Góp phần nâng cao hiệu quả bài thực hành phân bào nguyên phân trong chương trình thực hành di truyền học đại cương tại khoa sinh học trường đại học vinh

Thực hành tốt bài này sinh viên sẽ quan sát đ-ợc rất rõ các kỳ nguyên phân, hiểu đ-ợc cơ chế của quá trình nguyên phân và bản thân có thể làm thí nghiệm nghiên cứu đối với các đối t-ợng

“Phân bào nguyên phân” là một trong những bài thực hành quan trọng trong ch-ơng trình thực hành di truyền học đại c-ơng tại khoa sinh học -Tr-ờng Đại học Vinh Thực hành tốt bài này sinh viên sẽ quan sát đ-ợc rất rõ các kỳ nguyên phân, hiểu đ-ợc cơ chế của quá trình nguyên phân và bản thân

có thể làm thí nghiệm nghiên cứu đối với các đối t-ợng khác

Tuy nhiên hiệu quả của bài thực hành này th-ờng ch-a cao, nguyên nhân có thể do dụng cụ, thiết bị, hoặc hoá chất ch-a đáp ứng đ-ợc yêu cầu của bài thực hành; kỹ năng làm tiêu bản và khả năng sử dụng kính hiển vi của sinh viên ch-a tốt; mẫu vật ch-a đạt tiêu chuẩn; thời gian thực hành hạn hẹp…

Hiện nay, “phân bào nguyên phân” cũng là một bài thực hành bắt buộc trong ch-ơng trình Sinh học phổ thông Vì vậy, việc nâng cao hiệu quả thực hành bài này là một việc làm cấp thiết, nhất là đối với sinh viên ngành cử nhân s- phạm

Với mong muốn hiệu quả của các bài thực hành ngày càng cao, nhằm

nâng cao chất l-ợng giáo dục và đào tạo, chúng tôi đã chọn đề tài “Góp phần nâng cao hiệu quả bài thực hành “Phân bào nguyên phân“ trong ch-ơng

trình thực hành Di truyền học đại c-ơng tại khoa Sinh học - Tr-ờng Đại học Vinh“

2 Mục đích của đề tài

Đề tài thực hiện nhằm mục đích góp phần nâng cao hiệu quả bài thực hành “phân bào nguyên phân” trong ch-ơng trình thực hành di truyền học đại c-ơng tại khoa sinh học - Tr-ờng đại học Vinh

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu các ph-ơng pháp nhằm rút ngắn thời gian nhuộm màu

nhiễm sắc thể, cho kết quả quan sát các kỳ nguyên phân rõ nhất

- Xác định hoạt tính nguyên phân tại các thời điểm

- Thử nghiệm sử dụng các ph-ơng pháp xử lý tiền cố định cho phép quan sát quá trình phân bào rõ và chính xác hơn

4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Ch-ơng 1 Tổng quan tài liệu 1.1 Nhiễm sắc thể

Nhiễm sắc thể là những cấu trúc hiển vi nằm trong nhân tế bào có khả năng tự nhân đôi, bắt màu và giữ đ-ợc màu bazơ, nhìn thấy đ-ợc qua kính hiển vi th-ờng trong quá trình tế bào phân chia, bao gồm ADN và các phân tử khác nằm trong một tổ chức phức tạp, chứa các gen của cá thể sinh vật [6]

Ngày nay các ph-ơng pháp nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể và phân tích tế bào học các tổ hợp nhiễm sắc thể đã cho phép xác định rằng nhiễm sắc thể mang tính chất đặc tr-ng cho từng loài sinh vật, về mặt số l-ợng, cấu trúc, hình thái Đây là kết quả của quá trình tiến hoá lâu đời của từng loài [6]

Tất cả các tế bào của một loài nói chung có số l-ợng nhiễm sắc thể cố

định, đặc tr-ng cho loài đó, ví dụ: Tế bào l-ỡng bội ở Ruồi giấm có 8 nhiễm sắc thể, tế bào l-ỡng bội ở Ngô có 20 nhiễm sắc thể, tế bào l-ỡng bội ở Ng-ời

có 46 nhiễm sắc thể, và đặc tr-ng cho bộ nhiễm sắc thể, số l-ợng 2n nhiễm sắc thể trong tế bào xôma đ-ợc gọi là l-ỡng bội, mỗi nhiễm sắc thể có một cặp giống nhau về hình thái và kích th-ớc đ-ợc gọi là nhiễm sắc thể t-ơng

đồng hay đồng đẳng (homologous); số l-ợng n nhiễm sắc thể trong tế bào sinh dục đ-ợc gọi là đơn bội, mỗi nhiễm sắc thể chỉ có một chiếc; bộ nhiễm sắc thể

là đa bội, số l-ợng nhiễm sắc thể lớn hơn 2n

Hình thái nhiễm sắc thể đặc tr-ng cho từng loài và mỗi nhiễm sắc thể cũng có hình dạng đặc tr-ng rõ nhất ở kỳ giữa (metaphase) của nguyên phân khi nhiễm sắc thể co ngắn, mập ra và phân bố trên mặt phẳng xích đạo Tâm

động (centrome) là điểm thắt eo chia nhiễm sắc thể thành 2 vai với chiều dài khác nhau Theo quy -ớc chung vai ngắn hơn đ-ợc gọi là vai p và vai q dài hơn Dựa vào vị trí tâm động, có thể phân biệt hình thái các nhiễm sắc thể: Tâm giữa (metacentric) khi 2 vai bằng nhau, tâm đầu (acrocentric) khi 2 vai không bằng nhau, và tâm mút (telocentric) khi tâm động nằm gần cuối.Trên nhiễm sắc thể có thể thấy các vệt đậm hơn, gọi là chromomere (vệt nhiễm sắc) [9]

