Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 2 - TS. Nguyễn Xuân Cảnh

Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 2 Enzyme, cung cấp cho người học những kiến thức như: Giới thiệu chung; Phân nhóm enzyme; Cơ chế xúc tác enzyme; Động học phản ứng enzyme; Phương pháp xác định hoạt độ enzyme; Sàng lọc cơ chất cho enzyme. Mời các bạn cùng tham khảo!

• Phương pháp xác định hoạt độ enzyme

• Sàng lọc cơ chất cho enzyme

Một số khái niệm chung

• Enzyme là chất xúc tác sinh học, có mặt trong tất cả các cơ thể sống

• Chúng thúc đẩy một phản ứng xảy ra mà không có mặt trong sản phẩm cuối cùng

• Ngoại trừ một nhóm nhỏ RNA có tính xúc tác (ribozym), tất cả enzyme đều có bản chất là protein

• Tính chất xúc tác phụ thuộc vào cấu tạo của protein

• Một số enzyme cấu tạo gồm toàn những phân tử L-amino acid liên kết với nhau tạo thành, gọi là enzyme một thành phần

• Đa số enzyme là những protein phức tạp gọi là enzyme hai thành phần Phần

Nhóm ngoại: Có thể là hợp chất hữu cơ (coenzyme) nhƣ vitamin, NAD…

hoặc ion kim loại

Phân loại enzyme/ Enzyme Classification (EC)

Cách gọi tên: tên cơ chất đặc hiệu + tên của loại phản ứng + ase

Phân loại: enzyme chia thành 06 lớp gồm;

• Oxydoreductase: xúc tác cho phản ứng oxy hoá - khử

• Transpherase: xúc tác cho phản ứng chuyển vị các nhóm từ một phân tử này

đến một phân tử khác

• Hydrolase: xúc tác cho phản ứng thuỷ phân cũng là vận chuyển các nhóm

chức năng nhưng chất nhận luôn là phân tử nước

• Lyase: xúc tác cho phản ứng thêm các nhóm vào nối đôi, hoặc tạo thành nối

đôi bằng cách loại các nhóm

• Isomerase: xúc tác cho phản ứng đồng phân hoá, chuyển vị các nhóm trong

nội bộ phân tử tạo dạng đồng phần

• Ligase: xúc tác cho phản ứng tạo thành liên kết C-C, C-O, C-S và C-N bằng

phản ứng ngưng tụ kèm theo phản ứng cắt đứt liên kết giàu năng lượng của các nucleosid trisphosphate, (thường là ATP)

• Mỗi lớp chia thành nhiều tổ, mỗi tổ chia thành nhiều nhóm, mỗi nhóm

có nhiều enzym khác nhau

• Trong bảng phân loại, ký hiệu enzym thường gồm 04 chữ số ngăn cách nhau bởi dấu “.”: số thứ nhất chỉ lớp, số thứ 2 chỉ tổ, số thứ 3 chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzym

• Ví dụ: enzym mang ký hiệu EC 2.6.1.6 là enzym leucine transaminase

thuộc nhóm Transferases (lớp 2), xúc tác phản ứng chuyển vị nhóm có chứa Nitơ (tổ 6/ Transferring nitrogenous groups), nhóm chứa Nitơ đó là nhóm amin từ Leucine (nhóm 6)

• Phản ứng:

L-leucine+ 2-oxoglutarate = 4-methyl-2-oxopentanoate + L-glutamate

Giới thiệu hệ thống phân loại enzyme quốc tế

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

• Xúc tác phản ứng oxy hóa khử Cơ chất bị oxy hóa được coi là chất cho H

• Tên enzyme: Chất cho: Chất nhận oxidoreductase

• Tên thông dụng sẽ là Dehydrogenase

• Tên Reductase cũng có thể dùng trong trường hợp chất nhận là O2

• Con số thứ 2 của các enzyme thuộc nhóm oxidoreductases (ngoại trừ 11, 13,

14 hoặc 15) chỉ nhóm trong chất cho hydrogen sẽ bị oxi hóa: nhóm CHO, CHO hoặc –CO-COOH

