Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch (ped) trên lợn landrace và áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ YẾN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH PED TRÊN LỢN LANDRACE VÀ ÁP DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH (PED) TRÊN LỢN LANDRACE VÀ ÁP DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ

MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Lan

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Yến

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc PGS TS Nguyễn Thị Lan đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài

và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y và bộ môn Bệnh lý thú y đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Yến

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN X THESIS ABSTRACT XII

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 2

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI 2

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 2

1.5.1 Ý NGHĨA KHOA HỌC 2

1.5.2 Ý NGHĨA THỰC TIỄN 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 4

2.1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED TRONG NƯỚC 4

2.1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED NGOÀI NƯỚC 5

2.2 MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS GÂY BỆNH PED 8

2.2.1 PHÂN LOẠI VÀ HÌNH THÁI CỦA VIRUS GÂY BỆNH PED 8

2.2.2 CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA VIRUS GÂY BỆNH 9

2.2.3 TÍNH CHẤT NUÔI CẤY 12

2.2.4 SỨC ĐỀ KHÁNG CỦA VIRUS GÂY BỆNH PED 12

2.2.5 TRUYỀN NHIỄM HỌC 12

2.2.6 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH 14

2.2.7 CHẨN ĐOÁN 15

2.2.8 PHÒNG BỆNH 18

2.3 SƠ LƯỢC VỀ HÓA MÔ MIỄN DỊCH 20

2.3.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN 20

2.3.2 NGUYÊN LÝ 20

2.3.3 KHÁNG NGUYÊN (ANTIGEN) 21

2.3.4 KHÁNG THỂ (ANTIBODY) 21

2.3.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHÁNG THỂ 22

2.3.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM 22

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 25

3.3 ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 25

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 26

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.5.1 PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG 26

3.5.2 PHƯƠNG PHÁP RT-PCR 26

3.5.3 PHƯƠNG PHÁP MỔ KHÁM, QUAN SÁT BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ 28

3.5.4 PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VI THỂ VÀ QUAN SÁT BỆNH TÍCH TRÊN TIÊU BẢN 29

3.5.5 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH 32

3.5.6 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO 33

3.5.7 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VIRUS 34

3.5.8 XỬ LÝ SỐ LIỆU 34

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED 35

4.1.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CHỦ YẾU CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED 37

4.1.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ ĐẠI THỂ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED 41

4.1.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ VI THỂ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED 43

4.2 KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH 50

4.2.1 KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH 50

4.2.2 SO SÁNH KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN KHÁC 52

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

5.1 KẾT LUẬN 56

5.2 KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

TIẾNG VIỆT 58

TIẾNG ANH 58

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CPE - Cytopathogenic effect

DMEM - Dµlbecco's Modified Eagle's medium

EDTA - Ethylendiamin Tetraacetic Acid

FBS - Fetal bovine serum

PBS - Phosphat buffer salin

PED - Porcine Epidemic Diarrhea

PEDV - Porcine Epidemic Diarrhea virus

RT-PCR - Reverse transcription polymerase chain reaction

TGE - Transmissible gastroenteritis

TPB - Tryptose Phosphate Broth

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng RT-PCR 27 Bảng 3.2 Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt phản ứng

RT-PCR 27 Bảng 4.1 Thông tin các ca bệnh chẩn đoán PED 35 Bảng 4.2 Kết quả chẩn đoán PED bằng phản ứng RT-PCR 35 Bảng 4.3 Kết quả phản ứng RT-PCR và PCR xác định sự có mặt của một số

virus gây tiêu chảy trên lợn 37 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn Landrace mắc PED 37 Bảng 4.5 Bệnh tích đại thể trên một số cơ quan của lợn Landrace mắc PED 41 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể ở ruột của lợn mắc tiêu chảy do

virus (PED) 46 Bảng 4.7 Bệnh tích vi thể ở một số cơ quan của lợn con mắc tiêu chảy do virus

(PED) 48 Bảng 4.8 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch mẫu ruột của lợn Landrace mắc

PED 51 Bảng 4.10 So sánh kết quả của một số phương pháp chẩn đoán virus PED 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Những không bào trong bào tương của một tế bào hấp thu ở ruột non

lợn, chứa các hạt virus PED có đường kính từ 90-190 nm (x20.000) 9

Hình 2.2 Virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc nhuộm với urany acetat 2% Chiều dài thanh nằm ngang tương đương 100nm 9