Một số nhiễm sắc thể ở đầu tận cùng có mang thể kèm, là một phần của nhiễm sắc thể ở dạng tròn, có kích th-ớc bằng hoặc bé hơn đ-ờng kính nhiễm sắc thể Thể kèm đ-ợc nối với nhiễm sắc thể bởi eo thứ cấp, ví dụ: ở ng-ời có

5 nhiễm sắc thể mang thể kèm và eo thứ cấp đó là nhiễm sắc thể số 13, 14, 15,

21, 22

Mỗi loài đ-ợc đặc tr-ng bởi kiểu nhân (karyotype) riêng Kiểu nhân là một khái niệm đồng nghĩa một phần bộ nhiễm sắc thể nh-ng trong kiểu nhân ngoài số l-ợng còn có cả hình dạng, kích th-ớc của nhiễm sắc thể Hình vẽ hay hình chụp bộ nhiễm sắc thể sắp xếp lại theo thứ tự từng cặp hay từng chiếc, đã đuợc duỗi thẳng, xếp thứ tự từ dài đến ngắn đ-ợc gọi là sơ đồ nhiễm sắc thể (idiogram) Nhân đồ (karyogram) là ảnh hay hình vẽ biểu hiện bộ nhiễm sắc thể theo số l-ợng, kích th-ớc và hình dạng [6]

Bằng các kỹ thuật tế bào học hiện đại, căn cứ các mặt chức năng, cấu trúc, hình thái và đặc thù trong hoạt động ng-ời ta đã phân biệt các loại nhiễm sắc thể nh- sau:

- Nhiễm sắc thể th-ờng, tức nhiễm sắc thể A (Autosome) giống nhau ở 2 giới đực, cái

- Nhiễm sắc thể giới tính (sex chromosome) khác nhau giữa giống đực

và giống cái

- Nhiễm sắc thể B còn gọi là nhiễm sắc thể bổ sung hoặc nhiễm sắc thể phụ đ-ợc phát hiện ở môt số loài thực vật nh- Ngô, Mạch đen, ngoài số nhiễm sắc thể A bình th-ờng Những loài có nhiễm sắc thể B thì yếu hơn và kém hữu thụ hơn các cây khác

- Ngoài ra trong một số tổ chức, cơ quan ở một số loài, có dạng nhiễm sắc thể đặc biệt nh-: Nhiễm sắc thể khổng lồ (polytene chromosome) và nhiễm sắc thể chổi bóng đèn (lam.brush chromosome) [6]

Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể: ở prokaryota nhiễm sắc thể là phân

tử ADN trần, mạch kép, vòng, nó tập chung ở một vùng nhất định gọi là vùng nhân ch-a có màng ngăn cách với tế bào chất ở eukaryota nhiễm sắc thể là

hợp phần giữa ADN và prôtêin, ADN đ-ợc cuộn xoắn, co ngắn lại ít nhất trên

100 lần, có nhiều mức độ cuộn vòng, co xoắn khác nhau:

Sợi cơ bản có đ-ờng kính khoảng 100 A0, sợi này giống nh- chuỗi hạt c-ờm, mỗi hạt c-ờm là một nuclêôxôm Nếu gỡ rối hoàn toàn ta thấy trong mỗi nuclêôxôm gồm lõi là 8 phân tử prôtêin histon gồm 2 phân tử H3, 2 phân

tử H4 liên kết ở vùng trung tâm và 2 phân tử H2A, 2 phân tử H2B liên kết phía ngoài, đ-ợc quấn quanh bởi 1

4

3 vòng sợi ADN có chiều dài là 140 cặp nuclêotit, giữa các nuclêôxôm đ-ợc nối với nhau bằng đoạn ADN nối dài khoảng 15 - 100 cặp nuclêôtit

Sợi cơ bản đ-ợc xoắn một mức nữa là xoắn bậc 2 tạo nên sợi nhiễm sắc

có đ-ờng kính 250 A0 B-ớc cuộn xoắn này có liên quan đến loại prôtêin histon H1, có vai trò đặc biệt quan trọng tạo ra sự bền vững trong liên kết giữa các nuclêôxôm để hình thành nên cuộn xoắn bậc 2, còn đ-ợc gọi là sợi solenoit

Trong nhiễm sắc thể ở kỳ trung gian, sợi solenoit đ-ợc cuộn xoắn lần nữa tạo nên một ống rỗng đ-ờng kính khoảng 2000 A0 Cuối cùng là một lần cuộn xoắn tiếp của ống 2000 A0 thành cuộn xoắn lớn hơn có đ-ờng kính 6000

A0, đây là các chrômatit ở kỳ giữa

Đặc thù trong hoạt động của nhiễm sắc thể là có những vùng đồng nhiễm sắc có khả năng tháo xoắn và đóng xoắn bình th-ờng, mang các gen biểu hiện chức năng phiên mã, tái bản bình th-ờng, nhuộm màu nhạt và chậm Còn vùng dị nhiễm sắc thì có cấu trúc siêu xoắn và ổn định nên nó mang các gen ít biểu hiện về mặt chức năng, ADN không đ-ợc phiên mã còn quá trình tái bản diễn ra muộn, bao gồm: Dị nhiễm sắc không ổn định tức là có thể chuyển thành đồng nhiễm sắc ở những thời điểm nhất định và dị nhiễm sắc ổn

định không thể chuyển thành đồng nhiễm sắc [6]

