MIỄN DỊCH HỌC CHẨN ĐOÁN GIUN SÁN KÝ SINH

Trình bày được nguyên lý của các kỹ thuật miễn dịch học chẩn đoán giun sán. Thực hiện được xét nghiệm ELISA chẩn đoán một số bệnh ký sinh trùng thường gặp. Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu gián tiếp ELISA gián tiếp Kỹ thuật ngưng kết hạt Latex Sandwich ELISA Dipsticks assayChromatography Immunoblot assay Kỹ thuật khác

Xét nghiệm miễn

dịch học chẩn

đoán Giun – Sán

ký sinh

Mục tiêu

• Trình bày được nguyên lý của các kỹ thuật

miễn dịch học chẩn đoán giun sán.

• Thực hiện được xét nghiệm ELISA chẩn đoán một số bệnh ký sinh trùng thường gặp.

Nội dung

 Giới thiệu

 Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu gián tiếp

 ELISA gián tiếp

 Kỹ thuật ngưng kết hạt Latex

Giới thiệu

4

IgG và IgE hợp tác loại bỏ

S venezuelensis

(A) To examine which classes of Igs are able to induce worm expulsion We injected IgG Fr (1.8 mg), IgE Fr (5

μg), or a mixture of IgG Fr (1.8 mg) and IgE Fr (5 μg) into AID−/− mice on day 7 after infection with 4,000 L3, and adult worms were recovered at day 8 As shown here, IgG and IgE reduced worm burdens

collaboratively (B) Hypothetical mechanism of IgG- and IgE-mediated worm expulsion.

• IL-12 and parasite infection Early in infection with intracellular parasites, IL-12 is produced

by phagocytic cells and induces the production of IFN-γ by natural killer (NK) cells and T cells This early production of IFN-γ may help control infection by immediately activating

macrophages In addition, IL-12 and the IL-12-driven cytokine IFN-γ favour the development

of parasite-specific TH1 cells, in addition to inducing the production of high levels of IFNγ by already differentiated TH1 cells

• This early production of Il-12 is functionally analogous to the early induction of IL-4 synthesis by helminthic parasites, which drives TH2 development Any helminthic parasite that does not induce the production of IL-12 may contribute to the development of TH2 as a default pathway

Mechanisms of immune modulation by helminth ES products (in bold) and defined molecules (in plain type) discussed in the text Abbreviations: APC, antigen presenting cell; ASP, Ancylostoma secreted protein; BES, B malayi ES; CPI, cysteine proteinase inhibitor

(cystatin); HES, H polygyrus ES; IPSE, IL-4-inducing principle of schistosome eggs; L-NES, larval N brasiliensis ES; MIF, macrophage migration inhibitory factor; NES, adult N

brasiliensis ES; NIF, neutrophil inhibitory factor; Sm, Schistosoma mansoni; SPN, serine proteinase inhibitor (serpin); TLR, toll-like receptor; TGF, transforming growth factor; TES,

T canis ES.

Protective TH2-type response during intestinal nematode

infection

• Infective third-stage larvae (L3) are ingested by the host They then travel to the duodenum, invade the epithelia, and reside in the submucosa for 8 days, after which they enter the lumen of the duodenum as adult nematodes Primary infections become established and chronic, but can be cleared by antihelminthic drug treatment Challenge (secondary) infections are naturally cleared by the host by day 14 post-infection, making this an excellent model of protective memory T helper 2 (TH2)-type responses Parasite antigens are presented to CD4+ T cells in mesenteric lymph nodes and other gut-associated lymphoid tissues, driving the induction of TH2 effector cells These cells exert their effector functions through the production of a number of cytokines, including interleukin-4 (IL-4), IL-13, IL-9 and IL-5 TH2 cells induce B-cell immunoglobulin class- switching to IgE Shortly after activation, TH2 effector cells migrate to the site of parasite residence in the submucosa Within several days, a distinct immune-cell infiltrate appears which can damage the larval parasite after secondary, but not primary, inoculation The infiltrate following secondary inoculation includes TH2 cells, dendritic cells (DCs), neutrophils and alternatively activated macrophages (AAMs) The TH2 cytokines IL-4 and IL-13 might also facilitate expulsion of adult parasites in the lumen by inducing changes in intestinal physiology.