Hình 2.3 Mô hình cấu trúc bộ gen virus PED 10

Hình 2.4 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR 17

Hình 2.5 Hình ảnh Test chẩn đoán nhanh bệnh PED 18

Hình 2.6 Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng 21

Hình 2.7 Một số phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) 24

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 36

Hình 4.2 Lợn sút cân, gầy còm 40

Hình 4.3 Lợn mệt mỏi 40

Hình 4.4 Lợn nằm dồn đống 40

Hình 4.5 Phân dính hậu môn, chân 40

Hình 4.6 Phân lỏng màu vàng 40

Hình 4.7 Lợn bị tiêu chảy 40

Hình 4.8 Dạ dày, ruột căng, thành mỏng 42

Hình 4.9 Hạch màng treo ruột sưng to 42

Hình 4.10 Thành ruột mỏng, xuất huyết 42

Hình 4.11 Ống dưỡng chất sung huyết 42

Hình 4.12 Dạ dày xuất huyết 43

Hình 4.13 Lách sẫm màu 43

Hình 4.14 Phổi chứa nhiều bọt 43

Hình 4.15 Hạch bẹn nông sưng 43

Hình 4.16 Phổi viêm 43

Hình 4.17 Thận xuất huyết điểm 43

Hình 4.18 Biểu mô dạ dày đứt nát (HE 10X) 49

Hình 4.19 Hoại tử tế bào biểu mô ruột (HE 20X) 49

Hình 4.20 Tĩnh mạch chứa nhiều hồng cầu (HE 10X) 49

Hình 4.21 Ruột thấm nước phù ở hạ niêm mạc ruột (HE 10X) 49

Hình 4.22 Lông nhung ruột đứt nát (HE 10X) 49

Hình 4.23 Thâm nhiễm tế bào viêm ở ruột (HE 10X) 49

Hình 4.24 Phổi nhiều tế bào viêm, tổ chức kẽ phổi tăng sinh (HE 10X) 50

Hình 4.25 Sung huyết hạ niêm mạc ruột (HE 20X) 50

Hình 4.26 Hồng cầu tràn lan ở hạch (HE 10X) 50

Hình 4.27 Lông nhung ruột tù đầu (HE 10X) 50

Hình 4.28 Virus ở tế bào biểu mô ruột 51

Hình 4.29 Virus tập trung ở phần lông nhung bị đứt nát 51

Hình 4.30 Virus ở tế bào biểu mô ruột 51

Hình 4.31 Virus tập trung ở phần lông nhung bị đứt nát 51

Hình 4.32 Tế bào Vero bình thường 53

Hình 4.33 Tế bào Vero khi bắt đầu có bệnh tích 53

Hình 4.34 Bệnh tích tế bào đang phát triển 53

Hình 4.35 Tế bào bị Phá hủy hoàn toàn 53

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Yến

Tên Luận văn: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) trên lợn Landrace và áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Giúp chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh do virus PED gây ra trên lợn

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn Landrace mắc bệnh PED Nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn Landrace mắc bệnh PED Nghiên cứu bệnh tích vi thể của lợn Landrace mắc bệnh PED Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh Máy chuyển đúc mẫu tự động, máy cắt tổ chức Microtom, máy làm khô tiêu bản, kính hiển vi quang học, máy ly tâm, máy gia nhiệt PCR Formol 10%, paraffin, xylen, thuốc nhuộm Hematoxilin – Eosin, 10% FBS, dung dịch đệm EDTA; dòng tế bào Vero-NIH; DMEM, FBS, kit tách chiết RNA tổng số, cặp mồi gene S, kit phản ứng RT-PCR, đệm TBE, agarose Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn Landrace mắc bệnh PED bằng các phương pháp: phương pháp khám lâm sàng; phương pháp RT- PCR; phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể; phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản; phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch, phương pháp phân lập virus

- Bệnh tích vi thể ở ruột: Ruột non: lông nhung đứt nát, ngắn lại; tế bào biểu mô bong tróc, thoái hóa, hoại tử, thâm nhiễm tế bào viêm và xuất huyết ở lớp đệm, lớp hạ

niêm mạc; ruột già: Tuyến Lieberkuun đứt nát, tế bào biểu mô bong tróc Bệnh tích ở dạ dày: Tế bào niêm mạc bong tróc, viêm Bệnh tích hạch màng treo ruột: viêm hạch, xuất huyết Bệnh tích ở phổi: viêm, xuất huyết Bệnh tích ở gan, lách: sung huyết, nhồi huyết Thận bị viêm cầu thận

Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch trên ruột đã chỉ ra virus PED tập trung chủ yếu

ở tế bào biểu mô lông nhung và các tế bào tuyến ruột Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu ruột có chất chứa bên trong phù hợp trong công tác chẩn đoán bệnh PED bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