Nhiễm sắc thể đảm bảo chức năng di truyền quan trọng, là cơ quan trong nhân mang ADN chứa thông tin di truyền đặc tr-ng của loài Nhiễm sắc thể phải có tổ chức, một kiểu sắp xếp đặc biệt mới tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của ADN chứa trong đó, đảm bảo cho quá trình tái bản ADN và

phân phối các bản sao ADN về các tế bào con đ-ợc hình thành qua nguyên

phân và giảm phân ở các quá trình này nhiễm sắc thể có những thay đổi về

hình thái rõ rệt, có thể quan sát đ-ợc thông qua tiêu bản tạm thời hay cố định

1.2 Đặc điểm của phân bào nguyên phân

Nguyên phân là cơ chế duy trì số l-ợng nhiễm sắc thể trong tế bào

xôma, có nghĩa là từ một tế bào mẹ ban đầu qua một lần nguyên phân tạo ra 2

tế bào con, mỗi tế bào con mang bộ nhiễm sắc thể 2n giống tế bào mẹ [7]

Sự phân bào là nguyên phân hay giảm phân, đều dẫn đến hàng loạt quá

trình có trật tự về thời gian và không gian cuối cùng cho một kết quả nhất định

và có thể dự đoán tr-ớc đ-ợc Nguyên phân cho 2 tế bào con giống nh- nhau

về mặt di truyền nhờ đó tính liên tục di truyền (về số l-ợng cũng nh- chất

l-ợng) đ-ợc duy trì, nói cách khác là các tế bào con đ-ợc hình thành trong quá

trình này có cấu trúc di truyền y nh- ở tế bào mẹ mà từ đó chúng phát sinh, và

vì vậy chúng là những bản sao di truyền [11]

Nguyên phân là một quá trình hết sức chính xác, hầu nh- không sinh ra

biến dị trong điều kiện bình th-ờng và sự chính xác này đã đ-ợc định đoạt ở

mức độ phân tử, đặc tr-ng bởi quá trình tự tái bản ADN Vì vậy mà kết quả di

truyền của sự phân chia các tế bào xôma hay nguyên phân là một sự bảo tồn

“cứng nhắc” kiểu gen ban đầu [11]

Xét theo nghĩa chặt chẽ của từ nguyên phân (mitosis) là sự phân chia

nhân thành 2 nhân con, còn tế bào chất là sự phân chia tế bào chất với sự hình

thành 2 tế bào con Sự nguyên phân là một quá trình liên tục, mỗi giai đoạn

của nó chuyển dần sang giai đoạn kế tiếp sau nh-ng để tiện mô tả các nhà sinh

học phân chia một cách nhân tạo sự phân bào ra làm bốn giai đoạn: kỳ đầu, kỳ

giữa, kỳ sau, và kỳ cuối Giữa 2 lần phân bào nguyên phân nhân ở vào giai

đoạn “yên nghỉ”, giai đoạn chuẩn bị (kỳ trung gian) nhưng sự “yên nghỉ” này

chỉ là nhân không phân chia, còn hoạt tính trao đổi chất của nó trong thời kỳ

đó lại có thể rất cao Nguyên phân là một quá trình hoạt động cực kỳ phức tạp

không có sự mô tả nào, không có sơ đồ nào, thậm chí không có tiêu bản nào

của tế bào đang phân chia mà cho chúng ta hình dung đ-ợc nó hoạt động phức

tạp đến mức nh- thế nào Phim ảnh quay chụp chậm của sự nguyên phân cho thấy rõ hoạt tính rất cao của quá trình đó [1]

Quá trình nguyên phân diễn ra mạnh mẽ ở các đỉnh sinh tr-ởng, nh-

1.3 ý nghĩa của nguyên phân

Là một trong những quá trình sinh học quan trọng nhất của tế bào, vì nó

là cơ chế sinh sản tạo ra các tế bào con có bộ nhiễm sắc thể hoàn toàn giống nhau và giống tế bào mẹ (về số l-ợng và chất l-ợng) Kết quả là mỗi tế bào có

đủ toàn bộ thông tin di truyền cần thiết cho sự phát sinh của tất cả các tính trạng của cơ thể Điều này làm cho chúng ta hiểu tại sao từ một tế bào lấy từ cây tr-ởng thành có thể phân hóa và phát triển thành vô vàn cây con hệt cây gốc trong nuôi cấy mô thực vật

Đối với các sinh vật nhân thực đơn bào, nguyên phân là cơ chế sinh sản,

từ một tế bào mẹ qua nguyên phân tạo ra 2 tế bào con giống y hệt nhau

Đối với các cơ thể sinh vật nhân thực đa bào, nguyên phân làm tăng số l-ợng tế bào giúp cơ thể sinh tr-ởng và phát triển Ngoài ra nguyên phân cũng

đóng vai trò quan trọng giúp cơ thể tái sinh những mô hoặc các cơ quan bị tổn th-ơng, ví dụ: Sự tái sinh vỏ ở củ khoai tây bị tổn th-ơng, tái sinh đuôi bị đứt

1.4 Chu kỳ tế bào và quá trình nguyên phân

Các tế bào của sinh vật eukaryota trải qua nhiều giai đoạn nối tiếp nhau

và kết thúc bằng sự phân chia tạo ra tế bào mới Toàn bộ quá trình từ lúc tế bào đ-ợc tạo thành do phân bào của tế bào mẹ đến khi nó phân chia tạo ra tế bào mới gọi là chu kỳ tế bào gồm 4 giai đoạn M, G1, S, G2 Sự phân chia tế bào chỉ chiếm một phần của chu trình đó [9]

Ng-ời ta có thể nghiên cứu phân bào nguyên phân khi quan sát chu kỳ sống của tế bào mô phân sinh, các tế bào nh- thể đều trải qua các giai đoạn:

Kỳ trung gian (interphase), kỳ đầu (prophase), kỳ giữa (metaphase), kỳ sau (anaphase), kỳ cuối (telophase)

Tr-ớc khi xảy ra quá trình phân chia trong tế bào đã xảy ra quá trình sinh hóa phức tạp và kéo dài Trong kỳ trung gian đã diễn ra các quá trình hết sức quan trọng: Sự phân phối của các ADN, sự tích lũy chất cho việc hình thành thể thoi phân bào và sự sinh sản của thể trung tâm

