Thực hành di truyền phân tử

Nội dung - Bài 1: Một số kiến thức cơ bản về thực hành di truyền phân tử - Bài 2: An toàn phòng thí nghiệm và nguyên tắc sử dụng kính hiển vi - Bài 3: Quan sát nhiễm sắc chất giới tính

THỰC TẬP DI TRUYỀN ĐẠI CƯƠNG

Số đơn vị học trình : 1

Người biên soạn: PHAN ĐẶNG THÁI PHƯƠNG

Đơn vị: BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- Phần thực hành gồm 5 buổi, mỗi buổi thực hành kéo dài trong 5 tiết

- Thực hành theo nhóm nhỏ 5-8 sinh viên/ nhóm

- Mỗi sinh viên bắt buộc phải làm tiêu bản và nộp sau mỗi buổi học thực hành

- Đánh giá kiến thức bằng hình thức vấn đáp trực tiếp và cách làm tiêu bản trong quá trình học thực hành

III Nội dung

- Bài 1: Một số kiến thức cơ bản về thực hành di truyền phân tử

- Bài 2: An toàn phòng thí nghiệm và nguyên tắc sử dụng kính hiển vi

- Bài 3: Quan sát nhiễm sắc chất giới tính

- Bài 4: Phân bào nguyên nhiễm (Mitosis) cơ sở tế bào của sinh sản vô tính

- Bài 5: Phân bào giảm nhiễm (Meiosis) cơ sở tế bào của sinh sản hữu tính

- Bài 6: Hiện tượng ức chế sự phân bào

• Chú ý:

1 Sinh viên phải hiểu rõ và thực hiện nghiêm túc nội quy phòng thí nghiệm

2 Giờ thực tập : Sáng từ 7h30-11h30; Chiều từ 13h00-17h00

3 Sinh viên thực tập đúng nhóm đăng ký, khi nghỉ phải xin phép và phải thực tập bù

4 Mang theo đầy đủ vật dụng thí nghiệm: mang bảng tên, áo blouse, viết chì, giấy, bài giảng lý thuyết thực hành, vật dụng cá nhân phải để đúng nơi quy định

5 Giữ trật tự, không làm ồn, hạn chế đi lại trong phòng thí nghiệm

6 Có tinh thần trách nhiệm bảo quản các trang thiết bị trong phòng Không di dời thiết bị, dụng cụ khi chưa được sự đồng ý của cán bộ phụ trách

7 Dọn dẹp gọn gàng rắc bẩn sau mỗi buổi thực hành trên bàn thí nghiệm và khu vực nhóm được phân công Xử lý chất thải, rác đúng nơi quy định

8 Mỗi sinh viên làm tiêu bản theo mẫu quy định và nộp sau mỗi buổi thực hành

Bài 1 & 2: KÍNH HIỂN VI

3.1 Kính hiển vi được cấu tạo bằng hai thấu kính hội tụ Mỗi hệ thống hoạt động

như một kính lúp Kính lúp quay về vật quan sát là vật kính Kính lúp để nhìn là thị kính

Các bộ phận của kính hiển vi:

9 Một gương hai mặt : lõm dùng khi quan sát ở vật kính10 – 40 – 60 và mặt phẳng dùng quan sát ở vật kính 100

3.2 Sử dụng và bảo quản

- Dùng giấy chuyên dùng lau nhẹ thị kính và vật kính, tránh làm xây xát mặt kính

- Tuyệt đối không tháo lắp thị kính và vật kính

- Để trục kính nghiêng 10 – 150 để quan sát mẫu, tránh nghiêng nhiều hơn làm chảy dung dịch nhuộm mẫu, vật kính và mẫu sẽ bị khô khó quan sát

Sử dụng:

• Quay vật kính nhỏ (X10, X4) sao cho trục vật kính nằm ngay với trục thị kính Mở hết chắn sáng và hướng mặt lõm của gương phản chiếu quay về phía nguồn sáng

