13: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đại

trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 93

Bảng 4.14: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hàm lượng đường sót trong quá

trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 96

Bảng 4.15: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường cực đại

trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 96

Bảng 4.16: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường riêng cực

đại (chỉ xét cho giá trị cực đại đầu tiên) trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 97

Bảng 4.17: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến thời gian lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 99

Bảng 4.18: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình

trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 99

Bảng 4.19: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cực

đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 103

Bảng 4.20: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng

cực đạitrong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 104

Bảng 4.21: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung

bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 105

Bảng 4.22: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn

trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 106

Danh mục các hình vẽ

Chương 2: TỔNG QUAN 3

Hình 2.1: Nho xanh và nho đỏ 4

Hình 2.2: Cơ chế của quá trình biến đổi các hợp chất nitơ bởi nấm men 6

Hình 2.3: Các acid không bay hơi trong rượu vang 6

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của acid tannic 8

Hình 2.5: Các kỹ thuật cơ bản để cố định tế bào 11

Hình 2.6: Cấu trúc của alginate 18

Hình 2.7: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài 19

Hình 2.8: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong 20

Hình 2.9: Con đường hình thành các chất tạo hương vị cho rượu vang 28

Hình 2.10: Hàm lượng ethanol (P) thay đổi theo thời gian ứng với các nồng độ cơ chất khác nhau 31

Hình 2.11: Tốc độ sử dụng glucose cực đại và tốc độ tạo thành ethanol cực đại khi hàm lượng đường thay đổi 31

Hình 2.12: Sự thay đổi hàm lượng đường theo thời gian 32

Hình 2.13: Sự sử dụng glucose trong suốt quá trình lên men 33

Hình 2.14: Khả năng tạo cồn của nấm men trong suốt quá trình lên men 33

Hình 2.15: Aûnh hưởng của pH đến tốc độ lên men của nấm men cố định và nấm men tự do 35

Hình 2.16: Aûnh hưởng của pH đến khả năng sống sót của nấm men cố định 35

Hình 2.17: Aûnh hưởng của pH đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lên men 36

Hình 2.18: Aûnh hưởng của hàm lượng SO2 đến quá trình lên men rượu vang trắng 37

Hình 2.19: Aûnh hưởng của SO2 đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lên men 38

Hình 2.20: Aûnh hưởng của tannin đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lên men 39

Hình 2.21: Aûnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lên men 40

Hình 2.22: Aûnh hưởng của nhiệt độ đến động học quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men cố định trên DCM và nấm men tự do 41

Hình 2.23: Sự chuyển hóa acid malic bởi nấm men tự do và nấm men

Schizosaccharomyces pombe cố định khi sử dụng các hàm lượng đường ban đầu khác nhau.

43

Hình 2.24: Động học của quá trình lên men rượu vang ở những nhiệt độ khác nhau sử dụng nấm men cố định trên gluten 46

Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51

Hình 3.1: Quy trình ép nho 51

Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu 53

Hình 3.3: Quy trình cố định nấm men trong gel alginate bằng phương pháp tạo gel từ bên ngoài 54

Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 66

Hình 4.1: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 67

Hình 4.2: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 68

Hình 4.3: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 70

Hình 4.4: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 71

Hình 4.5: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 72

Hình 4.6: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường riêng trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 73

Hình 4.7: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 76

Hình 4.8: Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin tự do trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 78

Hình 4.9: Sự thay đổi hàm lượng nitơ ammonium trong quá trình lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 79

Hình 4.10: Sự thay đổi hàm lượng cồn trong trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng

nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 80

Hình 4.11: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn trong trong quá trình lên men rượu vang,

sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 82

Hình 4.12: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng trong trong quá trình lên men rượu

vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 83

Hình 4.13: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung

bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 84

Hình 4.14: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn

trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 85

Hình 4.15: Sự thay đổi pH trong trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự

do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 86

Hình 4.16: Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong trong quá trình lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 87

Hình 4.17: Sự thay đổi hàm lượng acid dễ bay hơi trong quá trình lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 88

Hình 4.18: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 91

Hình 4.19: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu

vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 9,8g/L) 92

Hình 4.20: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu

vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate khi hàm lượng tannin ban đầu là 17,8g/L 93

Hình 4.21: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm

men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 94

Hình 4.22: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm

men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 95

Hình 4.23: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong quá trình lên men rượu vang sử dụng

nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 96

Hình 4.24: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường riêng trong quá trình lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 97

Hình 4.25: Ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình

trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 99

Hình 4.26: Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin tự do trong quá trình lên men rượu vang, sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 100

Hình 4.27: Sự thay đổi hàm lượng nitơ ammonium trong quá trình lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 101

Hình 4.28: Sự thay đổi hàm lượng cồn trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm

men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 102

Hình 4.29: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn trong quá trình lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate khi hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L 103

Hình 4.30: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng trong quá trình lên men rượu vang

sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 104

Hình 4.31: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung

bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 105

Hình 4.32: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn

trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 106

Hình 4.33: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và

nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8

– 17,8g/L) 107

Hình 4.34: Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men rượu vang sử dụng

nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 108

Hình 4.35: Sự thay đổi hàm lượng acid dễ bay hơi trong quá trình lên men rượu vang, sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 109

Danh mục một số thuật ngữ và chữ viết tắt

 ADH : enzyme alcohol dehydrogenase

 CD : Nấm men cố định

 DCM : Delignified Cellulosic Material

 DEAE-cellulose : diethylaminoethyl-cellulose

 EEFA : ethyl ester fatty acid

 FGB : freeze-dried gluten supported biocatalyst, là tế bào cố định sấy

thăng hoa

 Ffdc : free freeze-dried cells, là tế bào tự do sấy thăng hoa

 NS : non-Saccharomyces, là những loài nấm men không thuộc giống

Saccharomyces

 TD : Nấm men tự do

 WGB : wet gluten supported biocatalyst, là tế bào cố định chưa qua sấy

  : Tốc độ sinh trưởng riêng tức thời của tế bào, là tốc độ sinh trưởng

tính trên một đơn vị tế bào tại một thời điểm nhất định Đơn vị: h-1

 max : Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của tế bào, là tốc độ sinh trưởng

riêng lớn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị: h-1

 gS : Tốc độ sử dụng đường tức thời của nấm men, là hàm lượng đường

mà nấm men sử dụng trong một đơn vị thời gian Đơn vị: g/L/h

 gSmax : Tốc độ sử dụng đường cực đại của nấm men, là tốc độ sử dụng

đường lớn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị: g/L/h

 S : Tốc độ sử dụng đường riêng tức thời của nấm men, là tốc độ sử

dụng đường tính trên một đơn vị tế bào tại một thời điểm nhất định Đơn vị: g/h/1012 tế bào

 Smax : Tốc độ sử dụng đường riêng cực đại của nấm men, là tốc độ sử dụng

đường riêng lớn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị: g/h/1012 tế bào

  : Tổng thời gian lên men, được xác định từ độ lên men Đơn vị: h

 KS : Tốc độ sử dụng đường trung bình, là hàm lượng đường trung bình

được nấm men sử dụng trong một đơn vị thời gian lên men Đơn vị: g/L/h

 gP : Tốc độ sinh tổng hợp cồn tức thời của nấm men, là hàm lượng cồn

mà nấm men sinh tổng hợp được trong một đơn vị thời gian Đơn vị:

 gpmax : Tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại của nấm men, là tốc độ sinh tổng

hợp cồn lớn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị: g/L/h

 P : Tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng tức thời của nấm men, là tốc độ sinh

tổng hợp cồn tính trên một đơn vị tế bào tại một thời điểm nhất định Đơn vị: g/h/1012 tế bào

 Pmax : Tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng cực đại của nấm men, là tốc độ sinh

tổng hợp cồn riêng lớn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị: g/h/1012 tế bào

 KP : Tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình, là hàm lượng cồn trung bình

được nấm men sinh tổng hợp trong một đơn vị thời gian lên men Đơn vị: g/L/h

  : Hiệu suất sinh tổng hợp cồn, là số mol ethanol được tạo thành từ

một mol glucose được nấm men sử dụng Đơn vị: mol ethanol/ mol glucose

Chương 1: GIỚI THIỆU

Như chúng ta đã biết, rượu vang là một trong những sản phẩm lên men có lịch sử lâu đời nhất Theo các tài liệu cổ, rượu vang có xuất xứ từ các nước Ả Rập vào khoảng thế kỷ