Kỳ trung gian cũng là thời kỳ dài nhất của chu trình tế bào trong đó ng-ời ta chia thành 3 pha

Gap1 (G 1 ): Thời gian kéo dài từ ngay sau khi tế bào đ-ợc hình thành

sau phân bào đến lúc bắt đầu pha S.Thời gian G1 phụ thuộc vào chức năng sinh lý của tế bào, ví dụ: ở tế bào phôi G1 là 1giờ, ở tế bào gan của động vật

có vú là 1 năm, ở tế bào nơron có thể kéo dài suốt đời sống cá thể

Đây là thời kỳ tr-ớc tổng hợp, trong tế bào diễn ra quá trình tăng tr-ởng, chuẩn bị phân đổi ADN ở pha này nhiễm sắc thể ở dạng sợi mảnh bị xoắn vặn

Cuối pha G1 có một thời điểm gọi là điểm hạn định R nếu tế bào v-ợt qua thì nó sẽ đi vào pha S nếu không nó sẽ đi vào pha G0 (pha biệt hoá)

Pha S: Thời kỳ tổng hợp, cuối pha G1 tế bào tổng hợp một loại prôtêin cyclinA sẽ kết hợp với enzim kynaza xúc tiến tổng hợp ADN Trong giai đoạn này những sai lệch về tái bải ADN đ-ợc sửa chữa

Thời gian kéo dài của pha S th-ờng ổn định từ 6-8giờ

Gap2 (G 2 ): Thời kỳ sau tổng hợp diễn ra quá trình liên quan đến sự

hình thành thoi tơ vô sắc và tích lũy năng l-ợng cho quá trình nguyên phân, và

đặc biệt tổng hợp prôtêin tubulin (thành phần cấu tạo tơ vô sắc) Nhiễm sắc thể bắt đầu đóng xoắn, thoi tơ vô sắc không bắt màu, các tế bào phải trải qua

G2 mới thực hiện quá trình nguyên phân [7]

Các giai đoạn phân chia tế bào (M - Mitosis)

Kỳ đầu - tiền kỳ (prophase): Đây là giai đoạn đầu tiên của quá trình

phân chia nguyên phân Giai đoạn này gồm có tiền kỳ sớm và tiền kỳ muộn

Tiền kỳ sớm, nhân tế bào có hình dạng nh- ở kỳ trung gian, nh-ng bắt

đầu xuất hiện những sợi của chất nhiễm sắc và phân bố khắp nhân

Tiền kỳ muộn, các sợi của chất nhiễm sắc thể có thể thấy rõ, mỗi nhiễm sắc thể gồm 2 nhiễm sắc tử (chromatit) xoắn với nhau và gắn liền bằng tâm

động (centrome)

Vào cuối tiền kỳ xảy ra sự gián đoạn của màng nhân và sự tiêu biến của nhân con, bộ máy phân chia nhân bắt đầu hình thành

Kỳ giữa - trung kỳ (metaphase) ở giai đoạn này nhiễm sắc thể tập

trung ở mặt phẳng xích đạo của tế bào Tâm động của mỗi nhiễm sắc thể nối liền 2 nhiễm sắc tử nằm giữa tế bào, các vai của nhiễm sắc thể căng ra nhờ thoi vô sắc ở pha này nhiễm sắc co xoắn cực đại, có thể thấy rõ hình dạng và

số l-ợng nhiễm sắc thể của tế bào

Thoi và sắc đ-ợc hình thành từ những sợi prôtêin ở trạng thái gen, kéo dài từ đầu này đến đầu kia của khoang tế bào chúng gồm 2 loại: một loại nối liền 2 cực của tế bào, một loại dính liền với centrome của nhiễm sắc thể

Kỳ sau - hậu kỳ (anaphase) Giai đoạn này bắt đầu bằng sự phân chia

của tâm động, xảy ra đồng thời ở tất cả các nhiễm sắc thể Ngay sau khi tâm

động phân chia, các nhiễm sắc tử tách nhau ra và đi về hai cực đối lập của tế bào, lúc này ta gọi chúng là những nhiễm sắc thể chị em, chúng đồng thời và nhanh chóng di động về hai cực nếu các nhiễm sắc thể vì một lý do nào đó

mà bị mất tâm động thì chúng không thể di động về các cực đ-ợc Sự vận

động của nhiễm sắc thể ở hậu kỳ liên quan t-ơng hỗ đến hai quá trình khác

nhau, đồng thời xảy ra là sự co ngắn của các sợi tơ vô sắc gắn nhiễm sắc thể với 2 cực tế bào và sự giãn ra của các sợi tơ vô sắc nối liền hai cực tế bào

Kỳ cuối - mạt kỳ (telophase): Giai đoạn này bắt đầu bằng sự kết thúc

di chuyển của nhiễm sắc thể Trong tế bào có sự cấu trúc trở lại, các nhiễm sắc thể con mất trạng thái xoắn và đơn độc

Nhân đ-ợc hình thành và có màng bao quanh Nhân con đ-ợc phục hồi với số l-ợng nh- ở tế bào mẹ

Quá trình hình thành 2 tế bào con nhờ ở mặt phẳng xích đạo hình thành nên giới hạn ngăn cách giữa 2 tế bào con Sự phân bào ở tế bào động vật và thực vầt diễn ra theo hai cách khác nhau ở tế bào động vật, quá trình phân bào bắt đầu bằng sự hình thành rãnh phân cách trên bề mặt tế bào thắt dần từ ngoài vào trong đ-ợc gọi là phân cắt ở tế bào thực vật, do đ-ợc bao bọc bởi màng cứng xenlulo phía ngoài nên quá trình có nhiều khác biệt: Tr-ớc tiên các túi màng đơn đ-ợc tách ra từ thể golgi mang nguyên liệu tạo vách tập hợp lại giữa tế bào mẹ, tiếp theo các túi này dính liền tạo nên các đĩa có màng bao quanh đ-ợc gọi là bản tế bào, bản tế bào lớn lên, tích lũy nguyên liệu ngày càng nhiều tạo nên vách tế bào