-• Con số thứ 3, ngoại trừ EC 1.11, EC 1.13, EC 1.14 và EC 1.15 chỉ ra dạng

chất nhận tham gia vào phản ứng xúc tác: NAD(P)+, Cytochrome, Oxy (O), S-S

• Các enzyme thuộc lớp này: dehydrogenases, reductases

• Ví dụ: lactate dehydrogenase (NAD+), acyl CoA dehydrogenase (FAD), ketoacyl-ACP reductase (NADPH/H+)

Lớp 1 Oxidoreductase

Dehydrogenase: enzyme oxi hóa một cơ chất bằng cách chuyển 1 hoặc nhiều hydride (H-) tới một chất nhận, thường là NAD+/NADP+ hoặc một flavin coenzyme như FAD or FMN

• Aldehyde dehydrogenase (oxy hóa aldehyde)

• Acetaldehyde dehydrogenase (chuyển acetaldehyde tới acetic acid)

• Là những enzym vận chuyển nhóm, chẳng hạn: methyl, glycosyl

• Tên enzyme: donor: acceptor grouptransferase

• Tên thông dụng thường đặt theo acceptor grouptransferase hoặc donor grouptransferase Chất cho thường là một cofactor (Coenzyme)

• Một số phản ứng xúc tác được mô phỏng: X-Y + Z = X + Z-Y

• Hoặc chuyển nhóm Y từ X sang Z hoặc cắt đứt liên kết X-Y khi có sự tham gia của Z

• Việc giải thích chỉ mang tính tương đối, vì vậy người ta thường đặt tên theo kiểu Y-transferase

• Các enzyme thuộc lớp này: kinases, aminotransferases, thiolases

• Ví dụ:

glucokinase (ATP), aspartate aminotransferase (PLP), b-ketothiolase

Lớp 2 Transferase

Aspartate transaminase

• Enzyme này xúc tác phản ứng chuyển hóa thuận nghịch aspartate và alpha-ketoglutarate thành oxaloacetate và glutamate

• Enzyme này là một trong những cơ sở

để đánh giá chức năng gan

Oxaloacetate + glutamate ⇌ aspartate + α-ketoglutarate

Serine protease

• Trung tâm hoạt động có Serine

• Chủ yếu có mặt ở các đường tiêu hóa

• Tồn tại dưới dạng zymogen, bị ức chế bởi serine proteinase inhibitors

• Thành viên: Nhóm chymotrypsin, subtilisin

• Nhóm Chymotrypsin: ở eukaryote gồm Chymotripsin, trypsin, elastase

• Nhóm subtilisin: ở prokaryote

Threonine protease

• Threnonine proteases là một họ của các enzyme thủy phân protein có chứa Threonine (Thr) trong trung tâm hoạt động

• Là một trong các protease thuộc

họ proteasome

Cystein protease

• Cystein protease thường có mặt trong hoa quả: đu đủ, dứa, vả, kiwi Lượng protease có nhiều khi quả còn chưa chín Thường dùng làm mềm thịt

• Các cysteine protease có cơ chế xúc tác chung liên quan đến sự có mặt của trung tâm xúc tác chứa nhóm lưu huỳnh của cystein Phản ức xúc tác xảy ra theo kiểu

ái nhân (nucleophill)

• Aspartic proteases bao gồm: pepsins, cathepsins, và renins Chúng

có cấu trúc gồm 2 domain (do sự lặp gene)

• HIV-1 protease thuốc chính trong điều trị HIV

• Chymosin (hay "rennin")  đông tụ sữa

• Renin  điều hòa huyết áp, Vtế bào

• Cathepsin D  marker cho ung thư vú

• Pepsin  Enzyme con đường tiêu hóa

• Plasmepsin  khả năng kháng bệnh sốt rét

• Nepenthesin  nguồn gốc thực vật (giống pepsin)