THESIS ABSTRACT Author: Nguyen Thi Yen

Thesis Title: Pathological characteristics of porcine epidemic diarrhea (PED)

in Landrace pigs and using immunohistochemistry to diagnosis

Training Institution: Vietnam National University of Agricµlture

Research purposes: To diagnose PED fastly and corectly

Research Methods

In this research, the clinical signs, macro findings and histopathology of infected Landrace pigs with PED virus were showed In addition, immunohistochemistry staining method also was used in diagnosis We used automated-vacuum tissue processor, microtome, water bath, warming table, microscope, centrifuge, thermal cycler PCR, Neutral formol 10%, paraffin, xylene, Hematoxilin – Eosin stain, 10%FBS, EDTA buffer, Vero-NIH cell line, DMEM, FBS, RNA extraction kit, primers of S gene, RT-PCR kits, TBE buffer, agarose Main pathological characteristics of Landrace pigs infected with PED virus by standard methods such as: Clinical signs, RT-PCR, necropsy, gross finding, slide preparation and histopathology, immunohistochemistry, virus isolation

Main resµlts and conclusion

This research shows pathological characteristics in 22 Landrace pigs infected PED virus including:

- The main clinical signs of pig infected PED were anorexia, exhausted, fever, vomit and huddle

- Gross pathological findings were mainly present in the intestines and lymph node The small intestine was distended with watery yellow translucent content, bleeding (100%) The stomach was distended with undigested food translucent content, bleeding (77,27%) Mesenteric lymph nodes were hyperemia, congested, hemorrhage (100%) Pneumonia, hemorrhage (40,91%), hemorrhagic spots in kidneys (63,63%)

- Microscopically, the intestinal layers included: broken and shorten villi, epithelial cells were detached, degeneration, necrosis; inflammatory cell infiltrate and hemorrhage in muscµlaris, sub mucosa In large intestine, intestinal crypts were broken and detached In stomach, epithelial cells were detached, inflammatory cell infiltrate Mesenteric lymph nodes were hemorrhage; pneumonia, hemorrhage, congested, infracted in spleen and liver, glomerµlonephritis in kidney

According to the immuno histochemical staining in the intestine, PED virus is predominantly concentrated in the villi and epithelial cells of crypts This resµlt indicates that intestine samples with matter in lumen are suitable for the diagnosis of PED disease by immunohistochemistry staining method

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Tiêu chảy thành dịch ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea – PED) do một virus thuộc nhóm 1, giống Coronavirus gây ra là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho đàn lợn Virus gây bệnh trên mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu gặp ở lợn con theo mẹ, lợn mắc bệnh có triệu chứng điển hình như nôn, tiêu chảy, lợn nằm chồng lên nhau và thích nằm lên trên bụng mẹ, phân lợn con màu vàng lỏng có chứa sữa chưa tiêu hết, lợn trưởng thành mắc bệnh phân có màu xi-măng, thành ruột mỏng Tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết cao có thể lên đến 100%

Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Châu Âu vào thập niên 1970 và lan sang Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản vào những năm 1980 Năm 1971, một số bệnh dịch cấp tính chưa được biết đến xảy ra trên đàn lợn thịt và lợn nuôi vỗ béo ở nước Anh, với triệu chứng lâm sàng gần giống như bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) (chỉ khác là dịch không xảy ra ở lợn con theo mẹ) TGEV và một

số tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác được loại bỏ Dịch đã lây lan ra khắp châu Âu và được gọi với tên “tiêu chảy thành dịch do virus (Epidemic Viral Diarrhea- EVD) Từ năm 2000 cho đến nay bệnh PED đã được phát hiện ở Thái Lan, Philippin, Việt Nam Lợn ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh nhưng lợn con nhạy cảm nhất với tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết cao

Ở Việt Nam, virus PED được phát hiện tại một số đàn lợn bị tiêu chảy vào năm 2008, gây thiệt hại lớn cho các cơ sở chăn nuôi Từ khi phát hiện PED chưa

có nhiều nghiên cứu sâu về các triệu chứng lâm sàng, đặc điểm bệnh lý để đưa ra các kết luận chắc chắn sự có mặt của PEDV cho công tác chẩn đoán, phát hiện sớm bệnh của cán bộ thú y cơ sở để kịp thời đưa ra biện pháp phòng chống, điều trị bệnh PED tại các cơ sở chăn nuôi Hơn nữa ngày càng nhiều bệnh ghép xảy ra với tốc độ lây lan nhanh, có những triệu chứng lâm sàng, đặc điểm bệnh tích gần giống nhau và giống PED dẫn tới rất khó xác định nguyên nhân của bệnh Vì vậy công tác chẩn đoán, phòng và trị bệnh PED nhanh, chính xác và hiệu quả là hết sức cần thiết để giảm thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi lợn Nghiên cứu về triệu chứng lâm sàng, đặc điểm bệnh lý của bệnh sẽ có ý nghĩa lớn cung cấp nguồn tài liệu phục vụ cho cán bộ thú y cơ sở, cho người chăn nuôi có định hướng bước đầu trong xác định nguyên nhân gây bệnh