18 hay 19 trước Công nguyên và cho đến nay, rượu vang đã trở nên phổ biến khắp nơi trên thế giới Rượu vang được ưa thích trước hết là do hương vị hết sức đặc trưng mà không loại sản phẩm nào có thể thay thế, sau đó là do nó đem lại cảm giác sảng khoái và sức khỏe cho người uống

Đầu tiên, rượu vang được tạo ra bằng quá trình lên men tự phát Sau đó, người ta đã

tiến hành phân lập các chủng nấm men và cấy vào dịch lên men loài Saccharomyces

cerevisiae thuần thiết để thúc đẩy quá trình lên men và tăng chất lượng của rượu vang

Tuy nhiên, việc sử dụng nấm men tự do để lên men có khá nhiều nhược điểm:

 Thời gian lên men dài, năng suất lên men thấp

 Tiêu tốn nhiều năng lượng để tách nấm men ra khỏi rượu vang sau quá trình lên men

 Khả năng tái sử dụng nấm men rất thấp

 Khó tự động hóa quá trình lên men

Để khắc phục các nhược điểm này, nhiều nghiên cứu về việc sử dụng nấm men cố định trong sản xuất rượu vang đã được thực hiện Các nghiên cứu này đều cho thấy nấm men cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với nấm men tự do:

 Tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men

 Ổn định hoạt tính của nấm men Các chất mang cố định có tác dụng như là một tác nhân bảo vệ tế bào chống lại những ảnh hưởng bất lợi của pH, nhiệt độ, dung môi và ngay cả các kim loại nặng

 Dễ dàng tách nấm men ra khỏi sản phẩm sau quá trình lên men, do đó làm giảm chi phí về thiết bị và năng lượng

 Có thể tái sử dụng nấm men nhiều lần

 Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tối ưu hóa và tự động hóa quá trình lên men Các nghiên cứu trước đây về ứng dụng nấm men cố định trong sản xuất rượu vang chủ yếu khảo sát quá trình sử dụng đường, quá trình sinh tổng hợp cồn và sự hình thành các hợp chất hương mà ít đề cập đến động học quá trình sinh trưởng của nấm men, quá trình sử dụng các hợp chất nitơ cũng như sự chuyển hóa của các acid hữu cơ trong suốt quá trình lên men chính Chúng tôi cũng tìm thấy rất ít các nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố công nghệ trong quá trình sản xuất đến động học quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men cố định như ảnh hưởng của hàm lượng tannin, hàm lượng SO2 trong dịch

mà chưa khảo sát một cách toàn diện ảnh hưởng của các yếu tố này đến tất cả các mặt trong quá trình lên men chính

Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến động học quá trình lên men rượu vang nho sử dụng nấm men cố định” Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của 4 yếu tố công nghệ, bao gồm: pH, hàm lượng đường, hàm lượng SO2 và hàm lượng tannin ban đầu Tuy nhiên, trong phạm vi bài luận văn này, tôi chỉ xin trình bày sư ảnh hưởng của 2 yếu tố là hàm lượng đường và hàm lượng tannin ban đầu Kết quả về sự ảnh hưởng của pH và hàm lượng SO2 trong dịch nho đến quá trình lên men sẽ do một bạn khác trình bày

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chất mang là alginate - một polysaccharide thu được từ rong mơ phân bố dọc theo bờ biển miền Trung của Việt Nam Chúng tôi lần lượt khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường và hàm lượng tannin ban đầu đến các vấn đề sau:

 Động học quá trình sinh trưởng của nấm men

 Động học quá trình sử dụng cơ chất: đường khử, nitơ amin và nitơ vô vơ

 Động học quá trình hình thành sản phẩm: do thời gian hạn hẹp và chưa có điều kiện về kinh phí nên trong phạm vi bài luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày sản phẩm quan trọng nhất của quá trình lên men là cồn mà chưa trình bày các hợp chất hương Và chúng tôi cũng khảo sát thêm sự chuyển hóa của các acid hữu cơ trong suốt quá trình lên men chính

Chương 2: TỔNG QUAN

2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯỢU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG

2.1.1 Rượu vang

Rượu vang nho là sản phẩm thu được bằng con đường lên men cồn từ dịch nho Rượu vang nho có thể được sản xuất từ một giống nho riêng biệt, hoặc từ hỗn hợp hai hay ba giống nho khác nhau Vì vậy sản phẩm vang nho có số lượng và chủng loại rất phong phú,

đa dạng Về mặt công nghệ, sản phẩm vang nho được chia ra thành hai nhóm lớn [1]:

 Nhóm rượu vang không có gas

 Nhóm rượu vang có gas

Do quá trình lên men, thành phần của rượu vang khác với thành phần của dịch nho ban đầu (bảng 2.1) [199]

Bảng 2.1: Thành phần của dịch nho và rượu vang thông thường [199]

Hợp chất % trong dịch nho % trong rượu vang

(ethanol và hàm lượng vết của terpenes, glycerols và

rượu bậc cao)

Acid hữu cơ

(tartaric, malic và một ít lactic, succinic, oxalic,…)

(các flavonoid như là các chất màu cùng với các

nonflavonoid như là cinnamic acid và vanillin)

Các hợp chất chứa nitơ

(protein, amino acid, humin, amide, ammonia,…)

Các hợp chất hương

(các ester như là ethyl caproate, ethyl butyrate,…)

2.1.2 Nho

2.1.2.1 Phân loại

Phân loại khoa học của nho [217]:

 Giới (regnum) : Plantae

 Ngành (divisio) : Magnoliophyta

 Lớp (class) : Magnoliopsida

 Bộ (ordo) : Vitales

 Họ (familia) : Vitaceae

 Chi (genus) : Vitis

Trong đó, loài Vitis vinifera là thích hợp nhất để sản xuất rượu vang vì loài này

chứa [216]:

 Hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, cần thiết cho sự phát triển của nấm men vang

 Hàm lượng acid khá cao, đủ để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn trong và sau quá trình lên men

 Hàm lượng đường đủ để tạo ra hàm lượng cồn cao, nhờ đó ức chế được các vi sinh vật gây hư hỏng trong rượu vang

 Các hợp chất hương với thành phần và lượng thích hợp, vì thế rượu vang tạo thành có tính chất cảm quan tốt

Dựa vào nguồn gốc giống nho, có thể chia thành 2 nhóm cơ bản là [1] :

 Nho trắng: trái nho khi chín vỏ không có màu hoặc màu vàng lục nhạt

 Nho đỏ: trái nho khi chín vỏ có màu đỏ – tím ở những mức độ khác nhau (Hình 2.1)

Hình 2.1: Nho xanh (a) và nho đỏ (b, c)

2.1.2.2 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của nho thay đổi theo giống, độ chín, thời vụ thu hoạch, điều kiện đất đai, khí hậu, kỹ thuật canh tác … Thành phần cơ bản của nho được nêu ra như trong bảng 2.1

Một số các hợp chất quan trọng trong nho và rượu vang:

Đường

Thông thường dịch nho để sản xuất rượu vang chứa 16 – 26% (w/v) đường Trong nho khô và trong nho thu hoạch trễ, hàm lượng đường có thể lên tới trên 30% (w/v) Dịch nho cô đặc với hàm lượng đường 35oBx được sử dụng để sản xuất rượu vang có hàm lượng cồn cao (Buescher và cộng sự, 2001) Khi đó độ lên men đạt khoảng 86 – 87% Hàm lượng đường cao có thể ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men [129]

Dịch nho trước khi lên men thường chứa tỷ lệ cân bằng của glucose và fructose Trong

suốt quá trình lên men, tất cả các chủng Saccharomyces cerevisiae đều ưu tiên sử dụng

glucose hơn là fructose Hàm lượng ethanol cao có tác động ức chế mạnh sự sử dụng fructose hơn là glucose Trong khi đó, bổ sung nitơ vào dịch nho sẽ kích thích sự sử dụng fructose hơn là glucose [26, 49]