re-TH2-cell functions during helminth infection

• T helper 2 (TH2) cells orchestrate the immune response primarily through the production of cytokines in the lymph nodes and periphery Interleukin-5 (IL-5) triggers eosinophilia, and in conjunction with IL-4, IL-9, and IL-13, and the crosslinking of FcεRIs (high-affinity Fc receptors for IgE), can result in enhanced mast-cell and basophil development and release of mediators IL-4 and IL-13 stimulate increased smooth-muscle-cell contractility, increased intestinal permeability and elevated goblet-cell

mucous secretion IL-4 and IL-13 also enhance responsiveness of these cell types to mast-cell-derived mediators Collectively, these effects can contribute to the ‘weep and sweep’ response to intestinal helminths IL-4, in conjunction with other signals, can induce class switching in B cells, leading to IgE production IL-4, IL-13 and IL-21, can drive development of alternatively activated macrophages (AAMs), leading to upregulation of arginase-1 expression, and in some cases this might lead to fibrosis,

as in chronic schistosomiasis IL-25 expression stimulates a c-KIT+FcεRI− population to migrate to lymph nodes and upregulate TH2-type cytokine mRNAs It is unclear whether IL-25 is a TH2-type cytokine, or whether it is expressed by a distinct TH-cell lineage IL-21, also produced by TH17 cells, is instrumental in the development of a TH17-like response (not shown) ChaFFs, chitinase and FIZZ family members; RELM, resistin-like molecule

T helper and regulatory cells

• Naive CD4+ T cells can differentiate into several different types of effector and regulatory cells

• during helminth infection Specific cytokines and transcription factors contribute to

• differentiation and expansion of these cell populations, and their differential activation plays

• a major role in determining whether an immune response will contribute to host protection or

• pathological inflammation Exposure to interleukin-12 (IL-12) produced by antigen-presenting

• dendritic cells (DCs) induces T-bet expression, driving T helper 1 (TH1)-cell differentiation.

• These cells produce interferon-γ (IFNγ), and are unable to clear helminth parasites The

• circumstances leading to TH2-cell differentiation are not as clear but recently, IL-2, IL-25 and

• thymic stromal lymphopoietin (TSLP), and associated transcription factors, have been

• implicated TH2 cells produce a panel of cytokines that contribute to antihelminth immunity

• by instructing innate bone-marrow- and non-bone-marrow-derived cells, which in turn can

• instruct and amplify TH2 cells Strong TH2-type responses often lead to increased resistance

• to parasites, as seen in Heligmosomoides polygyrus infection, or control of harmful

• inflammation mediated by TH1 cells and TH17 cells, as in schistosomiasis However, chronic

• potent TH2-cell responses can also lead to harmful TH2-type inflammatory responses including

• fibrosis Expression of the transcription factor forkhead box P3 (FOXP3) along with the

• cytokines transforming growth factor-β (TGFβ) and IL-2, leads to differentiation of regulatory

• T cells (TReg cells), which can inhibit the immune response Several factors, including

retinoicacid-• receptor-related orphan receptor-γ (RORγ), TGFβ, IL-6, IL-21 and IL-23, have been

• shown to promote TH17-cell differentiation, and these effector cells can mediate harmful

• inflammation IL-10, which is no longer considered to be exclusively a TH2-type cytokine, can

• be produced by TH1, TH2, and TRegcells and downregulates both TH1- and TH2-type responses.

• TNF, tumour-necrosis factor.

Parasite-derived immune modulators function at several levels on crucial immune regulatory cells Cytokine mimics, such as macrophage-migration inhibition factor (MIF) and transforming growth factor- (TGF-), that are present in helminths such

as Brugia malayi can modulate macrophage function and lead to the induction of T helper 2 (TH2) cells and immune

suppression Non-protein signature molecules (for example, from Schistosoma mansoni) such as phosphatidylserine (PS)

and lyso-PS, phosphorylcholine and a range of glycans (such as di-N-acetyl-difucosylated lactose, lacto-n-fucopentaose III and lacto-N-neotetraose) can interact with dendritic cells and result in the induction of both TH2- and regulatory T (TReg)-cell phenotypes Helminths also produce prostaglandins PGD2 and PGE2, which can have similar effects on accessory cells

(not shown) Direct interference with antigen presentation by parasite-derived cystatins (such as CPI2 from B malayi and onchocystatin from Onchocerca volvulus) prevents T-cell activation both at the level of T-cell receptor engagement by

peptide–MHC complexes (by inhibiting proteases involved in antigen presentation), and by enhancing the production of interleukin-10 (IL-10) by accessory cells

Miễn dịch học với nhiễm ký sinh trùng

 Giun sán là đa bào nhiều loại antigen khác nhau, nhiều giai đoạn phát triển khác nhau.