Hiện nay, nhiều phương pháp chẩn đoán sự có mặt của virus đã được thiết

lập như RT-PCR, phân lập virus, miễn dịch huỳnh quang, hóa mô miễn dịch Với từng phương pháp chẩn đoán có những ưu điểm riêng, cụ thể phương pháp RT-PCR đã được ứng dụng nhiều trong việc chẩn đoán bệnh tại các phòng thí nghiệm và các trung tâm chẩn đoán bởi có nhiều ưu điểm như nhanh, chính xác,

có thể xét nghiệm số lượng mẫu nhiều mà chỉ cần một lượng nhỏ mẫu bệnh phẩm Với phương pháp hoá mô miễn dịch thì ưu điểm là độ chính xác cao vì nguyên lý của phương pháp là dựa vào sự kết hợp kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu, đặc biệt là với phương pháp này có thể xác định được sự phân bố của virus ở các cơ quan tổ chức, cơ quan từ đó khuyến cáo cho việc lựa chọn mẫu phục vụ cho việc chẩn đoán và nghiên cứu Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh PED Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) trên lợn Landrace và áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Giúp chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh do virus PED gây ra trên lợn 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Đối tượng nghiên cứu là lợn Landrace mắc bệnh tiêu chảy thành dịch

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2016 tới tháng 4/2017

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y – Khoa Thú y + Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Trên cơ sở áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh PED ở lợn sẽ xác định được chính xác sự phân bố của virus PED trong các cơ quan của lợn mắc PED Từ đó khuyến cáo cho việc thu thập mẫu bệnh phẩm phục vụ cho chẩn đoán bệnh

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu sử dụng phương pháp chẩn đoán bằng hóa miễn dịch và có thể chuyển giao kỹ thuật tới các phòng thí nghiệm trong lĩnh vực thú y Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho việc lựa chọn mẫu bệnh phẩm phục vụ cho công tác phân lập virus để sản xuất vacxin phòng và khống chế dịch bệnh do virus PED gây ra giảm thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh PED trong nước

Ở Việt Nam có nghiên cứu của tác giả Toan et al (2011), PED xảy ra lần đầu ở Việt Nam đầu năm 2008 PEDV ở Việt Nam có sự khác biệt cao về một phần trình tự nucleotide của gen S so với các tài liệu đã được công bố như PEDV phân lập ở Châu Âu (Brl/87.CV7770 và ở Hàn Quốc (Spk1, Chinju99, DR13 và KNU -0801) Mối quan hệ của hai gen protein S và M cho thấy PEDV ở Việt Nam giống với dòng virus phân lập ở Trung Quốc (JX -2004 -2 và DX), ở Thái Lan (07NP01, 08NP02 và 08CB01), gần đây ở Hàn Quốc (KNU -0802 và CPF299) Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy PEDV ở Việt Nam có nguồn gốc ở Trung Quốc trải qua di truyền và biến thể nhiều đời hình thành nên một PEDV mới ở Việt Nam

Nghiên cứu của Nguyễn Tất Toàn và cs (2012) đã nghiên cứu và phát hiện virus gây bệnh tiêu chảy cấp (PEDV) trên heo ở các tỉnh miền đông Nam Bộ Bước đầu đã xây dựng kỹ thuật nested RT-PCR để chẩn đoán phân biệt virus gây viêm dạ dày – ruột truyền nhiễm (TGEV) và virus gây dịch tiêu chảy cấp trên heo (PEDV) trong các ổ dịch năm 2008-2010 Trong 284 mẫu ruột và phân được thu thập từ heo con có biểu hiện bệnh đặc trưng của dịch tiêu chảy, kết quả đã cho thấy 41,90% số mẫu dương tính với PEDV Không phát hiện được mẫu dương tính với TGEV Kết quả chẩn đoán cho thấy tỉ lệ mẫu dương tính với PEDV ở ruột (58,14%) cao hơn mẫu phân (16,96%)

Nghiên cứu của Nguyễn Văn Điệp và Nguyễn Thị Lan (2012) đã ứng dụng

kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán bệnh tiêu chảy do virus PED gây ra cho lợn con theo

mẹ nuôi tại huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên Nghiên cứu được tiến hành trên đàn lợn con theo mẹ dưới 10 ngày tuổi Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật RT-PCR

đã cho thấy tất cả những con lợn có các biểu hiện triệu chứng lâm sàng, bệnh tích như : sốt, chán ăn, bỏ ăn, tiêu chảy phân nhiều nước màu vàng xám, có sữa không tiêu, lợn gầy yếu, ủ rũ, mệt mỏi Dạ dày căng phồng chứa thức ăn không tiêu, ruột non căng phồng, thành ruột bị bào mỏng, chứa dịch màu vàng, hạch màng treo ruột sưng to Những con lợn có triệu chứng trên xét nghiệm bằng RT-PCR đều mắc PED

Nguyễn Thị Hoa và cs (2015) đã phân lập được chủng virus PED lưu hành ở phía bắc Việt Nam và xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của các chủng virus PED