• Để kính phía tay trái, mắt trái nhìn vào thị kính, mắt phải mở lớn, dùng tay di chuyển gương chiếu cho đến lúc đạt độ sáng tối đa trong ống kính

• Đặt mẫu vật lên bàn kính, vặn đinh ốc lớn hạ vật kính xuống cách mẫu vật 1cm Tiếp theo vặn đinh ốc lớn nâng từ từ ống kính lên cho đến khi nhìn thấy

ảnh, dùng đinh ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh hiện rõ Tuyệt đối không vặn

đinh ốc vi cấp khi đã kẹt Di chuyển bộ phận chắn sáng để nhìn mẫu một

cách rõ ràng nhất

• Muốn quan sát chi tiết một phần mẫu vật dùng vật kính lớn (X40) để quan sát Trước hết để ở vật kính X10, đưa phần muốn quan sát vào trung tâm thị

trường, dùng tay xoay từ từ thay vật kính lớn Chú ý không để vật kính chạm

vào mặt kính mang mẫu (thường khoảng cách là 1mm)

• Chỉ đặt 1 lamelle lên mẫu quan sát, mặt trên lamelle đậy phải luôn khô ráo

• Khi quan sát mẫu vật ở vật kính 100X, phải nhỏ 1 giọt dầu Cede lên mặt

trên tấm lamelle Xoay nhẹ nhàng để vật kính ngập trong giọt dầu cede

• Lau vật kính bằng giấy chuyên dùng sau khi sử dụng xong

Bài 3: XÁC ĐỊNH NHIỄM SẮC CHẤT GIỚI TÍNH

Cơ thể người có 23 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 22 cặp nhiễm sắc thể thường giống nhau ở cả 2 giới và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính là XX ở nữ và XY ở nam So với nhiễm sắc thể X thì nhiễm sắc thể Y rất nhỏ và chứa rất ít vật liệu di truyền, làm cho vật liệu di truyền của nhiễm sắc thể giới tính ở nữ gấp đôi nam

Hình 1 Các nhiễm sắc thể giới tính : ở nữ giới là XX, ở nam giới là XY và

Thể Barr tế bào niêm mạc miệng của người nữ

Để khắc phục hiện tượng mất cân bằng này, một trong 2 nhiễm sắc thể X của

cơ thể nữ giới bị bất hoạt, nghĩa là trong mỗi tế bào của cơ thể nữ giới chỉ có 1nhiễm sắc thể X hoạt hoá, nhiễm sắc thể X còn lại biến thành thể Barr nằm sát màng nhân

mà có thể quan sát được bằng kính hiển vi quang học Hiện tượng bất hoạt này được

Lyon mô tả lần đầu tiên năm 1961 nên còn được goi là hiện tượng lyonisation

Bảng 1 Sự liên hệ giới tính, số nhiễm sắc thể giới tính và số thể Barr hiện diện

Nam Nữ Số thể Barr hiện diện

Mở rộng quy luật trên người ta thấy rằng bệnh nhân nữ chỉ có 1 nhiễm sắc thể

X (XO: hội chứng Turner) thì nhiễm sắc thể này không bị bất hoạt Đối với các kiểu gen XXY (nam giới mắc hội chứng Klinefelter), XXXX, XXXY thì chỉ cũng chỉ có

1 nhiễm sắc thể X hoạt hoá, còn các nhiễm sắc thể X còn lại đều bị bất hoạt

Như vậy, cơ thể nữ giới mang cặp nhiễm sắc thể giới tính XX gồm 2 lại tế bào có kiểu gen khác nhau: một loại tế bào bộc lộ gen trên nhiễm sắc thể X của bố, một loại tế bào bộc lộ gen trên nhiễm sắc thể X của mẹ Có thể nói cơ thể nữ giới là

cơ thể khảm tự nhiên Nếu gen gây bệnh nằm trên 1 nhiễm sắc thể X (nghĩa là dị hợp tử) thì bệnh chỉ biểu hiện ở các tế bào mà nhiễm sắc thể X đó hoạt hoá, còn các

tế bào còn lại sẽ bình thường do chứa nhiễm sắc thể X hoạt hoá không mang gen

gây bệnh Điển hình trong nhóm này là bệnh nhiễm sắc tố dầm dề (Incontinentia Pigmenti)