Nitơ

Các hợp chất nitơ rất cần cho sự phát triển và trao đổi chất của nấm men Trong số các chất dinh dưỡng mà nấm men có thể sử dụng được trong suốt quá trình lên men dịch nho, về số lượng, nitơ là thành phần quan trọng thứ hai sau các hợp chất carbon Có nhiều hợp chất chứa nitơ có mặt trong dịch nho, với hàm lượng thay đổi từ 60 – 2400mg/L [85]

Saccharomyces cerevisiae có khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau để phát

triển, nhưng không phải tất cả các nguồn nitơ đều hỗ trợ phát triển tốt như nhau Các nguồn nitơ tốt là ammonium, glutamine và asparagine, trong khi đó proline và urea được xem như là những nguồn nitơ kém chất lượng [24, 85]

Tất cả các hợp chất chứa nitơ tích lũy trong dịch nho bị biến đổi thành một trong hai sản phẩm cuối là ammonium hoặc glutamate (Hình 2.2) Glutamate cùng với glutamine đóng một vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi nitơ của nấm men Từ 2 amino acid này tất cả các hợp chất chứa nitơ trong tế bào được tạo ra [85]

Acid hữu cơ

Trong nho và rượu vang, 6 acid chiếm thành phần chính là acid tartaric, acid malic, acid citric, acid lactic, acid succinic và acid acetic (Hình 2.3, bảng 2.2) Trong đó, acid acetic là hợp chất dễ bay hơi còn các acid khác là acid không bay hơi

Độ phân ly của các acid này giảm theo thứ tự sau: acid citric, acid tartaric, acid malic, acid succinic, acid lactic, và acid acetic

Hình 2.2: Cơ chế của quá trình biến đổi các hợp chất nitơ bởi nấm men [85]

Hình 2.3: Các acid không bay hơi trong rượu vang: a) acid citric, b) acid tartaric, c) acid malic, d)

acid succinic, e) acid lactic

Bảng 2.2: Thành phần các một số acid hữu cơ chính trong dịch nho đỏ và rượu vang đỏ [167]

Acid hữu cơ Dịch nho đỏ Rượu vang đỏ Acid citric

Acid tartaric Acid malic Acid succinic Acid lactic Acid acetic

0,25 – 0,35g/L 4,07 – 7,65g/L 1,99 – 2,91g/L Rất ít

Rất ít Rất ít

0,17 – 0,40g/L 2,60 – 5,7g/L 0,06 – 3,13g/L 0,48 – 1,22g/L 0,07 – 4,89g/L 0,30 – 1,44g/L

SO 2

Sulfur dioxide được sử dụng rộng rãi trong rượu vang như là một chất chống oxy hóa, tác nhân kháng khuẩn và đồng thời cũng là tác nhân cho việc chọn lọc các loài hoặc chủng có thể phát triển và đóng góp vào quá trình lên men Trong rượu vang, SO2 tồn tại

ở 2 dạng: tự do và liên kết Nhưng chỉ SO2 tự do mới có tính khử và diệt khuẩn Mặc dù vậy, một vài dạng SO2 liên kết có thể chuyển hóa thành SO2 tự do và có thể bù lại cho lượng SO2 bị giảm trong quá trình lên men Vì thế, SO2 là một thông số quan trọng ảnh hưởng đến động học quá trình lên men và chất lượng rượu vang [22, 30, 48, 58, 63, 79, 90, 143]

Bên cạnh đó, SO2 còn có ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men rượu vang: dẫn tới kéo dài thời gian lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn cao, và ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của rượu vang [48, 81]

Tannin

Trong các thập kỷ qua, thành phần polyphenolic được quan tâm do nó ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của rượu vang (màu sắc và mùi vị) và các giá trị dinh dưỡng khác (theo quan điểm về y học, tannin được xem là chất chống oxi hóa, chống khối u và bệnh mạch vành) [64, 31, 51, 165, 80, 174, 29, 99, 157]

Tannin xuất phát từ chữ “tanning” có nghĩa là thuộc da vì tannin có khả năng phản ứng và kết tủa với các protein có trong da động vật [87] Tannin có ở 2 dạng là tannin ngưng tụ và tannin thủy phân [216]:

 Tannin thủy phân: có nguồn gốc từ các acid phenolic như là acid gallic và acid ellagic

 Tannin ngưng tụ: là polymer của flavan-3-ol (epicatechin, catechin và gallocatechin) và flavan-3,4-diol

Tannin có ở trong nho và rượu vang chủ yếu là các tannin ngưng tụ [216]

Tannin có thể được thêm vào rượu vang dưới dạng acid tannic (Hình 2.4) để phản ứng và kết tủa với protein và để cải thiện độ trong của rượu vang Trong suốt quá trình ủ, sự thay đổi hàm lượng tannin ngưng tụ sẽ ảnh hưởng đến màu sắc và tính chất cảm quan của rượu vang, và khi đó, khối lượng phân tử của tannin có thể tăng lên [216]

2.1.2.3 Tình hình trồng nho trên thế giới và ở Việt Nam

Theo số liệu của FAO, 75.866km² đất trên thế giới được dùng để trồng nho Khoảng 71% sản lượng nho được dùng sản xuất rượu vang, 27% được dùng để ăn dưới dạng quả tươi và 2% được sử dụng làm nho khô [217]

Khác với các loại trái cây khác của Việt Nam, nho là loại trái cây được du nhập từ các nước trên thế giới vào Việt Nam từ những năm 1960 Nho trồng tập trung chủ yếu ở Ninh Thuận và Bắc Bình Thuận với diện tích khoảng 2.500 – 7.000 ha Đặc biệt tại vùng Ninh Thuận, cây nho rất có tiềm năng, năng suất khá cao, trên một hecta có thể thu được 30 -

tới bây giờ, đây vẫn là giống nho chủ lực do sản lượng tương đối cao Giống này tồn tại trên 30 năm Trước năm 2000, giống này chiếm 100% diện tích trồng nho tại Việt Nam, nhưng hiện nay chỉ chiếm khoảng 80% Giống nho xanh NH01 – 48 được nhập từ Thái Lan từ năm 1997 chiếm gần 20% diện tích trồng nho hiện nay Ngoài ra, chúng ta cũng có một số giống mới nhập khác nhưng chỉ chiếm một diện tích trồng rất nhỏ [215]

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của acid tannic

2.1.3 Nấm men

Nấm men là vi sinh vật quan trọng, kiểm soát quá trình lên men cồn trong sản xuất rượu vang Nấm men trong quá trình lên men rượu vang có thể có từ 3 nguồn gốc khác nhau: bề mặt trái nho, bề mặt thiết bị và từ canh trường được cấy vào Thành phần và chất lượng của rượu vang có liên quan chặt chẽ đến nấm men Trong quá trình lên men, bên cạnh các sản phẩm chính là ethanol và CO2, nấm men tạo thành nhiều sản phẩm phụ, ví dụ như glycerol, acid acetic, acid succinic và đặc biệt là các hợp chất hương, góp phần đáng kể vào chất lượng của rượu vang [9, 89, 92, 151, 163]

2.1.3.1 Phân loại

Nấm men có thể được phân thành 2 nhóm:

 Thứ nhất gọi là non-Saccharomyces (NS – là những loài nấm men không thuộc giống Saccharomyces), thường xuất hiện trên bề mặt của trái nho cùng với nhiều

loại vi sinh vật khác Hầu hết các loài NS không có khả năng tồn tại khi nồng độ

cồn cao hơn 6%v/v (ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis có thể phát triển trong

môi trường có nồng độ cồn lên đến 12%) Trước đây, nấm men NS được xem là các

vi sinh vật gây hư hỏng Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, một số loài nấm men NS có lợi cho chất lượng rượu vang, giúp tăng cường hương vị của

 Nhóm khác góp phần vào hương vị rượu vang, cũng là nhân tố chính của quá trình

lên men cồn là các loài thuộc giống Saccharomyces Saccharomyces có khả năng

chịu đựng sự thay đổi của điều kiện môi trường với nồng độ ethanol và acid hữu cơ tăng và sự cạn kiệt chất dinh dưỡng (Pretorius, 2000) Như vậy, mặc dù có nhiều

giống và loài nấm men trong dịch nho, nhưng giống Saccharomyces, mà chủ yếu là loài Saccharomyces cerevisiae mới là loài đảm nhiệm việc thực hiện các quá trình chuyển hóa sinh học quan trọng trong lên men vang Chính vì thế, Saccharomyces

cerevisiae còn được gọi là “nấm men vang” [58, 85, 92, 149, 166, 199]