2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh PED ngoài nước

Bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn được phát hiện đầu tiên tại nước Anh vào năm 1971 Bệnh xảy ra trên lợn tăng trưởng và vỗ béo với các biểu hiện lâm sàng ở lợn ốm giống hệt như bị nhiễm virus gây viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGEV), chỉ khác một đặc điểm quan trọng đó là lợn con đang bú mẹ không mắc bệnh TGEV và các tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác đã được xác định không phải là nguyên nhân gây ra bệnh trên Sau đó căn bệnh này đã lây lan sang các nước châu Âu và được gọi là bệnh “tiêu chảy thành dịch do virus” (Epidemic viral diarrhea – EVD) Năm 1976 căn bệnh tiêu chảy giống TGE lại xuất hiện nhưng xảy ra trên tất cả lợn ở mọi lứa tuổi, gồm cả lợn con đang trong giai đoạn

bú sữa mẹ, khả năng nguyên nhân gây bệnh là TGEV và các tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác cũng đã được loại trừ Khi đó, tên EVD loại 2 được đưa ra

để phân biệt với EDV loại 1 là bệnh bùng phát năm 1971 với sự khác nhau đó là lợn con đang bú mẹ chỉ mắc EDV loại 2 mà không mắc EDV loại 1

Năm 1978, Coronavirus đã được chứng minh là nguyên nhân gây ra các đợt bùng phát EVD loại 2 Kết quả gây bệnh thực nghiệm cho lợn bằng một chủng virus phân lập được (CV777) cho thấy bệnh tích đường tiêu hoá biểu hiện điển hình trên cả lợn con và lợn vỗ béo Rõ ràng là Coronavirus này liên quan tới

sự bùng phát EVD loại 1 và loại 2, từ đó tên bệnh đã được đổi thành “tiêu chảy thành dịch trên lợn” viết tắt theo tên tiếng anh là PED (Porcine Epidemic Diarrhea)

Các virus này thuộc chi Coronavirus, một virus rất quan trọng trong thú y, gây nhiều dịch bệnh nghiêm trọng trên nhiều loài động vật (Murphy và ctv, 1999) PED do porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) gây ra, được phát hiện đầu tiên ở Anh quốc vào năm 1971, lúc đầu chỉ xảy ra trên heo cai sữa (phân loại

là PED-type I) Năm 1976, PED được quan sát trên heo mọi lứa tuổi đặc biệt ảnh hưởng nặng nề trên heo con theo mẹ (phân loại là PED-type II) PED khó phân biệt với TGE qua triệu chứng lâm sàng và bệnh học Khi bệnh này bùng phát, những nhà chuyên môn mô tả bệnh giống như viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE-like) Tuy nhiên, căn bệnh PEDV được xác định là một Coronavirus khác với virus TGE PED-type I và PED-type II cũng được chứng minh đều do cùng một virus gây ra vào năm 1982

Debouck and Pensaert (1980) đã đặt tên cho virus tiêu chảy cấp là Porcine Epidemic Diarrhea Virus – PEDV dựa trên cơ sở di truyền và kháng nguyên, PEDV được phân loại trong nhóm 1 của giống Coronavirus họ Coronaviridae, cùng với TGEV, Coronavirus gây bệnh cho lợn, mèo

Hiện nay, bệnh đã được xác nhận có mặt ở một số nước châu Âu, Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản (Debouck et al., 1981) Tuy nhiên, ở châu Á, dịch lại xảy ra nghiêm trọng với tỷ lệ tử vong cao trên lợn ở tất cả các lứa tuổi, và không thể phân biệt chúng về mặt lâm sàng với bệnh TGE thể cấp tính

Theo Kocherhans et al (2001) đã được giải trình tự và xác định có chứa 28.033 nucleotide toàn bộ gen CV777 của PEDV Dựa trên trình tự nucleotide của gen sao chép PEDV được xem như là có mối quan hệ gần gũi nhất với Coronavirus người 229E và TGEV

Bridgen et al (1993) xác định trình tự gen protein N quyết định PEDV giữ một vị trí trung gian giữa 229E và TGEV

Debouck et al (1981) đã tìm ra các đặc tính sinh hóa của virus nhạy cảm với ether và chloroform, mật độ của nó trong succarose là 1,18 g/ml Tế bào thích nghi nuôi cấy PEDV phải ổn định trong 50oC, bị mất tác dụng gây nhiễm khi ở nhiệt độ 60oC trong 30 phút Virus sống trong khoảng pH từ 4,0 đến 9,0 ở