 Kết quả của phản ứng miễn dịch với giun sán:

– Miễn dịch hoàn toàn: nhiễm bệnh, tự chữa bệnh và bảo

vệ cho các lần tiếp theo.

– Miễn dịch không hoàn toàn: nhiễm bệnh, giảm số lượng KST và bệnh, không thể bảo vệ cho lần tiếp theo.

– Chẩn đoán miễn dịch học

- Rất khó khăn trong việc thu hồi con giun – sán từ người

-Khó khăn trong việc phân biệt một số loài tương đối giống nhau

(Cs & Ov & MIF)

- Trong trường hợp nhiễm nhẹ

Kỹ thuật chẩn đoán Ký sinh trùng

- Độ nhạy & độ đặc hiệu cao

- Nhiễm chép giữa các loại

- Trong trường hợp tiếp xúc với tác nhân gây bệnh (đối với xác định KT)

Sinh học

phân tử - Độ đặc hiệu cao - Có thể xác định được

dưới nhóm

- Độ nhay còn chưa cao

- Cần trang thiết bị đăt tiền và KTV được đào tạo

- Khó áp dụng hàng loạt ở cộng đồng

Kỹ thuật chẩn đoán Ký sinh trùng

Miễn dịch học chẩn đoán KST

• Xác định kháng thể:

– Chủ yế là IgG, ngoài ra IgA, IgM & IgE

– Ưu điểm: số lượng lớn mẫu, độ nhạy cao

– Nhược điểm: mới nhiễm và tiếp xúc.

• Xác định kháng nguyên:

– Sử dung kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng

– Ưu điểm: số lượng mẫu lớn, mới nhiễm và tiếp xúc

– Nhược điểm: độ đặc hiệu phụ thuộc độ đặc hiệu của kháng thể.

Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu

gián tiếp

Kháng nguyên hòa

tan của giun sán gắn

với hồng cầu cừu Kháng thể nguyên kháng thể Phức hợp kháng

Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu

gián tiếp

 Sử dụng kháng nguyên toàn phần xác định kháng thể trong huyết thanh của bệnh nhân

Schistosomiasis

 Độ nhạy của kỹ thuật trong xác định S mansoni, S

haematobium, và cả 2 là 88.0, 80.0 và 86.0%, độ

đặc hiệu là 98.9%, với ngưỡng là 1:160

 Khi ngưỡng 1:80 thì độ nhạy tương ứng là 94.7,

(Van Gool et al., 2002)

ELISA gián tiếp

Ứng dụng Cysteine Proteinase của

Cs cho chẩn đoán Cs

Kháng nguyên: cathepsin L cysteine proteinases

(37 kDa) của sán lá gan nhỏ C.sinensis

Kháng thể: huyết thanh người nhiễm ký sinh

Serodiagnosis of human helminthiasis with Cs 14-3-3 by

Kỹ thuật ngưng kết hạt Latex

Kỹ thuật ngưng kết hạt Latex

Kháng thể đa dòng: tiêm kháng nguyên ấu trùng

Echinococcus vào thỏ 2 lần, sau đó thu lấy huyết

thanh thỏ pha loãng 1024 lần.

Tinh sạch huyết thanh bằng nước muối hoặc ammonium sufate Pha loãng 2048 lần.

Trộn polystyrene latex suspension + glycine buffer saline + kháng thể

Kết quả: độ nhạy là 100% và không có phản ứng chéo với những mẫu được nghiên cứu.