• Glycoside hydrolases thủy phân liên kết glycosid

Có vai trò quan trọng trong việc phân giải các sinh khối sinh học (carbohydrate)

• Các enzyme quan trọng trong nhóm này:

• Cellulase, amylase, lysozyme, neuraminidase

Beta amylase

• β-Amylase (EC 3.2.1.2) còn gọi là 1,4-α-D-glucan maltohydrolase, glycogenase, saccharogen amylase

• β-amylase được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn, nấm và thực vật

• Khác với α-Amylase có khả năng thủy phân ngẫu nhiên, β-Amylase hoạt động từ đầu không khử, enzyme này thủy phân liên kết α-1,4 glycosid thứ hai và cắt liên kết tạo ra một phân tử maltose

• Trong quá trình chín của quả, β-amylase phân giải tinh bột tạo các đường maltose có mùi đặc trưng

Gamma amylase

• γ-Amylase (EC 3.2.1.3) còn gọi là glucan glucosidase, amyloglucosidase, exo-1,4-α-glucosidase, glucoamylase, 1,4-α-D-glucan glucohydrolase)

1,4-α-• Enzyme có khả năng cắt liên kết α 1-4 glycosid cuối cùng từ đầu không khử của amylose và amylopectin giải phóng các phân tử gluocose

• pH tối ưu của γ-amylase trong môi trường acid, pH ~3

Lysozyme

• Lysozyme (muramidase hoặc N-acetylmuramide glycanhydrolase) (EC 3.2.1.17) có khả năng phân giải thành tế bào vi khuẩn

• Thủy phân liên kết 1,4-beta-giữa các gốc N-acetylmuramic acid và

N-acetyl-D-glucosamine trong mạch peptidoglycan

• Lysozyme có nhiều ở các dịch tiết: nước mắt, nước bọt, sữa người

và các dịch nhày Ngoài ra có nhiều trong lòng trắng trứng

Cellulase

• Cellulase gồm 1 nhóm các enzyme được tiết ra chủ yếu bởi nấm, vi khuản và nguyên sinh động vật có khả năng thủy phân cellulose

• Có một ít số động, thực vật cũng có khả năng sản xuất enzym này

• Phản ứng: Thủy phân liên kết 1,4-beta-D-glycosidic trong cellulose, lichenin, và các dạng D-glucan ở ngũ cốc

Cơ chất cho cellulase

Lichenin (mộc nhĩ, rêu) Cellulose

• Xúc tác loại bỏ hoặc bổ sung thêm các gốc để tạo thành hoặc bẻ gãy các nối đôi

• Các enzyme thuộc nhóm synthase, decarboxylase, dehydratase

• Ví dụ: citrate synthase, pyruvate decarboxylase (TPP), fumarase

Lớp 4 Lyase

• EC 4.5  carbon-halide bonds (halogen)

• EC 4.6  phosphorus-oxygen (adenylate cyclase và guanylate cyclase)

• EC 4.99  ferrochelatase

Lớp 5 Isomerase

• Xúc tác các phản ứng làm thay đổi cấu trúc (không phải thành phần) Sự thay đổi bao gồm: cấu trúc quang học, hình học, cấu trúc isomer

• Các enzyme thuộc nhóm: isomerases, mutases

• Ví dụ: glucose-6-phosphate isomerase, phosphoglycerate mutase

• Các enzym chuyển hóa các dạng đồng phân có vai trò quan trọng khi sản xuất các chất dinh dưỡng vì chúng có thể chuyển các chất từ dạng cơ thể không thể sang dạng

có thể hấp thụ được

• Vai trò trong dược phẩm (dạng hoạt động)

Isomerase

• EC 5.1 xúc tác phản ứng racemization (racemases) và epimerization (epimerases)

• EC 5.2  isomerization của các dạng đồng phân cis-trans

• Các enzyme thuộc nhóm này: synthetases, carboxylases, polymerases

• Ví dụ: glutamine synthetase (ATP), pyruvate carboxylase (biotin), DNA polymerase