2.1.3.2 Trình tự lên men của các giống nấm men trong quá trình lên men vang

Quá trình lên men rượu vang có thể được tiến hành một cách tự nhiên mà không cần cấy giống hoặc bằng cách cấy vào dịch nho các nấm men vang chọn lọc Việc lên men dịch nho được thực hiện bởi một hệ vi sinh vật phức tạp, trong đó các chủng nấm men phát triển và chết tùy theo sự thích nghi của chúng đối với môi trường Tương tác nấm men-nấm men xảy ra trong suốt quá trình sản xuất rượu vang ngay từ khi bắt đầu quá trình lên men cồn Trong quá trình lên men tự nhiên, các nấm men có mặt trong nho nguyên liệu

như là Kloeckera apiculata, Hansenula, Hanseniaspora uvarum, Pichia và Candida spp

khởi đầu quá trình lên men cồn từ dịch nho Các nấm men này chết dần khi hàm lượng

cồn tăng, chỉ còn lại Saccharomyces cerevisiae có khả năng chịu được hàm lượng cồn cao

tiếp tục quá trình lên men cho đến khi kết thúc Sự chuyển biến này rất quan trọng vì các

chủng non-Saccharomyces thường tạo ra các hợp chất không mong muốn như rượu bậc

cao, acid acetic và acetaldehyde Sự biến mất hoặc giảm mật độ của giống

non-Saccharomyces có thể là do khả năng chịu đựng cồn thấp, hoặc bị ức chế bởi các chất diệt

men (acid béo mạch ngắn và trung bình, glycoprotein,…) hoặc do hàm lượng oxy và

cách cấy canh trường Saccharomyces cerevisiae thuần khiết, nhờ đó quá trình lên men

diễn ra nhanh hơn và có thể tạo ra rượu vang với hương vị đặc trưng [25, 42, 44, 46, 48,

61, 84, 85, 89, 90, 92, 122, 139, 149, 151, 161, 163, 166]

Tuy nhiên, theo nhiều tác giả thì khi có các loài nấm men non-Saccharomyces phát

triển trong rượu vang với một mức độ vừa phải, hương vị của rượu vang sẽ phong phú hơn

và được ưa thích nhiều hơn so với rượu vang chỉ được lên men từ giống Saccharomyces

[90]

2.1.3.3 Chỉ tiêu chọn lựa nấm men vang

Ngoài vai trò quan trọng của nấm men vang là xúc tác việc chuyển hóa hoàn toàn và có hiệu quả đường thành cồn mà không tạo ra các hương vị không mong muốn thì ngày

nay, do yêu cầu ngày càng cao, canh trường Saccharomyces cerevisiae cần phải có nhiều

chỉ tiêu này thì tốn rất nhiều thời gian Regodon và cộng sự (1997) đã đưa ra một phương pháp đơn giản và hiệu quả để chọn lựa nấm men vang dùng trong sản xuất công nghiệp dựa trên các tính chất công nghệ của nấm men vang Phương pháp này chỉ bao gồm 2 bước [164]:

 Bước thứ nhất là bước chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chịu đựng đối với SO2, các loài có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp

 Bước thứ hai là bước chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơi và ethanol tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang

Bảng 2.3: Các đặc tính mong muốn của nấm men vang [85]

Đặc tính lên men

Thích nghi với quá trình lên men nhanh

Tốc độ sử dụng cơ chất và tốc độ hình thành

sản phẩm cao

Khả năng chịu cồn cao

Khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao

Sinh khối tạo thành vừa phải

Các tính chất về hương vị

Tạo thành ít sulphite/DMS/thiol

Tạo thành ít acid dễ bay hơi

Tạo thành ít rượu bậc cao

Giải phóng ra các tiền chất hương glycosylate

Hoạt tính esterase thấp

Đặc tính công nghệ

Tính ổn định cao về mặt di truyền Khả năng chịu sulphite cao

Ít liên kết với sulphite

Ít tạo bọt Có khả năng kết bông Kết lắng cặn nhanh Nhu cầu nitơ thấp

Các đặc tính trao đổi chất có liên quan đến sức khỏe con người

Tạo thành ít sulphite Tạo thành ít biogenic amine Tạo thành ít ethyl carbamate (urea)

2.1.3.4 Kết hợp các giống nấm men và sử dụng kỹ thuật di truyền trong sản xuất rượu vang

Theo nghiên cứu của Renouf và cộng sự (2006), việc sử dụng kết hợp Saccharomyces cerevisiae và Brettanomyces bruxellensis sẽ rút ngắn thời gian lên men do Brettanomyces bruxellensis có khả năng chuyển hóa glucose và fructose thành ethanol và chịu được hàm

lượng cồn cao Còn kết hợp giữa Saccharomyces cerevisiae và Candida stellata sẽ làm

tăng hàm lượng glycerol, tăng tốc độ lên men và chất lượng rượu vang [41, 42, 44, 166, 194]

Trong những năm gần đây, kỹ thuật di truyền đã được ứng dụng để cải thiện các đặc tính của nấm men vang:

 Shinohara và cộng sự (1994) đã nghiên cứu việc chọn lọc và lai giống các chủng nấm men vang để cải thiện tốc độ lên men, tăng khả năng chịu đựng đối với SO2 và làm tăng chất lượng rượu vang [178]

 Serra và cộng sự (2005) đã nghiên cứu việc lai tạo giữa Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces bayanus var uvarum để kết hợp ưu điểm của 2 loài này, làm tăng

chất lượng sản phẩm trong sản xuất rượu vang có hàm lượng acid thấp (pH cao) [175]

2.2 CỐ ĐỊNH NẤM MEN

2.2.1 Sơ lược một số vấn đề về kỹ thuật cố định tế bào

2.2.1.1 Khái niệm

Kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “Kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn lên một “vùng không gian nhất định” nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn” (Karel và cộng sự, 1985) [113]

Cố định thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các tế bào có thể phát triển trên bề mặt hoặc bên trong các cấu trúc của nguyên liệu có trong tự nhiên [113]

2.2.1.2 Các kỹ thuật cố định tế bào

Các kỹ thuật cố định tế bào có thể được chia làm 4 nhóm chính như trong bảng 2.4 và Hình 2.5

Bảng 2.4: So sánh các kỹ thuật cố định tế bào (còn nữa)

Cố định trên bề

mặt chất mang rắn

Nhốt trong khung mạng xốp

Keo tụ tế bào (tạo hạt)

Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn Nguyên

tắc

Dựa vào lực hấp

phụ vật lý, liên kết

tĩnh điện hoặc liên

kết cộng hóa trị

[113, 185]

Đưa tế bào vào bên trong một mạng cứng để ngăn cản tế bào khuếch tán vào môi trường xung quanh, trong khi vẫn cho phép sự vận chuyển các chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất diễn ra [113]

Làm gia tăng kích thước của khối tế bào để dễ dàng sử dụng trong các bình phản ứng Có thể là keo tụ tự nhiên hoặc là keo tụ nhân tạo bằng cách tạo thành các liên kết ngang [113]

Phương pháp này có thể được thực hiện theo 2 cách [113]:

 Sử dụng màng membrane vi xốp

xúc giữa tế bào cố

định và chất mang

lớn hơn so với các

kỹ thuật khác [138]

 Có thể đạt được mật độ tế bào trong một đơn vị thể tích chất mang cao hơn so với canh trường vi sinh vật tự do [138]

 Chất mang có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại thực khuẩn hoặc tế bào ngoại lại cũng như những điều kiện gây stress [138]

 Đơn giản, dễ thực hiện

 Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối

Canh trường lên men không bị lẫn tế bào, do đó sản phẩm tạo thành có thể không cần lọc [113, 138]

Nhược

điểm

Do không có màng

chắn giữa các tế

bào và dung dịch

cho nên các tế bào

dễ bị tách ra, làm

tăng hàm lượng tế

bào tự do trong

dung dịch [113, 40]

 Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối sẽ làm giảm độ bền của mạng gel [39]

 Tế bào trên bề mặt dễ thoát ra khỏi mạng gel và phát triển trong môi trường như là các tế bào tự do [113, 39]

 Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dịch cho nên các tế bào dễ bị tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dịch

 Khả năng truyền khối kém [113]

 Màng membrane có thể

bị bám bẩn do sự hấp phụ cơ chất lên bề mặt màng [113]

Bảng 2.4: So sánh các kỹ thuật cố định tế bào (tiếp theo)

Cố định trên bề

mặt chất mang rắn

Nhốt trong khung mạng xốp

Keo tụ tế bào (tạo hạt)

Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn Chất

mang

 Các vật liệu

cellulose:

DEAE-cellulose, gỗ, mùn

cưa, mùn cưa đã

Membrane làm bằng vật liệu cellulose acetate, polyamide [138]

2.2.2 Các chất mang cố định nấm men trong sản xuất rượu vang

Kỹ thuật cố định nấm men trong sản xuất rượu vang đã được nghiên cứu rất rộng rãi, tuy nhiên việc ứng dụng kỹ thuật này trong công nghiệp vẫn còn hạn chế Mục đích của việc sử dụng nấm men cố định là để cải thiện năng suất sinh ethanol cũng như hương vị và chất lượng sản phẩm Để có thể ứng dụng thành công trong công nghiệp, chất mang được sử dụng để cố định phải đạt được độ an toàn thực phẩm, có nhiều trong tự nhiên, giá thành thấp và không làm ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của rượu vang [111, 113, 130, 155, 197]

Nhiều loại chất mang sử dụng để cố định nấm men trong lên men rượu vang đã được nghiên cứu và trình bày trong bảng 2.5

Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (còn nữa)

Phân loại chất mang Một số chất mang chính Vi sinh vật Tác giả Tài liệu tham khảo

CHẤT MANG KHÔNG CÓ NGUỒN GỐC THỰC PHẨM

Chất mang vô cơ -alumina Saccharomyces cerevisiae Bakoyianis và cộng sự, 1997

Kourkoutas và cộng sự, 2003 Kourkoutas và cộng sự, 2006 Loukatos và cộng sự, 2000

14

108

105

125

Bakoyianis và cộng sự, 1992 Bakoyianis và cộng sự, 1997 Kourkoutas và cộng sự, 2003 Kourkoutas và cộng sự, 2006 Loukatos và cộng sự, 2003

Chất mang hữu cơ -carrageenan Saccharomyces cerevisiae Gòdia và cộng sự, 1991

Nakanishi và Yokotsuka, 1987 Tataridis và cộng sự, 2005

Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (tiếp theo và còn nữa)

Phân loại chất mang Một số chất mang chính Vi sinh vật Tác giả Tài liệu tham khảo Chất mang hữu cơ Agar Saccharomyces cerevisiae Nakanishi và Yokotsuka, 1987 147

Ferraro và cộng sự, 2000

43

66

Colagrande và cộng sự, 1994 Ferraro và cộng sự, 2000 Fumi và cộng sự, 1987 Fumi và cộng sự, 1988 Fumi và cộng sự, 1989 Gòdia và cộng sự, 1991 Mori, 1987

Suzzi và cộng sự, 1996 Silva và cộng sự, 2002 Shimobayashi và Tominaga, 1986 Tataridis và cộng sự, 2005 Yokotsuka và cộng sự, 1993 Yokotsuka và cộng sự, 1997 Yokotsuka và cộng sự, 2003

Rosini và Ciani, 1993 Silva và cộng sự, 2003 Yokotsuka và cộng sự, 1993

126

168

180

212

Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (tiếp theo và còn nữa)

Phân loại chất mang Một số chất mang chính Vi sinh vật Tác giả Tài liệu tham khảo Chất mang hữu cơ Cellulose được bao phủ bởi alginate Saccharomyces cerevisiae Otsuka, 1980 153

DCM (Delignified Cellulosic Material) Saccharomyces cerevisiae Bardi và Koutinas, 1994

Bardi và cộng sự, 1997 Balli và cộng sự, 2003 Loukatos và cộng sự, 2003 Mallouchos và cộng sự, 2003

nhựa trao đổi ion

Saccharomyces cerevisiae Lommi và Advenainen, 1990 121

Bardi và cộng sự, 1996, 1997 Iconomopoulou và cộng sự, 2000 Loukatos và cộng sự, 2003 Mallouchos và cộng sự, 2003

màng alginate

Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe

Ogbonna và cộng sự, 1989 152

Chất mang dạng màng Màng membrane Saccharomyces cerevisiae Takaya và cộng sự, 2002 190

Màng vi bao sinh học (biocapsule) Saccharomyces cerevisiae Peinado và cộng sự, 2005

Peinado và cộng sự, 2006

155

156

Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (tiếp theo)

Phân loại chất mang Một số chất mang chính Vi sinh vật Tác giả Tài liệu tham khảo

CHẤT MANG CÓ NGUỒN GỐC THỰC PHẨM

Mallios và cộng sự, 2004

107

130

Kourkoutas và cộng sự, 2003 Kourkoutas và cộng sự, 2005

106

111

107

Kourkoutas và cộng sự, 2002 Kourkoutas và cộng sự, 2003 Kourkoutas và cộng sự, 2005 Kourkoutas và cộng sự, 2006 Kourkoutas và cộng sự, 2006

Tsakiris và cộng sự, 2004

197

196

Mallouchos và cộng sự, 2003 Mallouchos và cộng sự, 2003

132

131

134

2.2.3 Cố định nấm men trong gel alginate

2.2.3.1 Alginate

Alginate có khá nhiều trong tự nhiên và có thể xuất phát từ 2 nguồn gốc khác nhau [186]:

 Là thành phần cấu trúc của tảo nâu biển (Phaeophyceae), chiếm đến 40% khối

lượng chất khô

 Là polysaccharide màng bao trong các loại vi khuẩn đất

Tuy nhiên tất cả các alginate thương mại hiện nay đều có nguồn gốc từ tảo

Alginate là một copolymer không phân nhánh, bao gồm các monomer mannuronic acid (gọi tắt là M) và -L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thông qua liên kết 1,4 – glucoside Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block (Hình 2.6) [116, 181, 186]:

-D- Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau

 Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau

 Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau

Hình 2.6: Cấu trúc của alginate: (a) các monomer của alginate, (b) chuỗi alginate, (c) sự phân bố

các block [186]

2.2.3.2 Cơ chế tạo gel

Alginate có khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao hoặc khi phân tử alginate bị acid hóa Tuy nhiên, phương pháp tạo gel bằng cách acid hóa phân tử alginate ít được dùng vì quy trình thực hiện rất phức tạp [186]

Alginate có khả năng kết hợp nhanh với các cation kim loại hóa trị cao để tạo thành gel đồng thể Aùi lực của alginate đối với các ion hóa trị 2 khác nhau giảm theo trình tự:

Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+, Ni2+ > Zn2+ > Mn2+ Tùy thuộc vào loại ion liên kết và loại alginate mà gel tạo thành có tính chất khác nhau Thông thường, người ta thường sử dụng calcium để làm ion tạo gel [144, 181]

Quá trình tạo gel của alginate theo phương pháp kết hợp với cation kim loại hóa trị cao có thể tiến hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngoài và phương pháp tạo gel từ bên trong [186]

Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài

Đây là phương pháp tạo gel phổ biến nhất của alginate Phương pháp này có ưu điểm là tạo gel nhanh và thao tác rất đơn giản (Hình 2.7)

Khi nhỏ dung dịch alginate vào dung dịch có chứa cation có khả năng tạo gel (thường gặp nhất là Ca2+), bề mặt ngoài của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hóa Tiếp theo đó, các cation tạo gel ở bên ngoài hạt alginate tiếp tục khuếch tán vào bên trong hạt làm cho các phân tử alginate bên trong tiếp tục bị gel hóa Quá trình này xảy ra trên bề mặt hạt và phát triển vào bên trong Phương pháp này tạo gel nhanh, tuy nhiên tính đồng thể của hạt gel lại không cao [100, 186, 193]