(Devi Chandrakesan and Parija, 2003)

Peroxidase gắn với kháng thể

(IgG2)

Chất hiện màu

màu

Sandwich ELISA xác định kháng

nguyên của F gigantica

 Kháng thể đơn dòng phản ứng với kháng nguyên là chất tiết

 12B/11D/3F kháng thể đơn dòn (IgG1) như là kháng nguyên

 10A/9D/10G kháng thể đơn dòng (IgG2) là kháng thể xác định

 Kháng nguyên được xác định từ huyết thanh và

huyền dịch ở phân

 Huyết thanh: độ nhạy và độ đặc hiệu là 94% & 94.6%

 Phân: độ nhạy và độ đặc hiệu là 96% & 98.2%

(Demerdash et al., 2011)

Antigen detection of C sinensis

Target protein Sensitivity Specificity

Mazidur et

al (2012)

Detection of CsAg in feces from

different groups of rats

Mazidur et al (2012)

DIPSTICK DYE IMMUNOASSAY

28

Ab + Ag conjugated dye

DIPSTICK DYE IMMUNOASSAY

 Sử dụng kháng nguyên hòa tan từ trứng xác định

kháng thể của S japonicum trong huyết thanh

 Kháng nguyên hòa tan từ trứng: trứng của

S.japonicum thu thập từ thỏ gây nhiễm, tinh sạch và

hòa tan trong nước muôi sinh lý.

(Zhu et al., 2005)

DIPSTICK DYE IMMUNOASSAY

 Kháng nguyên hòa tan từ trứng gắn với xanh colloidal dye, sau đó trộn với huyết thanh Phực hợp này được gắn chuyển vào miếng giấy cellulose

Kháng thể S.japonicum IgG dùng làm chuẩn và

kháng huyết thanh người IgG để xác định

 Kết quả: độ nhạy của mẫu từ Cambodian và Laos là

97.1% & 98.6% Nhiễm chéo với sán lá gan nhỏ O

viverrini là 18.3%

(Zhu et al., 2005)

Que nghúng chẩn đoán bệnh sán là

gan lớn ở người

31

Ali et al (2012)

100% 96.7%

Immunoblot technique

32

Immunoblot chẩn đoán

Gnathostomiasis

• Kháng nguyên: ấu trùng gđ 3 của G spinigerum

• Kháng thể thứ nhất: kháng thể trong huyêt thanh

người kháng với 21-kDa và 24-kDa

• Kháng thể thứ 2: peroxidase gắnvới kháng thể người

• Nhược điểm: khá đắt, không nhanh và có thể chẩn

đoán sai nếu bệnh nhân suy giảm miễn dịch

IMMUNOBLOT TECHNIQUES

(Intapan et al., 2010)

- Complement fixation test

- Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot (EITB)

- Immunodot blot assay

- Magnetic microbead-based enzyme-linked

immunoassay (MEIA)

- Immunohistochemical/immunofluorescence

Biện luận kết quả HUYẾT THANH HỌC

• Kết quả luôn định lượng (hiệu giá, trị số OD )

• Được gọi là [+] khi giá trị định lượng cao hơn giá trị cắt

• Kết quả [+] chưa thể coi là đang mang mầm bệnh (có thể kháng thể có do tiếp xúc với tác nhân gây bệnh),

mà phải dựa vào

Biện luận kết quả HOÁ MIỄN DỊCH

• Kết quả có thể không định lượng hay định lượng (hiệu giá, trị số OD )

• Được gọi là [+] khi giá trị định lượng cao

hơn giá trị cắt, hay kết quả phân biệt rõ với chứng [-]

• Kết quả [+] có thể coi là đang mang mầm bệnh nếu kháng nguyên phát hiện được là đặc hiệu cao.

Kết luận

- Kỹ thuật miễn dịch giúp chẩn đoán GS nhanh, chính xác cao và

ít tốn kém

- Các kỹ thuật miễn dịch chẩn đoán GS: Ngưng kết hồng cầu

gián tiếp, ELISA gián tiếp, Sandwich ELISA, Immunobloting

- Kỹ thuật trực tiếp thường cho kết quả chính xác hơn Tuy

nhiên, khó khăn trong việc sản xuất kháng thể và trong việc tóm bắt kháng nguyên trong mẫu bệnh phẩm lạ trở ngại của những kỹ thuật này.

Thank you for attention!