3.2 Vật liệu – Hóa chất – Dụng cụ

• Kính hiển vi quang học vật kính X10, X40 và X100

• Lame và lamelle, kim mũi giáo, giấy thấm…

• Hóa chất: Fuschin, cồn tuyệt đối, cồn 70o, thuốc cố định, nước cất…

3.3 Phương pháp

* Chuẩn bị mẫu :

- Lấy que tăm nạo nhẹ một lớp tế bào bên trong má

- Phết trải nhẹ lên tấm lame sạch

- Cố định vết tế bào với 2 -3 giọt methanol 96% từ 15 đến 20 phút

- Hút methanol thừa và để khô mẫu ở nhiệt độ phòng

- Nhuộm với một giọt Fuschin từ 2 – 5 phút

- Rửa bằng alcohol 70, alcohol 90, alcohol tuyệt đối, ( 2 phút mỗi loại)

- Quan sát ớ 10X, 40X và 100X

3.4 Câu hỏi chuẩn bị

- Khác biệt giữa bộ NST nam và bộ NST nữ?

- Hình thái NST được quan sát rõ nhất ở giai đoạn nào trong chu trình phân bào? Tại sao? Nêu 1 số ứng dụng của việc xác định hình thái NST?

- Thể Barr là gì? Quan sát thể Barr ở giai đoạn nào trong chu trình phân bào? Tại sao? Ở các giai đoạn khác trong chu trình tế bào, thể Barr có hiện diện hay không? Tại sao thể Barr chỉ hiện diện ở cá thể cái mà không xuất hiện ở các cá thể đực?

- Cơ sở phân tử của việc hình thành thể Barr?

- Số lượng thể Barr có thể quan sát được trong tế bào người nam bình thường,

nữ bình thường, XYY, XO, XX, XXYY?

4 Báo cáo

- Vẽ hình ở 10X, 40X và 100X (nhân tế bào hình cầu có màng nhân rõ)

- Tìm và quan sát các nhân có chứa nhiễm sắc chất giới tính nằm sát mặt trong của màng nhân có hình dạng thay đổi

Hình 2 Thể Barr quan sát dưới kính hiển vi 100X

Bài 4: PHÂN BÀO NGUYÊN NHIỄM (MITOSIS)

1 Mục đích

Giúp sinh viên

• Biết cách chuẩn bị tiêu bản tạm thời để quan sát quá trình nguyên phân ở tế bào thực vật

• Quan sát các giai đoạn của quá trình nguyên phân qua sự biến đổi hình dáng nhiễm sắc thể

• Hiểu ý nghĩa di truyền của quá trình này

• So sánh thời gian phân chia các giai đoạn với nhau

• Xác định chỉ số Mitosis (MI) là xác định hoạt tính phân chia tế bào trong mô, tức là số lượng tế bào ở trạng thái phân chia

3 Nội dung

3.1 Nguyên tắc

Phân bào nguyên nhiễm là quá trình phân chia phức tạp xảy ra ở tế bào sinh

dưỡng nhất là vùng mô phân sinh, giúp cho sự tăng trưởng các mô trong tế bào sinh

vật Nhờ đó sinh vật hoàn tất sự sinh trưởng của mình đồng thời cũng là cơ sở của sinh sản vô tính Cơ chế của Mitosis là bộ nhiễm sắc thể ổn định từ thế hệ này sang

thế hệ khác

Một chu kì tế bào bắt đầu từ cuối lần phân bào trước đến cuối lần phân bào kế

tiếp Nó bao gồm 2 giai đoạn chính: Gian kỳ (Interphase) và giai đoạn phân chia

(Mitotic phase) Ở gian kỳ tế bào tăng trưởng và chuẩn bị cho giai đoạn phân bào, đặc biệt là sự tổng hợp DNA