Ta có thể quan sát đ-ợc rất rõ ràng từng kỳ trên tiêu bản tạm thời hay

cố định nhờ biểu hiện đặc tr-ng của nhiễm sắc thể

1.5 Thời gian phân bào của các kỳ phân bào nguyên phân, hoạt tính phân chia

Có thể quan sát thời gian của các thời kỳ phân bào nguyên phân bằng cách quan sát các trạng thái sống

Thời gian của một chu kỳ sống tế bào, của các kỳ phân bào nguyên phân khác nhau ở các loài, các mô khác nhau và giữa các kỳ cũng khác nhau nh-:

Thời gian diễn ra mỗi thời kỳ của quá trình nguyên phân ở tế bào nội nhũ đậu Hà Lan ng-ời ta xác định đ-ợc nh- sau:

- Kỳ đầu kéo dài 40 phút

- Kỳ giữa kéo dài 20 phút

- Kỳ sau kéo dài 12 phút

- Kỳ cuối kéo dài 110 phút

Nh- vậy kỳ đầu và kỳ cuối là kéo dài nhất Tất cả các kỳ phân bào nguyên phân kéo dài khoảng 3giờ Thời gian của chu trình sống tế bào thì dài hơn vài lần ở đậu Răng Ngựa, toàn bộ chu kỳ kéo dài 30giờ, trong đó phân bào nguyên phân là 4giờ, thời kỳ trung gian là 26giờ (G1 - 22giờ, S - 6giờ, G2 - 8giờ) Chu kỳ phân bào nguyên phân ngắn nhất trong 1 tế bào kéo dài 8giờ, còn phần lớn là 10-12giờ Nhiệt độ tăng thì tốc độ phân bào nguyên phân tăng [5]

Th-ờng thì kỳ trung gian bao giờ cũng chiếm thời gian lớn nhất, ở tế bào gan là 6 tháng, ở những tế bào đã chuyển hóa thì kỳ trung gian chiếm thời gian là cả chu kỳ tế bào cho đến khi tế bào chết mà không phân chia nh- tế bào nơron thần kinh

Mỗi một mô, có một mức độ hoạt động phân bào nguyên phân nhất

định Thay đổi nhịp độ ấy thể hiện tính nhịp điệu khá rõ rệt Tính chu kỳ ngày

đêm và chu kỳ mùa của số phân bào nguyên phân biểu hiện khá rõ Trong thực nghiệm, ng-ời ta th-ờng tính số l-ợng phân bào nguyên phân cực đại quan sát đ-ợc trong một ngày đêm, ở một mô nghiên cứu ở một số loài thực vật, cực đại của phân bào nguyên phân là vào ban đêm còn cực tiểu là ban ngày Những công trình nghiên cứu trên Mạch đen, trong điều kiện tự nhiên

đã cho thấy số l-ợng phân bào nguyên phân cực đại lúc 18giờ và cực tiểu lúc 6giờ sáng, ng-ời ta cũng thấy thời gian số l-ợng phân bào nguyên phân cực

đại và cực tiểu ở mô phân sinh đầu rễ và đầu ngọn cùng thời gian [5]

1.6 Hoạt tính của phân bào nguyên phân và chỉ số của phân bào nguyên phân

Trong nghiên cứu sự phân chia tế bào th-ờng ta phải xác định hoạt tính phân chia của nó trong mô, tức số l-ợng t-ơng đối của các tế bào ở trạng thái phân chia

T-ơng quan của số tế bào đang phân chia với tổng số tế bào trong mô

có thể biểu thị thành phần nghìn, d-ới dạng chỉ số gọi là chỉ số phân bào

nguyên phân (chỉ số mitose), là tỷ lệ của số tế bào có phân chia nguyên phân

so với tổng số tế bào có trong mô nghiên cứu Chỉ số mitose có thể đ-ợc xác

định theo 2 cách

Cách 1: Trên tiêu bản cố định, đếm số l-ợng tế bào ở trạng thái phân

chia trong thị tr-ờng quan sát đ-ợc Qua hình, vẽ đ-ờng viền vùng mô quan sát trên giấy kẻ ly, cắt phần giấy có hình vẽ và cân mảnh giấy này, khi biết trọng l-ợng 1cm2 giấy có thể xác định đ-ợc diện tích phần mô đã nghiên cứu Chỉ số mitose ở đây là l-ợng tế bào ở trạng thái phân chia trên một đơn vị diện tích mô

Cách 2: ở đây chỉ số mitose biểu diễn bằng số l-ợng tế bào ở trạng

thái phân chia trên 1000 tế bào của mô Muốn vậy, trên tiêu bản cố định ta

đếm số tế bào ở trạng thái phân chia, tính số l-ợng tế bào trong thị tr-ờng quan sát đ-ợc d-ới kính hiển vi, lặp lại 3 lần nh- vậy sau đó qui ra phần nghìn tỷ số trung bình 3 lần giữa tế bào phân chia trên tổng số tế bào nghiên cứu [3]

Việc xác định chỉ số mitose có thể tiến hành trên tiêu bản tạm thời

1.7 Vị trí bài thực hành "Phân bào nguyên phân"

Đây là bài thực hành nằm trong ch-ơng trình thực hành bộ môn Di truyền học đại c-ơng, gồm 7 bài (1 đơn vị học trình = 15 tiết)