Lớp 6 Ligase

• DNA ligase I:  Gắn các đoạn DNA Okazaki

• DNA ligase II:  tìm thấy ở các tế bào không phân chia (dạng trung gian của DNA ligase III)

• DNA ligase III:  phức hợp DNA-protein sửa chữa, để hàn gắn các DNA trong quá trình sửa chữa

• DNA ligase IV:  tạo phức hợp xúc tác kết nối các DNA sợi đơ bị gẫy Có vai trò trong quá trình tái tổ hợp sắp xếp các gene để hình thành kháng thể và các thụ thể của tế bào T trong quá trình phát triển hệ thống miễn dịch

 Trung tâm hoạt động: 1 phần trong phân tử enzym có chứa các nhóm chức trực tiếp kết hợp với cơ chất để chuyển hóa thành sản phẩm Trung tâm hoạt động không có nghĩa là một vùng gồm các amino acid nằm liên tục trên chuỗi polypeptide mà chúng có thể nằm xa nhau (gần nhau về mặt không gian

 Một số enzyme có thêm vị trí dị lập thể: Là nơi gắn với chất ức chế không cạnh tranh hoặc chất hoạt hoá của E

Cấu trúc không gian

• Enzyme  tăng tốc độ phản ứng (giảm hàng rào năng lượng của phản ứng hay năng lượng hoạt hóa)

• Liên kết cộng hóa trị có năng lượng liên kết giữa 2 nguyên tử khoảng 50 đến 200 kcal/mol Ở nhiệt độ phòng, năng lượng nhiệt động học khoảng 0.6 kcal/mol  các liên kết hóa cộng hóa trị này không thể bị bẻ gãy nếu như không có sự tham gia của các yếu tố bên ngoài (enzyme)

• Enzyme sẽ tạo ra một “môi trường” làm giảm năng lượng hoạt hóa cần thiết

Cơ chế xúc tác

Course of reaction without enzyme

E A without enzyme

is lower

Course of reaction with enzyme

Hoạt động của enzyme

Tính đặc hiệu của enzym

• Đặc hiệu tuyệt đối: Enzym chỉ xúc tác trên một cơ chất nhất định

và hầu như không có tác dụng với chất nào khác Ví dụ: Enzyme urease xúc tác cho phản ứng phân giải ure tạo ra NH3 và CO2

• Đặc hiệu nhóm tuyệt đối: Enzym chỉ xúc tác trên những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên kết và có những đòi hỏi nhất định đối với nhóm nguyên tử ở gần liên kết mà nó tác dụng

Ví dụ: Enzyme Maltase thuộc nhóm  -glucozida chỉ xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết Glucoside được tạo thành từ nhóm OH- Glucoside của Glucose với nhóm -OH của một monose khác

• Đặc hiệu nhóm tương đối : Enzym không đỏi hỏi quá nghiêm ngặt

về nhóm ở gần liên kết bị phân giải Ví dụ: Lipase, proteinase

Bản chất hóa học của quá trình xúc

tác bởi enzyme

• Sự tương tác của cơ chất với trung tâm hoạt động của enzym

• Trung tâm hoạt động được hình thành do sự tương tác của các nhóm chức, gốc amino acid thông qua liên kết hydro

Trung tâm hoạt động có tính chất linh động

• Sự tương ứng về cấu hình không gian giữa trung tâm hoạt động và cơ chất được hình thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất

• Mô hình hoạt động

 Giả thuyết chìa và ổ khoá :

Do Fisher đề xuất năm 1894, theo đó enzyme là ổ khoá, cơ chất là chìa khoá, chỉ khi chìa khớp với ổ khoá phản ứng mới xáy ra

 Giả thuyết về khớp cảm

1958, Giả thuyết này mềm dẻo hơn, phù hợp với đặc điểm của sinh học, cho đến nay chưa có giả thuyết nào khác thay thế nó

3 Tương tác van der Waals

Tương tác này không có tính đặc hiệu nhưng có trò làm tăng khả năng tương tác cho phức E-S