Hình 3 Chu kỳ tế bào

Phân bào nguyên nhiễm trải qua 4 thời kỳ

a Tiền kỳ (Prophase): Trong nhân xuất hiện rãi rác các nhiễm sắc thể dạng sợi

mảnh và bắt đầu xoắn lại, màng nhân vẫn giữ nguyên Ở tế bào động vật trung thể phân chia và di chuyển về hai cực của tế bào Thoi vô sắc hình thành nối hai cực của

tế bào Cuối giai đoạn này nhìn thấy nhiễm sắc thể rõ gồm hai nhiễm sắc tử dính nhau ở tâm động Màng nhân và hạch nhân biến mất

b Biến kỳ (Metaphase): Nhiễm sắc thể tập trung giữa tế bào trên mặt phẳng xích

đạo vuông góc với thoi vô sắc Tâm động nhiễm sắc thể gắn vào tơ vô sắc Nhiễm sắc tử hướng về 2 cực của tế bào

c Tiến kỳ (Anaphase): Tâm động nhiễm sắc thể bắt đầu phân chia Nhiễm sắc

thể kép bắt đầu phân chia Nhiễm sắc tử trượt trên tơ vô sắc về 2 cực tế bào

d Chung kỳ (Telophase): Sự phân chia nhiễm sắc thể kết thúc Nhiễm sắc thể

tháo xoắn trở lại dạng mảnh Thoi vô sắc biến mất Màng nhân và hạch nhân hình thành Màng ngăn tế bào hình thành cùng với các thành phần khác của tế bào Ở

thực vật màng tế bào hình thành giữa mặt phẳng xích đạo sau đó kéo dài ra hai bên, còn ở động vật thì xuất hiện eo thắt từ hai phía tế bào đi vào trong

Hình 4 Các giai đoạn trong quá trình Mitosis ở tế bào thực vật

3.2.Vật liệu – Hóa chất – Dụng cụ

• Rễ hành (Allium sp) (2n = 16)

• Kính hiển vi quang học vật kính X10, X40 và X100

• Lame và lamelle, đĩa pétri, kim mũi giáo, kim mũi nhọn, lưỡi lam, giấy thấm…

• Hóa chất: Thuốc nhuộm Aceto carmin, thuốc nhuộm Schiff, cồn tuyệt đối, cồn 70o, thuốc cố định Carnoy, HCl N, nước cất…

3.3.Phương pháp

* Phương pháp cố định mẫu:

• Củ hành rửa sạch và cắt hết rễ, giâm vào cát ẩm hay tro trấu tưới ẩm 36-48 giờ đến khi có rễ dài khoảng 0,5-1cm

• Cắt rễ ngâm trong dung dịch Carnoy (3 cồn tuyệt đối: 1 acetic acid) khoảng

24 giờ Sau đó rửa rễ bằng cồn 90o 2 lần, 10 phút/lần và giữ mẫu trong cồn

70o

* Làm tiêu bản tạm thời

− Rửa rễ bằng nước

- Cắt 1-3 chóp rễ dài khoảng 2mm đặt lên đĩa pétri

- Nhỏ 1-2 giọt HCl 1N vào mẫu trong 10 phút Sau đó rửa lại nhiều lần bằng nước cất

- Nhỏ một giọt aceto carmin nhuộm trong 2- 5 phút Có thể hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn Cẩn thận không làm khô mẫu Khi mẫu chuyển màu đỏ sậm đặt lamelle, ép nhẹ mẫu cho phân tán đều bằng cách dùng đầu que diêm ấn nhẹ nhàng từ 40 – 50 lần

- Lấy giấy thấm thuốc nhuộm thừa quanh lamelle

- Quan sát mẫu ở vật kính 10X và 40X

- Vẽ hình các giai đoạn

* Interphase: + Hình thái, kích thước tổng quát của nhân

+ Màng nhân + Số lượng, kích thước và vị trí hạch nhân

* Prophase: + Nhiễm sắc thể là những chấm sậm

+ Nhiễm sắc thể co ngắn tạo thành sợi rõ rệt + Màng nhân, hạch nhân, thoi vô nhiễm