Bài 1: Chu kỳ sinh sản ruồi giấm Drosophilla sp

Bài 2: Làm tiêu bản quan sát nhiễm sắc thể khổng lồ ở ấu trùng Ruồi giấm

Bài 3: Làm tiêu bản quan sát phân bào nguyên nhiễm ở rễ Hành

Bài 4: Làm tiêu bản quan sát hình thành giao tử ở thực vật

Bài 5: Làm tiêu bản quan sát hình thành giao tử ở Châu chấu

Bài 6: Di truyền tính trạng số l-ợng

Bài 7: Sinh sản sinh d-ỡng ở thực vật ( chiết, ghép)

Lai hữu tính ở thực vật (lai Cà chua,Lúa)

Ch-ơng 2 đối t-ợng và ph-ơng pháp nghiên cứu

2.1 Đối t-ợng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là bài thực hành “phân bào nguyên phân” trong ch-ơng trình thực hành Di truyền học đại c-ơng tại khoa Sinh học - Tr-ờng

Đại học Vinh

Bài thực hành này đ-ợc nghiên cứu trên các loại đối t-ợng cây trồng sau:

- Hành ta (Allium ascalonicum)

- Tỏi (Allium sativum)

Thuộc chi Allium, họ Hành (Alliceae), bộ Hành (liliales), phân lớp Hành (liliidae), lớp 1 lá mầm (monocoty ledoneae)

Đây là hai đối t-ợng đ-ợc sử dụng phổ biến trong nghiên cứu và thực hành tế bào học Vì chúng có một số -u điểm sau:

+ Dễ -ơm, ra rễ nhanh, sau 2-3 ngày có thể đạt kích th-ớc 1-1,5cm + Các nhiễm sắc thể có kích th-ớc lớn, dễ phân biệt với nhau, sau khi

đ-ợc nhuộm màu dễ thấy rõ nét d-ới kính vi thuận lợi cho quan sát các pha phân bào và nghiên cứu tốc độ phân chia

+ Tiêu bản dễ làm, có thể hoàn thành trong phạm vi thời gian ngắn của bài thực hành

+ Kinh tế: Rẻ tiền, dễ trồng, dễ kiếm

2.2 Ph-ơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết bị và hóa chất

Dụng cụ và thiết bị: Cân điện tử, tủ lạnh, kính hiển vi, máy ảnh, lam

kính, lamen, cốc đong, đũa thủy tinh, dao lam, đèn cồn, giấy thấm, đĩa đồng

hồ

Hóa chất:

- Dung dịch cố định: Chất cố định có tác dụng đẩy không khí ra làm

vững chắc mô, đông đặc nhanh các thành phần của mẫu vật, tạo điều kiện thuận lợi cho nhuộm màu Muốn cố định đạt hiệu quả mẫu vật phải t-ơi, thuốc

nhuộm phải ngấm nhanh chóng đều đặn, phải cố đinh đ-ợc từng bộ phận riêng biệt của tế bào

Cố định là ph-ơng pháp giết chết vật sống bằng các chất độc mà vẫn giữ nguyên cấu trúc của nó Trên thực tế, không có chất cố định nào là không làm biến đổi vật sống Vì thế, ta th-ờng dùng chất cố định kép để mỗi chất cố

định giữ đ-ợc một mặt của cấu tạo Trong bài thực hành với đối t-ợng là Tỏi, Hành ta dùng chất cố định là dung dịch carnoy cải tiến pha theo công thức 3 cồn : 1 axit axetic

- Thuốc nhuộm: Do đặc điểm về đối t-ợng, thời gian nghiên cứu ta

dùng thuốc nhuộm Cacmin axetic 1%, có khả năng thấm nhanh vào mẫu vật, rút ngắn đ-ợc thời gian làm thực hành

Cách pha Cacmin axetic 1%: Lấy 1g cacmin hòa tan 100ml dung dịch

axit axetic 45% (hoặc 45ml axit axetic + 55 ml n-ớc cất) Đậy nắp bình (trên nắp bình có ống thông), đun sôi cách thủy 30-60phút Đun xong, để nguội và lọc trên phễu lọc 2 lớp giấy, dung dịch lọc xong để vào chai nâu đậy nút nhám cho vào tủ lạnh

2.2.2 Ph-ơng pháp chuẩn bị mẫu vật

- Ươm củ Tỏi, Hành ta vào chậu hoặc khay có chứa cát ẩm

- Thời gian -ơm từ 2 đến 6 ngày tuỳ thuộc vào nhiệt độ của môi tr-ờng,

Chọn những rễ Tỏi hoặc Hành ta t-ơi, vừa lấy ra trong môi tr-ờng cát

ẩm, có sức sống tốt, từ 1-1,5cm, còn nguyên đỉnh sinh tr-ởng, rồi rửa sạch (chú ý không làm rễ tổn th-ơng) Sau đó cắt lấy đoạn rễ khoảng 0,5cm kể từ chóp rễ

B-ớc 2: Cố định mẫu vật

Rễ đ-ợc thấm sạch n-ớc và cho lên lam kính sạch (hoặc đĩa đồng hồ),

nhỏ carnoy (chất cố định hay còn là chất định hình) lên mẫu vật, để nguyên

sau 3-5phút (chú ý l-ợng dung dịch cố định phải nhiều hơn mẫu nhiều lần)