Hạt gel Cacium Alginate

Alginate

CaCl2

Na-Alginate Lực đẩy

Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên trong

Cho các muối có chứa các cation tạo gel ở dạng vô hoạt (Ví dụ: CaCO3, CaSO4, EDTA-Ca, calcium citrate…) vào dung dịch alginate Thay đổi pH của dung dịch về pH acid bằng các tác nhân acid hóa (Ví dụ: D-glucono--lactone (GDL)) Khi đó, do pH giảm, mà độ hòa tan của các muối chứa các cation tạo gel như ở trên lại phụ thuộc vào pH nên các ion Ca2+ sẽ được giải phóng dần và tham gia vào quá trình tạo gel với alginate (Hình 2.8) Phương pháp này cho hạt gel có tính đồng thể cao hơn hẳn phương pháp khuếch tán

do các ion Ca2+ phân bố đồng đều hơn Hơn thế nữa, phương pháp này còn có thể tạo gel với các hình dạng khác nhau như mong muốn bằng cách cho dung dịch alginate vào khuôn thích hợp trước khi quá trình tạo gel diễn ra Trong khi đó, phương pháp tạo gel từ bên ngoài thường chỉ tạo thành các hạt có hình cầu [67, 100, 101, 186]

H 2 O

GDL H+

Hình 2.8: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong [186]

Theo Anders Johansen và James M Flink (1986), khi nấm men được cố định theo phương pháp gel từ bên trong, tốc độ lên men cao hơn và độ bền gel không giảm trong suốt quá trình lên men khi so sánh với nấm men được cố định theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài [100, 101]

2.2.3.3 Ưu nhược điểm của việc cố định nấm men trong gel alginate

Ưu điểm

 Quá trình cố định dễ thực hiện [10, 35, 102, 103, 115, 176, 192, 194, 209]

 Điều kiện cố định ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất Do đó, các tế bào cố định không bị mất hoạt tính [10, 35, 102, 103, 115, 176, 209, 211]

 Alginate là chất mang trơ về mặt hóa học [176]

 Alginate không có độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm [10, 103, 169,

176, 192]

 Độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm [8, 27]

 Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao [205]

Nhược điểm và cách khắc phục

 Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do [113, 114, 115, 176, 194, 209, 211]:

 Các tế bào nấm men trên và gần bề mặt có khả năng sinh sôi nảy nở chiếm ưu thế so với các tế bào nằm sau bên trong hạt, do đó có thể làm phá vỡ bề mặt hạt gel và dễ dàng thoát ra khỏi hạt gel, phát triển nhanh chóng trong môi trường dưới dạng các nấm men tự do Điều này làm cản trở việc đánh giá động học phản ứng của nấm men cố định, đồng thời gây khó khăn cho việc tách nấm men ra khỏi môi trường lên men Để khắc phục vấn đề này có nhiều cách khác nhau Cách thứ nhất là sử dụng kỹ thuật tạo màng bao Trong phương pháp này, các tế bào sẽ được nhốt bên trong một nhân lỏng được bao bọc bởi một lớp mỏng gel alginate Do đó, các tế bào sẽ có khoảng không nhiều hơn để phát triển bên trong nhân lỏng Vì thế, mật độ tế bào đạt được cao hơn mà không bị thoát bào ra ngoài Hơn thế nữa, bằng cách này có thể sử dụng lượng alginate ít hơn Cách thứ hai là áo nấm men cố định với mạng polymer, có thể thực hiện một bước (bằng cách sử dụng vòi đôi), hoặc hai bước (bằng cách tạo lớp áo polymer sau khi đã tạo hạt nấm men cố định) Đây là phương án rất khả thi vì nó không làm ảnh hưởng đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cũng như tốc độ sử dụng cơ chất

 Sự giải phóng CO2 bên trong gel làm phá vỡ cấu trúc của gel Để khắc phục, có thể làm tăng độ xốp của gel alginate bằng cách giảm nồng độ alginate sử dụng, tuy nhiên điều này lại đồng nghĩa với việc làm yếu mạng gel Vì thế, phải tăng độ bền gel bằng cách áo các hạt alginate xốp này với màng polymer (ví dụ, chitosan), khi đó độ bền của gel này sẽ tương tự với gel sử dụng nồng độ alginate cao

 Gel Ca-alginate rất nhạy với các chất tạo chelate (hợp chất hữu cơ trong đó nguyên tử tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung dịch) như phosphate, citrate và lactate và các chất không tạo gel (non-gelling) như là các ion sodium và magnesium Sự có mặt của các ion này trong dung dịch sẽ làm cho các hạt bị phồng ra, dẫn đến tăng kích thước các lỗ xốp, làm giảm tính ổn định và phá vỡ cấu trúc hạt gel Thông thường người ta thường thêm vào môi trường lên men các chất ổn định gel như là CaCl2, celite và pectine với một hàm lượng thích hợp để ổn định độ bền gel Hoặc cũng có thể làm cứng gel bằng cách sử dụng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) và các loại vật liệu composite (colloidal silica) [10, 102, 103, 144, 193, 194]

 Không bền hóa học trong dung dịch điện phân và dung dịch có pH cao Để khắc phục điều này, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và có nhiều phương pháp được đưa ra: tạo liên kết của hạt gel với glutaraldehyde (Takata và cộng sự, 1977), với polycations (Birnbaum và cộng sự, 1981) và sấy khô hạt gel (Klein và Wagner,

trong dung dịch điện phân, nhưng rõ ràng là chúng rất phức tạp và tốn nhiều thời gian Một số tác giả đã đưa ra phương pháp khác là dùng các ion Ba2+ và Sr2+ thay cho ion Ca2+ truyền thống Các ion này có ái lực mạnh hơn đối với alginate, vì thế hạt gel barium và strontium alginate bền hơn trong dung dịch điện phân so với hạt gel calcium alginate Tuy nhiên, các ion này vẫn không được ứng dụng rộng rãi vì độc tính của nó đối với nấm men và với môi trường [144, 183, 192, 193, 194]

2.2.3.4 Ảnh hưởng của thành phần alginate và các điều kiện tạo gel đến độ bền gel và quá trình lên men

Aûnh hưởng của khối lượng phân tử

Anders Johansen và James M Flink (1986) đã nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử alginate thông qua các thí nghiệm với các loại alginate có độ nhớt khác nhau Kết quả cho thấy rằng khối lượng phân tử ít có ảnh hưởng đến tốc độ lên men và sự tạo thành ethanol, mặc dù tốc độ lên men nhìn chung giảm khi tăng khối lượng phân tử Trong khi đó, độ bền gel (được đo bằng khả năng chống chịu đối với lực nén ép) tăng đáng kể khi tăng độ nhớt từ 5 đến 70cP (độ nhớt là đại lượng đặc trưng cho khối lượng phân tử của alginate), nhưng khi độ nhớt tăng cao hơn nữa (250 đến 600cP) thì độ bền gel tăng rất ít [101]

Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ nhớt đến khả năng khuếch tán của glucose và kết quả cho thấy rằng khả năng khuếch tán của glucose không phụ thuộc vào độ nhớt Trong quá trình xử lý nhiệt, độ nhớt của alginate giảm do giảm mức độ polymer hóa của các phân tử alginate Như vậy, việc tiệt trùng alginate không ảnh hưởng bất lợi đến khả năng khuếch tán của glucose [210]

Aûnh hưởng của tỷ lệ G/M

Tỷ lệ G/M là phần mol của L-guluronic acid trên D-mannuronic acid, biểu thị thành phần của alginate

Khi tỷ lệ G/M giảm thì:

 Tốc độ lên men có xu hướng tăng, nhưng không đáng kể [101]

 Độ bền gel giảm, vì các ion hóa trị 2 như là calcium, barium, strontium được ưu tiên liên kết vào block G hơn là block M và block MG Do đó alginate có hàm lượng G lớn sẽ tạo thành gel xốp, chắc hơn và vẫn giữ được độ cứng vững trong một thời gian dài Trong suốt quá trình tạo liên kết với Ca2+, các loại alginate này sẽ không

bị phồng nở hay co rút, vì thế vẫn giữ được hình dạng tốt hơn Thêm vào đó, alginate có hàm lượng G cao sẽ cản trở sự sinh trưởng của tế bào nấm men sau khi cố định Trái lại, alginate có hàm lượng M cao tạo thành gel mềm và ít xốp hơn và dễ bị rã ra hơn so với các gel giàu G [101, 116, 144, 173, 181, 192, 193] Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu và kết luận rằng gel alginate giàu G thích hợp để cố định nấm men hơn vì gel này ít gây cản trở đến khả năng khuếch tán của glucose và có độ bền cơ học cao hơn [210]