4oC và khoảng pH từ 6,5 đến 7,5 ở 37oC

Theo Kweon et al (1997) chỉ ra rằng không có thêm bằng chứng nào chứng

tỏ có hơn một serotype của PEDV Các đoạn polypeptide phân lập được ở Hàn Quốc cho thấy khối lượng phân tử cũng tương tự với dòng nguyên mẫu CV777 Việc nghiên cứu virus PED trong phòng thí nghiệm rất khó khăn đã có rất nhiều loại tế bào được thử nghiệm để nuôi cấy PEDV nhưng vẫn không thành công Các tác giả Hofmann and Wyler (1988) đã tìm ra tế bào Vero (thận khỉ xanh Châu Phi) để hỗ trợ cho công tác nối truyền các đời của PEDV Virus phát triển phụ thuộc vào sự có mặt của trypsin trong môi trường nuôi cấy tế bào Bệnh lý tế bào do virus gây ra là các thể không bào và hợp bào lên tới 100 nhân Sau 15 giờ gây nhiễm virus nhân lên nhanh với hiệu quả cao nhất 105,5 đơn vị tế bào

Từ năm 1982 tới năm 1990, những kháng thể kháng lại PEDV được xác định trong các quần thể lợn tại Bỉ, Hà Lan, Thụy Sỹ, Bungari và Đài Loan (Hofmann and Wyler, 1988) Ở vùng Đông Bắc Ấn Độ 21,2% trong số 528 mẫu

huyết thanh của lợn từ 2-6 tháng tuổi dương tính với kháng thể PEDV Virus đã được phân lập ở hầu hết các nước chăn nuôi lợn tại Châu Âu cũng như ở Trung Quốc Hiện chưa có báo cáo nào công bố về bùng phát PED ở vùng Bắc và Nam Mỹ

Ở châu Âu, sự bùng phát PED ít xảy ra và gần đây những báo cáo nghiên cứu về sự lưu hành cũng như chẩn đoán PED ít được thực hiện

Tại Hà Lan, một nghiên cứu về virus học lâm sàng ở các ca PED cấp tính trong một trại chăn nuôi cả lợn thịt, lợn giống đã được thực hiện Kết quả cho thấy tiêu chảy trầm trọng nhất xảy ra trên lợn vỗ béo và lợn nái sinh sản với lợn con theo mẹ và sau cai sữa, bệnh biểu hiện nhẹ hơn hoặc không biểu hiện Bệnh sau đó trở thành dịch địa phương tồn tại ở tuổi 6-10 tuần và ở lợn hậu bị mới nhập vè trong thời gian ít nhất 1,5 năm kể từ khi bệnh bùng phát lần đầu tiên

Ở Tây Ban Nha, PED đã được xác nhận là nguyên nhân gây dịch tiêu chảy địa phương tại 7 trong số 15 trại, với triệu chứng tiêu chảy kéo dài trên một số lợn nái tại một trại Một khảo sát huyết thanh học đã được thực hiện từ năm 1992-1993 cho thấy 1513 trong số 5052 lợn nái có kháng thể đặc hiệu kháng PEDV, chiếm 55% trong số 803 trại giống theo dõi (Carvajal et al., 1995)

Ở Bỉ, một nghiên cứu về huyết thanh học trên các trại lợn nuôi vỗ béo cho thấy 50% trại kiểm tra dương tính với PEDV năm 1993 Tuy nhiên không có trại nào dương tính khi kiểm tra lại vào năm 1997, điều này chỉ ra rằng trong những năm gần đây mức độ lưu hành của virus đã giảm đáng kể (Pensaert, 1998)

Ở Anh, PED bùng phát lần đầu năm 1998 kéo dài trên 2 tháng, bệnh xảy ra

ở 3 lứa lợn liên tiếp trong giai đoạn 8-15 tuần tuổi tại một trại nuôi hướng thịt

Ở Hungari, năm 1995 có 5,5% trong số 92 mẫu lợn cai sữa thu từ 19 trại kiểm tra dương tính với PEDV và virus này được xác định là căn nguyên quan trọng nhất gây ra tiêu chảy ở lợn sau cai sữa

Ở Cộng Hòa Séc, 27 trong số 219 mẫu phân thu được từ lợn tiêu chảy ít hơn 21 ngày tuổi dương tính với PEDV, lợn thường bị ghép với các virus gây ra tiêu chảy khác (Rodak et al., 2005)

Khác với tình trạng hiện nay ở Châu Âu, dịch tiêu chảy xảy ra rất trầm trọng với tỷ lệ cao gần đây đã được báo cáo ở khu vực Châu Á Các đợt bùng phát xảy ra ở dạng cấp tính rất nghiêm trọng, rất khó phân biệt về mặt lâm sàng với bệnh TGE ở thể cấp tính

Ở Nhật Bản, những đợt dịch bùng phát vào tháng 9 năm 1993 và tháng 6 năm 1994 đã làm 1400 lợn chết với tỷ lệ 30-100% ở lợn con theo mẹ Trong suốt thời gian xảy ra dịch bệnh, lợn trưởng thành chỉ có biểu hiện chán ăn một thời gian ngắn và lợn nái giảm sản lượng sữa (Sueyoshi et al., 1995) Mùa đông năm