B-ớc 3: Nhuộm mẫu vật

Dùng giấy thấm thấm sạch carnoy ở mẫu vật và nhỏ thuốc nhuộm

cacmin acetic 1%, sao cho thuốc nhuộm tiếp xúc đều với mẫu vật Sau đó hơ

đều điă đồng hồ hay tiêu bản lên ngọn lửa đèn cồn trong thời gian từ 1-2phút

Mẫu vật sau khi nhuộm yêu cầu tế bào chất phải trong, bắt màu nhạt,

nhân bắt màu đậm hơn

B-ớc 4: ép mẫu vật

Lấy nhẹ nhàng mẫu vật đã cố định cho lên lam kính và dùng lamen đậy

lên mẫu vật sao cho không có bọt khí, dùng que diêm gõ nhẹ để dàn mỏng

mẫu vật.Cuối cùng dùng giấy thấm thấm sạch thuốc nhuộm Tiêu bản ép cần

đảm bảo yêu cầu là các tế bào dàn đều thành một lớp trên mặt phẳng, tế bào

không bị vỡ, nát

2.2.4 Ph-ơng pháp quan sát tiêu bản qua kính hiển vi

Điều chỉnh ánh sáng phù hợp và để ở vật kính 10, đặt tiêu bản vừa

chuẩn bị lên bàn kính hiển vi, dùng ốc sơ cấp điều chỉnh khoảng cách giữa

mắt kính và tiêu bản cho đến lúc quan sát đ-ợc.Sau đó chuyển sang quan sát ở

vật kính 40 Cuối cùng quan sát tiêu bản ở vật kính 100, ở vật kính này th-ờng

phải nhỏ một giọt dầu kính lên tiêu bản mới có thể quan sát đ-ợc

2.2.5 Ph-ơng pháp lấy số liệu

- Đếm tất cả các tế bào trong thị tr-ờng, ghi nhận số tế bào của từng

giai đoạn của quá trình nguyên phân

- Mỗi thị tr-ờng tiến hành đếm 3 lần

- Tiến hành lấy số liệu ở các thời điểm 7giờ-7giờ 30phút, 9giờ-9giờ

30phút, 13giờ 30phút-14giờ, 15giờ-15giờ 30phút Mỗi thời điểm chúng tôi

tiến hành quan sát 15-30 tiêu bản, mỗi tiêu bản lấy số liệu ở 3 thị tr-ờng

2.2.6 Ph-ơng pháp xử lý thống kê toán học

- Tính giá trị trung bình số tế bào của mỗi kỳ ở mỗi tiêu bản

- Quy ra phần nghìn tỷ số trung bình (mỗi tiêu bản 3 thị tr-ờng, mỗi thị tr-ờng đếm 3 lần) giữa tế bào phân chia trên tổng số tế bào đếm đ-ợc trong thị tr-ờng quan sát

- Gọi: MIij: Là chỉ số phân chia của tế bào trên thị tr-ờng i, tiêu bản j + a1, a2, a3 là số tế bào đang phân chia ở kỳ đầu đếm đ-ợc ở lần 1, lần 2, lần 3

+ b1, b2, b3 là số tế bào đang phân chia ở kỳ giữa đếm đ-ợc ở lần 1, lần

1000 ).

( ) (

) (

) (

3 2 1

3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1

n n n

d d d c c c b b b a a a

1 ,

2.2.7 Ph-ơng pháp xác định chỉ số mitose (MI)

Ph-ơng pháp tính qui ra phần nghìn: Chỉ số mitose đ-ợc tính bằng cách qui ra phần nghìn tỷ số tế bào phân chia trên tổng số tế bào trong thị tr-ờng quan sát Để xác định một cách chính xác, ta đếm lại 3 lần trên 1 thị tr-ờng và

3 thị tr-ờng trên 1 tiêu bản, sau đó lấy giá trị trung bình rồi quy ra phần nghìn

2.2.8 Ph-ơng pháp tiền cố định bằng xử lý lạnh

- Rễ Tỏi (Hành ta) t-ơi, vừa lấy ra trong môi tr-ờng cát ẩm có sức sống tốt, có độ dài từ 1-1,5cm, còn nguyên đỉnh sinh tr-ởng rửa sạch (chú ý không làm tổn th-ơng rễ)

- Cắt các đoạn rễ dài 1-1,5cm cho vào lọ sạch, có n-ớc cất để trong tủ lạnh (nhiệt độ 50c-70c) trong 24giờ, lấy ra cố định lại bằng carnoy, nhuộm cacmin axetic 1%, làm tiêu bản ép và quan sát

- Xử lý lạnh tr-ớc khi làm tiêu bản ép có tác dụng làm nhiễm sắc thể co ngắn hơn rất nhiều lần Nhờ vậy có thể phân biệt các kỳ phân chia rõ ràng hơn

ch-ơng 3 kết quả nghiên cứu và thảo luận

3.1 Kết quả quan sát tế bào ở các kỳ nguyên phân sau khi rút ngắn thời gian nhuộm màu nhiễm sắc thể

Mẫu vật sau khi cố định bằng dung dịch carnoy, ta tiến hành nhuộm cacmin axetic 1% trong 2-3 phút, hơ qua ngọn lửa đèn cồn trong khoảng 1 phút, quan sát qua kính hiển vi ở vật kính 100X Thu đ-ợc hình ảnh về sự vận

động của nhiễm sắc thể trong nguyên phân rõ hơn so với ph-ơng pháp tr-ớc

đây th-ờng phải nhuộm cacmin axetic 1% trong 15 phút:

Rễ Hành ta:

Hình 3.1.1: Kỳ đầu Hình 3.1.2: Kỳ đầu - kỳ giữa

Hình 3.1.3: Kỳ giữa Hình 3.1.4: Kỳ giữa-kỳ sau

z

H×nh 3.1.5: §Çu kú sau H×nh 3.1.6: Kú sau

H×nh 3.1.7: Kú gi÷a-kú sau-®Çu kú cuèi H×nh 3.1.8: Kú cuèi

H×nh 3.1.9: TÕ bµo ë c¸c kú nguyªn ph©n H×nh 3.1.10 ( ë vËt kÝnh 40X)

RÔ Tái:

H×nh 3.1.12: Kú ®Çu H×nh 3.1.13: Kú ®Çu-kú gi÷a

H×nh 3.1.14: Kú gi÷a H×nh 3.1.15: Kú sau

H×nh 3.1.16: Cuèi kú sau H×nh 3.1.17: §Çu kú sau-®Çu kú cuèi

Hình 3.1.18: Kỳ cuối Hình 3.1.19: Tế bào ở các kỳ nguyên phân

Hình 3.1.20 (quan sát ở vật kính 40X)

3.2 Hoạt tính nguyên phân của tế bào

Sau một thời gian nghiên cứu, xác định rõ các kỳ nguyên phân trên tiêu bản tạm thời Chúng tôi đã tiến hành xác định hoạt tính nguyên phân trên hai

đối t-ợng Hành ta, Tỏi tại các thời điểm tiến hành các bài thực hành Kết quả

đ-ợc thể hiện rất rõ ở các bảng (phần phụ lục)

 Thời điểm 9giờ-9giờ 30phút hoạt tính nguyên phân ở rễ Hành ta là cao nhất

 Thời điểm 13giờ 30phút-14giờ hoạt tính nguyên phân ở rễ Tỏi là cao nhất

Nh- vậy, có thể bố trí các bài thực hành vào các thời điểm mà các đối t-ợng có hoạt tính nguyên phân cao nhất

3.3 Kết quả quan sát tế bào ở các kỳ nguyên phân sau khi giữ trong cồn 70%-80%

- So với mẫu vật sau khi cố định bằng carnoy, tiến hành làm tiêu bản tạm thời ngay Thì mẫu vật sau khi cố định bằng carnoy, rồi giữ trong cồn

70%-80% ở nhiệt độ thấp (50c-300c), mang ra làm tiêu bản tạm thời vẫn giữ

đ-ợc trạng thái phân chia bình th-ờng của tế bào

H×nh 3.4.1: Kú ®Çu (Hµnh ta) H×nh 3.4.2: Kú ®Çu-kú gi÷a (Tái)

H×nh 3.4.3: Kú sau (Tái) H×nh 3.4.4: Cuèi kú sau (Tái)

H×nh 3.4.5: Kú cuèi (Tái)

Kết luận và kiến nghị

kết luận

Phân tích kết quả thu đ-ợc Chúng tôi có một số kết luận sau:

- Về ph-ơng pháp làm tiêu bản tạm thời:

+ Mẫu vật là rễ phải khoẻ và không dài quá 5cm

+ Nhất thiết phải hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn để làm mủn mẫu vật, đồng thời nhân bắt màu nhanh Mâũ vật khi cho vào thuốc nhuộm 2-3phút

ta đem hơ lên ngọn lửa đèn cồn trong 1phút có thể rút ngắn thời gian làm tiêu bản gấp 4 lần so với các ph-ơng pháp cũ (là 20phút)

- Về hoạt tính phân chia nguyên phân:

Thời điểm phân chia mạnh nhất ở rễ Hành ta là 9giờ-9giờ 30phút, ở rễ Tỏi là 13giờ 30phút-14giờ Nh- vậy, ta có thể cố định mẫu vật ở thời điểm hoạt tính phân chia cao nhất rồi giữ trong cồn 70%-80%

- Tiền cố định bằng nhiệt độ lạnh (50c-70c), làm nhiễm sắc thể co ngắn hơn rất nhiều lần Nhờ đó, dễ dàng phân biệt đ-ợc các kỳ của nguyên phân,

đồng thời có thể quan sát đ-ợc hình dạng của nhiễm sắc thể

kiến nghị

- Do điều kiện về thời gian, chúng tôi chỉ mới nghiên cứu ở hai đối t-ợng thuộc chi Hành tỏi Để mở rộng cho đối t-ợng thực hành cần nghiên

cứu trên các đối t-ợng khác nữa

- Để hiểu rõ hơn về hoạt tính nguyên phân, cần nghiên cứu quá trình nguyên phân ở nhiều thời điểm hơn nữa

Tài liệu tham khảo

[1] C.Vili và Đêthiơ Các nguyên lý và quá trình sinh học (sách dịch) (1979)

NXB khoa học và kỹ thuật

[2] Đặng Hữu Lanh, Nguyễn Minh Công, Lê Đình Trung Thực hành di truyền học và chọn giống (1984) NXB giáo dục

[3] Nguyễn Thị Hoà Tiểu luận khoa học (tháng 9/2002) Đại học Vinh

[4] Lê Ngọc Tú, Đỗ Ngọc Liên, Đặng Thị Thu Tế bào và các quá trình sinh học (2002) NXB khoa học và kỹ thuật Hà Nội

[5] Pauseva Thực hành tế bào thực vật NXB khoa học và kỹ thuật

[6] Phan Cự Nhân, Lê Đình L-ơng Cơ sở di truyền học (2003) NXB giáo

dục

[7] Phan Cự Nhân (chủ biên) Di truyền học (1999) NXB giáo dục, tập I [8] Phan Cự Nhân (chủ biên) Sinh học đại c-ơng (2004) NXB Đại học S-

phạm, tập I

[9] Phạm Thành Hổ Di truyền học (2002) NXB giáo dục

[10] Thái Duy Ninh Tế bào học (1996) NXB giáo dục

[11] Xoanson, T.Mêcz, W.Jany Di truyền học tế bào (sách dịch) (1977)

NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội

[12] Ngô Trực Nhã (2001) Số l-ợng nhiễm sắc thể của các loài cây thựôc chi Hành tỏi (Allium) phổ biến ở Nghệ An và Hà Tĩnh Tạp chí Sinh học, tập 23 -

số 3C, tr 166 - 169

B¶NG 2: kÕt qu¶ nghiªn cøu ë rÔ hµnh (9h-9h30')