Aûnh hưởng của nồng độ alginate

Tăng nồng độ alginate trong khoảng 1 – 10% làm giảm đáng kể tốc độ lên men và tốc độ sinh tổng hợp cồn do làm giảm sự khuếch tán nhưng lại làm tăng độ bền gel [101,

146, 205, 210]

Theo nhiều nhà nghiên cứu, nồng độ alginate thích hợp để cố định nấm men là 2% [101, 146, 210]

Aûnh hưởng của pH tạo gel

Theo Kazuaki và cộng sự (1995), pH của dung dịch alginate thích hợp cho quá trình tạo gel là từ 6,0 đến 8,0 Nằm ngoài khoảng này, khả năng khuếch tán của glucose và độ bền gel đều giảm Đó là do pH đã làm thay đổi hình dạng của các phân tử alginate [210]

Aûnh hưởng của nhiệt độ tạo gel

Theo Kazuaki và cộng sự (1995), khi nhiệt độ tạo gel dưới 298K, khả năng khuếch tán của glucose gần như không đổi, nhưng khi tăng nhiệt độ trên 300K thì khả năng khuếch tán của glucose giảm nhanh Độ bền gel cũng gần như không đổi khi nhiệt độ tạo gel dưới 298K, nhưng giảm nhanh khi tăng nhiệt độ trên 300K Nhiệt độ tạo gel ảnh hưởng đến khả năng khuếch tán của glucose và độ bền gel là do nhiệt độ đã làm thay đổi hình dạng của phân tử alginate Như vậy, nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo gel là nhiệt độ dưới 298K [210]

Aûnh hưởng của mật độ tế bào trong hạt

Để đánh giá ảnh hưởng của mật độ tế bào, Anders Johansen và James M Flink (1986) đã tiến hành thí nghiệm với 2 mật độ tế bào là 0,5% và 10% (tương ứng với 2.108 và 4.109tế bào/ g gel) Kết quả cho thấy rằng khi mật độ tế bào ban đầu cao, tốc độ lên men/ g hạt thì cao hơn nhưng năng suất/ tế bào thì thấp hơn so với mật độ tế bào ban đầu thấp Đó là

do sự có mặt của lớp bề mặt tế bào hoạt hóa ngay sát bề mặt hạt gel, tương tự như với nghiên cứu của Wada và cộng sự (1979) đối với các hạt -carrageenan Lớp tế bào này làm ngăn cản sự khuếch tán của cơ chất và/ hoặc sản phẩm xuyên qua mạng gel, và do đó các tế bào bên trong gần như bị bất hoạt Trong trường hợp này, năng suất/ tế bào thấp khi mật độ tế bào cao đó là do các tế bào nằm ở bên dưới lớp bề mặt cũng được tính vào mật độ tế bào nhưng không tham gia vào quá trình tạo thành sản phẩm [101]

Aûnh hưởng của tỷ lệ S/V

Diện tích bề mặt riêng (diện tích bề mặt/ thể tích) là một yếu tố quan trọng đối với năng suất lên men/g hạt, khi tỷ lệ S/V càng cao thì năng suất càng cao Đối với một tỷ lệ S/V nhất định, hình dạng gel không ảnh hưởng đến tốc độ lên men [101]

2.2.4 Một số tính chất của nấm men cố định

2.2.4.1 Những sự thay đổi về sinh trưởng, hình thái của tế bào nấm men khi cố định trên chất mang

Như chúng ta đã biết, quá trình sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường quanh nó Khi cố định tế bào, do sự tương tác giữa tế bào – chất mang và giữa các tế bào với nhau mà khả năng sinh trưởng và hình thái của tế bào cũng có một vài biến đổi [73]

Theo một số tác giả, khả năng sinh trưởng của nấm men cố định kém hơn so với nấm men tự do:

 Banyopadhyay và cộng sự (1982) đã tiến hành nghiên cứu khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm men cố định trên thủy tinh xốp (Controled pore glass) bằng phương pháp hấp phụ Khả năng sinh trưởng của nấm men tự do và cố định được đánh giá gián tiếp thông qua tốc độ hấp thu O2 và tốc độ sinh CO2 Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm men cố định có hiện tượng giảm khả năng hấp thu O2 và sinh CO2 so với nấm men tự do [16]

 Doran và cộng sự (1985) cũng tiến hành khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm

men Saccharomyces cerevisiae cố định trên gelatin Kết quả thực nghiệm thu được

tương tự như kết quả của Bandyopadhyay và cộng sự (1982) Ngoài ra tác giả còn nhận thấy rằng tốc độ sinh trưởng và tỷ lệ nảy chồi của nấm men cố định trên gelatin đều thấp hơn so với nấm men tự do [56]

Nguyên nhân của hiện tượng này là do:

 Hệ lên men sử dụng nấm men cố định là một hệ phản ứng dị thể, trong đó, các chất dinh dưỡng có xu hướng tập trung trên bề mặt chất mang, vì vậy nấm men hấp phụ trên bề mặt chất mang có điều kiện tiếp xúc với nồng độ chất dinh dưỡng cao hơn

so với trong môi trường đồng thể Chính sự thay đổi áp lực thẩm thấu một cách đột ngột gây mất cân bằng trao đổi chất qua màng tế bào, làm ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của tế bào [16]

 Chồi có thể được hình thành ở bất kỳ vị trí nào trên bề mặt tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae, tuy nhiên phổ biến nhất là chồi sẽ mọc ở các cực

ellipsoide của tế bào nấm men lưỡng bội Vì vậy khi 1 cực của tế bào nấm men gắn vào chất mang sẽ vô tình làm mất đi sự hình thành của một chồi mới [56]

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy rằng nấm men cố định luôn sinh trưởng đạt đến một số lượng tế bào không đổi và giữ nguyên như vậy cho đến khi kết thúc quá trình lên men:

 Wada và cộng sự (1980) nhận thấy rằng nấm men cố định sinh trưởng và giữ ổn định ở khoảng 5,4.109 tế bào/mL gel [201]

 Melzoch và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sự phát triển và hình thái của nấm men cố định trong gel Ca-alginate Các tế bào nấm men cố định sau khi được hoạt hóa, nếu được nuôi cấy trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, số lượng tế bào sẽ tăng

lên rất nhanh (khoảng 1010 tế bào/mL gel) và sau đó hầu như giữ nguyên không đổi [142]

Bên cạnh đó, Melzoch và cộng sự cũng thấy rằng 80% tế bào cố định trong gel alginate đều duy trì hoạt tính trao đổi chất và khả năng phát triển khi nuôi cấy trong thời

gian dài Saccharomyces cerevisiae cố định trong gel alginate có thể duy trì khả năng sử

dụng đường của chúng ở mức độ tương đối cao và ổn định, chỉ giảm khoảng 20% sau 1122 giờ nuôi cấy [142]

Hình thái của nấm men cố định cũng thay đổi nhiều so với nấm men tự do:

 Banyopadhyay và cộng sự (1982) giả thuyết rằng chính sự mất cân bằng về trao đổi chất làm cho các chồi của nấm men sau khi mọc thành nhanh chóng bị tách ra khỏi tế bào mẹ, làm cho hình thái tế bào nấm men bị thay đổi [16]

 Melzoch và cộng sự (1994) khảo sát sự thay đổi hình thái của tế bào nấm men cố định trong gel được tiến hành bằng cách quan sát dưới kính hiển vi điện tử Kết quả khảo sát cho thấy tế bào nấm men cố định có hình dạng và kích thước không đồng đều Điều đó cho thấy sự phát triển của các tế bào bị nhốt trong hạt gel phụ thuộc vào độ xốp và cấu trúc của mạng gel cũng như khả năng chiếm chỗ trống trong hạt gel của tế bào nấm men Trong chất mang, các tế bào nấm men có xu hướng kết tụ lại với nhau [142]