* Metaphase: + Trục thoi vô nhiễm

+ Vị trí nhiễm sắc thể trên thoi vô nhiễm

+ Hình thái nhiễm sắc thể

* Anaphase: + Sợi vô nhiễm còn trên nhiễm sắc thể con

+ Thoi vô nhiễm biến mất dần

* Telophase: + Các nhiễm sắc thể tập hợp ở 2 cực

+ Thành lập màng nhân, hạch nhân

* Quan sát tiến trình phân bào

- Đặt tiêu bản lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính 10X

- Xác định vùng mô phân sinh là nơi có sự phân bào mạnh nhất, quan sát rõ các tế bào, tìm đủ các giai đoạn

- Chuyển sang quan sát ở vật kính 40X

- Đếm tất cả các tế bào có trong thị trường, ghi nhận số tế bào của từng giai đoạn

- Thực hành lần lượt trên 3 tiêu bản Ghi nhận kết quả

Các giai đoạn Tiêu bản Tổng số

- Ghi số tế bào ở trạng thái phân chia

- Ghi số tế bào trong thị trường quan sát được

- Lặp lại 3 lần

- Quy ra phần nghìn tỷ số trung bình 3 lần giữa tế bào phân chia trên tổng số tế bào quan sát được

3.4 Câu hỏi chuẩn bị

- Chu trình tế bào gồm có các giai đoạn nào?

- Nguyên phân là gì? Vai trò của nguyên phân trong quá trình sống?

- Nguyên phân có mấy giai đoạn? Nêu đặc điểm của từng giai đoạn?

- Thoi vô sắc có vai trò gì trong quá trình phân bào?

- Chỉ số Mitosis là gì? Công thức tính chỉ số Mitosis

4 Kết quả đạt được

- Tiêu bản và hình vẽ các giai đoạn của quá trình nguyên phân

- Kết quả số tế bào phân chia ở các giai đoạn, Chỉ số MI

Hình 6 Các giai đoạn trong quá trình Mitosis

BÀI 5: PHÂN BÀO GIẢM NHIỄM (MEIOSIS)

1 Mục đích

Giúp sinh viên

• Biết cách chuẩn bị tiêu bản tạm thời để quan sát quá trình giảm phân ở tế bào thực vật

• Quan sát các giai đoạn của quá trình giảm phân qua sự biến đổi hình dáng nhiễm sắc thể

• Hiểu ý nghĩa di truyền học của quá trình này

• Phân biệt sự khác nhau cơ bản giữa phân bào nguyên nhiễm và phân bào giảm nhiễm

nó Quá trình phân bào giảm nhiễm gồm hai lần phân chia liên tiếp gồm Giảm nhiễm 1 và Giảm nhiễm 2 Mỗi giai đoạn meiosis được xác định dựa vào sự xuất hiện và định hướng các nhiễm sắc thể

GIẢM NHIỄM 1:

• Tiền kì 1: có thể chia ra 5 kì nhỏ

- Mành ty (Leptotene): nhiễm sắc thể xuất hiện dạng mảnh và bắt đầu xoắn

Màng nhân và hạch nhân chưa tiêu biến

- Hiệp ty (Zygotene): Nhiễm sắc thể tiếp tục xoắn Các nhiễm sắc thể tương đồng bắt cặp và tiếp hợp (synapsis) từ một đầu nhiễm sắc thể tạo thành thể lưỡng trị (bivalent)

- Hậu ty (Pachytene) : Nhiễm sắc thể tiếp tục xoắn dày lên Thể lưỡng trị gồm

4 nhiễm sắc tử Có hiện tượng trao đổi chéo (crossing over) giữa các nhiễm

sắc tử tương đồng

- Song ty (Diplotene): Nhiễm sắc thể trong các cặp tương đồng bắt đầu tách ra

từ vùng tâm động

- Xuyên động (Diakinesis): Nhiễm sắc thể xoắn cực đại Màng nhân và hạch

nhân biến mất Thoi vô sắc hình thành

• Biến kỳ 1: Các nhiễm sắc thể sắp xếp trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc

• Tiến kỳ 1: Các nhiễm sắc thể tách ra và tiến về 2 cực của tế bào Do vậy trong tế bào con số nhiễm sắc thể giảm một nửa so với tế bào mẹ

• Chung kỳ 1 : Các nhiễm sắc thể tập trung ở cực tế bào và thoi vô nhiễm biến mất Có sự hình thành nhân và màng tế bào tạo 2 tế bào con tuy không rõ

GIẢM NHIỄM 2:

• Tiền kỳ 2: Mành nhân và hạch nhân biến mất Thoi vô sắc xuất hiện

• Biến kỳ 2: Các nhiễm sắc thể kép tập trung trên mặt phẳng xích đạo vuông góc với mặt phẳng xích đạo lần phân chia trước

• Tiến kỳ 2: Tâm động phân chia, các nhiễm sắc tử tách nhau trượt về hai cực của

tế bào

• Chung kỳ 2: Nhiễm sắc thể tháo xoắn, màng nhân và hạch nhân xuất hiện Màng

tế bào hình thành, mỗi tế bào con ở giảm nhiễm 1 tách thành 2 tế bào con

Kết quả của phân bào giảm nhiễm từ tế bào mẹ (2n) tạo 4 tế bào con (n) Có ý nghĩa quan trọng trong sinh sản hữu tính, chọn lọc và tiến hóa

Hình 7 Các giai đoạn trong quá trình giảm phân

3.2.Vật liệu – Hóa chất – Dụng cụ

- Túi phấn hoa ở giai đoạn khảo sát

- Kính hiển vi quang học vật kính X10 và X40

- Lame và lamelle

- Đĩa pétri, kim mũi giáo, kim mũi nhọn, lưỡi lam, giấy thấm…

• Hóa chất: Thuốc nhuộm Aceto carmin, thuốc nhuộm Schiff, cồn tuyệt đối, cồn 70o, thuốc cố định Carnoy, HCl 5N, dầu Cede, nước cất…

3.3 Phương pháp

- Chọn 1 số bao phấn hoa non Ở cây hòa thảo thì lấy những nụ trước nở hoa

5-7 ngày, bắp khoảng 4-8 ngày, hành và hẹ lúc vừa có nụ

- Tách rời bao hoa, lá đài, cánh hoa

- Rửa sạch ngâm trong dung dịch Carnoy từ 2-12h

- Rửa bằng cồn 900 2 lần, mỗi lần 10 phút

- Giữ trong cồn 70o

* Làm tiêu bản tạm thời:

- Khi quan sát lấy một số bao phấn thấm sạch cồn đặt lên lame

- Rửa mẫu bằng nước cất nhiều lần

- Ngâm trong HCl 1N trong 15 phút

- Rửa bằng nước cất

- Nhỏ 1 giọt Schiff hòa lẫn Aceto carmin trong 15 phút Có thể hơ nhẹ trên đèn

cồn không để sôi, không để khô mẫu

- Dùng mũi kim mũi giáo làm vỡ bao phấn

- Đậy lamelle, dùng đầu que diêm ấn nhẹ nhàng khoảng 40 -50 lần và quan sát

ở vật kính 10X và 40X

3.4 Câu hỏi chuẩn bị

- Giảm phân là gì? Các giai đoạn của giảm phân?

- Đặc điểm của NST trong các giai đoạn giảm phân ?

- Sự khác biệt của giảm phân ở cây song tử diệp và cây đơn tử diệp?

- Các bước làm tiêu bản để quan sát quá trình phân bào?

4 Kết quả đạt được

Tiêu bản và hình vẽ và chú thích các giai đoạn trong tiến trình phân chia