• Một số enzyme có thể dự đoán bằng cách phân loại sơ bộ

• Thực hiện các phản ứng chuyển hóa

• Xác định và nhận dạng sản phẩm tạo thành bằng các phương pháp sắc ký (HPLC, FPLC, GCMS, NMR)

• Ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện

• Việc tìm kiếm cơ chất rất vất vả, tốn nhiều thời gian và chi phí cao

• Các chương trình máy tính được sử dụng rộng rãi trong việc dự đoán các tương tác enzyme cơ chất

• Cơ sở của các phương pháp này là dựa vào những đặc điểm tương tự

trong cơ chế nhận diện và tương tác cơ chất

• Các phương pháp in silico đã đang được áp dụng rộng rãi

• Hiện nay có khoảng hơn 500 loại protease

• Nghiên cứu các sản phẩm thủy phân bằng phương pháp khối phổ

(nhận dạng các mảnh peptide)  xác định được cơ chất cho enzyme

Sàng lọc cơ chất cho enzyme

Phương pháp xác định hoạt độ enzyme

 Mục đích: Đánh giá được khả năng xúc tác của enzyme

 Dựa vào 2 cơ sở chính:

• Sản phẩm tạo thành trong một khoảng thời gian ở điều kiện tối

Đơn vị hoạt độ enzyme

• Đơn vị quốc tế ( IU ): độ hoạt tính sinh học của một enzyme

• Một đơn vị IU là hoạt độ của một enzyme (không phải là lượng enzyme) xúc tác cho phản ứng chuyển hóa 1 µM cơ chất trong 1 phút ở các điều kiện tối ưu

Đơn vị enzyme (enzyme Unit)

Đơn vị enzyme ( U ): Là lượng enzyme cần thiết để xúc tác chuyển hóa 1 µM cơ chất trong 1 phút

1 U ~ 1 µM cơ chất/ 1 phút

• Đơn vị quốc tế ( IU ) khác với Đơn vị enzyme ( U ):

Đơn vị Katal

• Đơn vị Katal ( kat ): Một đơn vị kat là lượng enzyme cần thiết cho phản ứng xúc tác chuyển hóa 1 mol cơ chất trong 1 giây

ở điều kiện phân tích

• 1 kat ~ 1 mol cơ chất/ 1 giây

• Quy đổi: 1 kat = 60.10 6 U

Hoạt độ tổng số

• Trong một mẫu enzyme chưa tinh sạch (ngoài thành phần enzyme có có nhiều thành phần protein khác)

• Hoạt độ của enzyme (tính theo đơn vị hoạt độ) trên một đơn vị khối lượng protein

Hoạt độ riêng (specific activity)

• Định nghĩa: số đơn vị hoạt độ enzyme trên một đơn vị khối lượng protein

• Cơ sở để đánh giá độ sạch của mẫu enzyme

• Mẫu enzyme càng sạch, số đơn vị hoạt độ enzyme sẽ càng lớn

Phương pháp xác định hoạt độ enzyme

Định lượng cơ chất mất đi sau một khoảng thời gian ở điều kiện tối ưu

• Các phản ứng màu (đo quang phổ)

• Các phương pháp phóng xạ

• Bằng huỳnh quang (FACS, Elisa)

Nghiên cứu động học enzyme

Nghiên cứu động học enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố:

nồng độ cơ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm… đến tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác

 Có thể biết được cơ chế phân tử của sự tác động của enzyme

 Cho phép hiểu được mối quan hệ về mặt lượng của quá trình enzyme

 Là điều kiện cần thiết để thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme

 Khi lựa chọn các đơn vị hoạt động enzyme cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối với hoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của chúng

Ảnh hưởng của nồng độ enzym

Động học các phản ứng enzym

• Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S]>>[E] lúc này tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [E]

• Đo [E] bằng cách đo vận tốc phản ứng do enzyme đó xúc tác: v=k[E]

• Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa thì vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó

V

[E]