2.2.4.2 Những thay đổi về hoạt động trao đổi chất của tế bào nấm men khi cố định trên chất mang

Nhiều nghiên cứu của các tác giả cho thấy rằng nấm men cố định có tốc độ sử dụng glucose, tốc độ sinh tổng hợp ethanol và glycerol cao hơn nhiều so với nấm men tự do mặc dù diện tích bề mặt tế bào của nấm men cố định dùng để vận chuyển chất dinh dưỡng nhỏ hơn so với của nấm men tự do (bảng 2.6) [15, 43, 52, 56, 73, 74, 75, 131, 138, 154, 193] Glazzo và Bailey (1990) giải thích là do quá trình cố định làm thay đổi sự vận chuyển proton qua màng tế bào nấm men (Thể hiện qua giá trị pH nội bào của nấm men cố định hơi thấp hơn một chút so với giá trị pH nội bào của nấm men tự do: giá trị pH nội bào của nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate lần lượt là 6,9 và 6,8) Để duy trì ổn định pH nội bào, nấm men phải tăng tốc độ sử dụng ATP Như chúng ta đã biết, quá trình sinh tổng hợp ethanol bị hạn chế khi có sự có mặt của ATP Chính vì vậy, ở nấm men cố định, quá trình sử dụng ATP tăng làm giảm sự có mặt của ATP trong tế bào, kết quả dẫn đến tốc độ sinh tổng hợp ethanol ở tế bào nấm men cố định tăng vọt [74]

Thêm vào đó, Galazzo và cộng sự (1987) cho rằng pH nội bào của tế bào cố định thấp hơn so với tế bào tự do, do đó làm tăng tốc độ của các phản ứng xúc tác bởi phosphofructokinase và hexokinase Vì thế làm tăng tốc độ lên men [75]

Ngoài ra, nguyên nhân còn có thể là do nấm men cố định đã có những thay đổi trong thành phần tế bào:

 Thay đổi thành phần lipid của màng membrane [96, 138]

 Thay đổi hàm lượng các chất trao đổi trung gian như là fructose-1,6-diphosphate, glucsoe-6-phosphate và 3-phosphoglycerate [73]

 Hàm lượng polysaccharide tạo cấu trúc (glycogen, mannan, glucan, trehalose), chất dự trữ glycogen, DNA, và RNA cao hơn so với tế bào tự do [38, 71, 73, 96, 113,

138, 150, 193]

Bảng 2.6: Tốc độ sử dụng cơ chất và hình thành sản phẩm của nấm men cố định trong gel alginate

và nấm men tự do [74]

Nấm men tự do (mmol/ L/ ph)

Nấm men cố định (mmol/ L/ ph) Tốc độ sử dụng glucose

Tốc độ sinh tổng hợp ethanol

Tốc độ sinh tổng hợp glycerol

21,1 37,1 3,5

42,7 70,0 6,9

Cũng giống như khi nuôi cấy trên môi trường tổng hợp, nấm men cố định khi nuôi cấy trong môi trường dịch nho ép trong lên men rượu vang cũng cho kết quả tương tự

Kết quả nghiên cứu của Bakoyianis và cộng sự (1997) về quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men cố định trên -alumina, kissiris và alginate cho thấy nấm men cố định có tốc độ sử dụng đường cũng như tốc độ sinh tổng hợp ethanol cao hơn hẳn nấm men tự do Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy khi nhiệt độ giảm, hoạt động trao đổi chất của nấm men cũng giảm Tuy nhiên, ở bất kỳ trường hợp nào, hoạt động trao đổi chất của nấm men cố định cũng cao hơn nấm men tự do [14]

2.2.4.3 Những thay đổi về khả năng chống lại các yếu tố bất lợi trong môi trường của tế bào nấm men cố định

Lượng cơ chất càng cao hoặc lượng sản phẩm càng cao thì càng ức chế hoạt động sống của tế bào nấm men Tuy nhiên, so với nấm men tự do thì nấm men cố định có khả năng chịu được sự ức chế cơ chất và sản phẩm cao hơn:

 Desimone và cộng sự (2002) đã cho nấm men tiếp xúc với ethanol nồng độ 80% (v/v) trong nhiều khoảng thời gian khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng sống sót của nấm men cố định cao hơn rất nhiều so với nấm men tự do Sau 5 phút tiếp xúc với ethanol, nấm men tự do bị tiêu diệt hoàn toàn, trong khi số lượng nấm men cố định vẫn tương đương với thời điểm ban đầu [53]

 Nghiên cứu của Krisch và Szajáni (1997) cho thấy rằng hàm lượng glucose trên 16% (v/v) thì có ảnh hưởng độc đối với các tế bào nấm men tự do Khi nồng độ cồn đạt 20% thì nấm men tự do không còn tồn tại Các tế bào nấm men được nhốt trong gel alginate và hấp phụ trên cellulose thì có khả năng sống sót cao hơn nhiều so với nấm men tự do, lần lượt là 72 và 62% [117]

 Holcberg và Margalith (1981) cho rằng hàm lượng glucose 40 và 50%w/w sẽ ức chế tế bào tự do, làm cho quá trình lên men hầu như không xảy ra, trong khi đó tế bào cố định vẫn có thể lên men mặc dù tốc độ chậm [91]

Hiện tượng này có thể được giải thích như sau:

 Sự có mặt của chất mang đã bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của hàm lượng cồn cao và ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu cao do đường gây ra [12, 113, 117, 133, 150, 206]

 Nấm men cố định tạo thành glycerol nhiều hơn Glycerol có tác dụng làm cân bằng thế oxy hóa khử nội bào của nấm men hoặc sự cân bằng NAD+/NADH và hoạt động như là một chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu đối với áp lực thẩm thấu cao của đường trong suốt quá trình lên men Nhiều tác giả cũng cho rằng khi hàm lượng đường càng tăng thì lượng glycerol tạo thành cũng tăng [15, 43, 52, 60]

 Nấm men cố định chứa lượng acid béo no cao hơn so với nấm men tự do, nên làm tăng khả năng chịu nồng độ cồn cao Mức độ no của acid béo càng tăng sẽ làm tăng khả năng chịu đựng đối với ethanol Agudo (1992) cũng nhận thấy rằng các giống

Saccharomyces chịu cồn có chỉ số không no thấp hơn so với các chủng ít chịu cồn

[53, 117, 150]

 Nấm men cố định có sự thay đổi về khả năng vận chuyển các chất qua màng, do đó làm tăng khả năng giải phóng ethanol nội bào ra ngoài môi trường Nagodawithana và Steinkraus (1976) cho rằng khả năng chịu cồn tùy thuộc vào khả năng tế bào giải phóng ethanol nội bào ra ngoài môi trường [150, 163, 206]

 Có hoạt tính enzyme ADH (là enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa acetaldehyde thành ethanol) cao hơn [59]

Ngoài ra, theo Ladato và cộng sự (1999), nấm men cố định trong các vật liệu khác nhau đều tăng khả năng sống sót và khả năng chịu nhiệt trong điều kiện bảo quản đông và đông khô so với nấm men tự do [113]

2.2.4.4 Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm phụ tạo hương vị cho rượu vang của nấm men cố định

Trong quá trình lên men rượu vang, khả năng sinh tổng hợp sản phẩm phụ tạo hương

vị cho rượu vang của nấm men được coi là một trong những tính chất quan trọng nhất Các chất tạo hương vị cho sản phẩm rượu vang là một tổ hợp bao gồm rất nhiều chất thuộc họ ester, aldehyde, ketone, rượu cao phân tử, acid béo và các hợp chất có chứa lưu huỳnh … Các chất này được hình thành trong quá trình trao đổi chất của nấm men (Hình 2.9), đặc biệt là từ các quá trình trao đổi acid amine, và nó đặc trưng cho từng loại rượu vang khác nhau Trong đó, rượu cao phân tử và ester là thành phần chiếm phần lớn khối lượng của các sản phẩm phụ [28, 113, 131, 135]

Ethyl ester của các acid béo cũng như ethyl ester của rượu đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hương thơm đặc trưng sản phẩm rượu vang Ngược lại, rượu cao phân tử và acetaldehyde lại được coi là các yếu tố gây ảnh hưởng không tốt đến mùi vị của sản phẩm [28, 113, 131, 135, 139]