1996, một đợt PED đã xảy ra ở 108 trại lợn tiêu chảy chủ yếu gặp ở lợn con và

39500 trong số 56256 lợn con mắc PED đã chết

Cũng tại Nhật Bản, Shibata et al (2000) đã nghiên cứu thành công sự nhân lên của virus PED trong tế bào bàng quang và thận lợn Tiếp theo đó Kadoi và et al., (2002) đã phân lập được dòng P-5V sử dụng như một chủng vacxin nuôi cấy trong tế bào dòng lợn KSEK6 và IB-RS2

Ở Hàn Quốc, PED đã gây tiêu chảy trên lợn ở tất cả lợn ở mọi lứa tuổi Trong 71 ca bệnh đường tiêu hóa do virus được chẩn đoán tại Viện nghiên cứu Thú y, từ tháng 1 năm 1992 tới tháng 12 năm 1993 có 56,33% ca được xác định

là PED trong đó lợn con dưới 10 ngày tuổi chiếm tới 90% số ca mắc bệnh

Từ tháng 8 năm 1997 tới tháng 7 năm 1999 có 1258 ca bệnh đường ruột ở lợn xảy ra tại 5 tỉnh thành trong đó có 50,4% được xác định là PED (Chae et al., 2000) Một khảo sát huyết thanh học tại các cơ sở giết mổ tại Hàn Quốc cho thấy trong số 469 mẫu huyết thanh thu từ 7 tỉnh có 17,6 – 79% (trung bình 45%) là dương tính với PEDV, điều này cho thấy virus đã trở thành dịch địa phương tại một số vùng Từ những kết quả nghiên cứu được, một số ý kiến cho rằng tình trạng mắc PED ở Châu Á tiến triển trong thời gian gần đây phản ánh bệnh mang tính địa phương rõ hơn khi lưu hành trong quần thể nái phần nào đã

có miễn dịch

Tại Hoa Kỳ ngày 17/5/2013, Sở Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) đã công bố phát hiện PED lần đầu tiên tại Hoa Kỳ Đến năm 2014 đã chứng kiến PED hoành hành trên khắp 30 tiểu bang của nước này

2.2 MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS GÂY BỆNH PED

2.2.1 Phân loại và hình thái của virus gây bệnh PED

Dựa trên đặc điểm kháng nguyên và di truyền, virus PED (PEDV) được xếp vào chi Coronavirus, họ Coronaviridae, cùng với TGEV, coronavirus ở mèo, chó

và coronavirus 229E ở người Hạt PEDV mang những điểm đặc trưng của họ Coronaviridae Theo phân loại về huyết thanh học, người ta xác định vius PED hiện mới chỉ có 1 serotype Các chủng PEDV phân lập từ châu Âu, Hàn Quốc và

Trung Quốc đều tương đồng về mặt huyết thanh với với chủng CV777 phân lập

từ thực địa ở Bỉ năm 1978

Hình thái của PEDV trong tế bào biểu mô đường tiêu hoá tương tự như các coronavirus khác (Ducatelle et al., 1982) Virus có một nhân đậm đặc điện tử với quầng sáng ở giữa và những phần toả ra từ nhân dạng chuỳ dài xấp xỉ 20nm Hạt virus xác định từ mẫu phân có hình thái đa dạng và đường kính biến đổi từ 90 đến 190 nm (hình 1, 2) (Pensaert et al., 1981) Virus nhân lên thông qua việc nảy chồi từ các màng bên trong bào tương tế bào vật chủ

Hình 2.1 Những không bào trong bào

tương của một tế bào hấp thu ở ruột non

lợn, chứa các hạt virus PED có đường

Nguồn:http://ars.elscdn.com/content/image/1- s2.0-S0264410X99000596-gr1.jpg

2.2.2 Cấu trúc phân tử của virus gây bệnh

PEDV có cấu trúc giống với các virus khác trong họ, có đường kính khoảng

95 – 190nm, có một lớp bề mặt hình dùi cui nhô ra dài khoảng 18-23nm, là virus

có vỏ bọc Nhân có cấu trúc là RNA sợi đơn, kích thước 27 – 32kb

PEDV mang glycoprotein S (Spike) có khối lượng phân tử 180.000 – 200.000 dalton, protein màng M (Membrane) có khối lượng phân tử 27.000 – 32.000 dalton và protein N (Nucleocapsid) có khối lượng phân tử 57.000 – 58.000 dalton Virus không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu

Hiện nay người ta mới chỉ phát hiện được 1 serotyp PEDV Có 2 chủng virus PED:

- Chủng PED 1 (ở châu Âu): Chỉ nhiễm trên lợn trong giai đoạn tăng trưởng

- Chủng PED 2 (ở châu Á): Nhiễm trên tất cả các loại lợn, kể cả lợn nái trưởng thành

Về đặc điểm cấu tạo phân tử, PEDV là virus có vỏ bao bọc, bộ gen là sợi RNA đơn dương, kích thước khoảng 28kb với mũ 5’ và đuôi polyA 3’ Bộ gen của virus gồm một vùng không dịch mã đầu (UTR) 5’, một UTR đầu 3’, ít nhất 7 khung đọc mở (ORF) mã hoá cho 4 protein cấu trúc gồm gai (S), vỏ (E), màng (M), và nucleocapsid (N) và 3 protein không cấu trúc (enzym tái bản replicases 1a, 1b và ORF3) Những khung đọc mở này được sắp xếp theo trình tự: 5’-replicase (1a, 1b) – S – ORF3 – E – M – N – 3’

Gen polymerase gồm 2 khung đọc mở (Open Reading Frame – ORF) 1a

và 1b, chiếm 2/3 bộ gen tính từ đầu 5’ và mã hoá cho các polyprotein tái bản không cấu trúc (replicase 1a và 1b) Các gen mã hoá cho protein cấu trúc chính như S (150-220 kDa), E (7kDa), M (20-30kDa) và N (58kDa) nằm ở vị trí tiếp nối gen polymerase Gen ORF3 là một gen phụ trợ, nằm giữa các gen cấu trúc

Nó mã hoá cho một protein bổ trợ, số lượng và trình tự của các gen thay đổi ở các coronavirrus khác nhau (hình 2.3) (Murphy et al., 1999)

Hình 2.3 Mô hình cấu trúc bộ gen virus PED

Protetin cấu trúc của PEDV tương tự như các coronavirus khác Virus có một protein gai (S) với trọng lượng phân tử khoảng 180-200 kDa, một protein màng (M) 27-32 kDa, một protein nucleocapsid gắn với RNA nặng 57-58 kDa (Duarte and Laude, 1994)

Protein S của PEDV là glycoprotein loại 1 gồm 1383 amino acid (aa) Nó chứa một chuỗi peptid tín hiệu (1-18aa), các epitop trung hoà (499-638, 748-755), 764-771, và 1368-1374), một vùng xuyên màng (1334 – 1356), và một vùng ngắn nằm trong bào tương Protein S cũng có thể được chia thành vùng S1 (1-789 aa) và vùng S2 (790-1383 aa) dựa trên tính tương đồng của nó ở coronavirus khác nhau Giống như các protein S của coronavirus khác, protein S của PEDV là một loại gai glycoprotein (kháng nguyên bề mặt) trên bề mặt virus, chúng đóng vai trò quan trọng trong việc điều hoà tương tác với các glycoprotein thụ thể đặc hiệu trên tế bào vật chủ trong quá trình xâm nhập, kích thích tạo kháng thể trung hoà ở vật chủ tự nhiên Ngoài ra, glycoprotein S cũng liên quan tới sự thích nghi sinh trưởng trong điều kiện phòng thí nghiệm và sự giảm độc lực khi gây bệnh trên động vật (Park et al., 2007) Để đạt kết quả tốt hơn, cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc virus PEDV để làm rõ mối quan hệ

di truyền, sự đa dạng về chủng, tình trạng dịch tễ học của PEDV trên thực địa và mối quan hệ giữa các dạng đột biến với chức năng của virus

Protein M là thành phần vỏ lớn nhất của virus PED, glycoprotein cấu trúc màng với một đầu tận cùng gắn amin ngắn phía ngoài virus và một đầu tận cùng gắn carboxy ở bên trong Protein M không chỉ đóng vai trò quan trọng trong chu trình lắp ráp virus mà còn trong việc tạo ra kháng thể trung hoà virus với sự có mặt của bổ thể Protein M có thể đóng một vai trò trong quá trình tạo ra α-interferon (α-IFN Việc đồng thời biểu hiện protein M và N cho phép tạo thành các hạt giả virus có khả năng biểu lộ hoạt tính sinh interferon tương tự như hạt virus hoàn chỉnh Việc tiến hành thêm các nghiên cứu về glycoprotein M sẽ làm tăng thêm hiểu biết của chúng ta về mối quan hệ di truyền, sự đa dạng giữa các chủng PEDV và tình trạng dịch tễ của PEDV trên thực địa

Protein N là một phosphoprotein cơ bản gắn với RNA virus, cung cấp nền tảng cấu trúc cho các nucleocapsid xoắn kép Các epitop protein N được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra miễn dịch trung gian tế bào protein N có thể được sử dụng như một mục tiêu cho chẩn đoán sớm và chính xác PEDV

2.2.3 Tính chất nuôi cấy

PEDV có thể nhân lên khi gây bệnh thực nghiệm bằng cách cho lợn con uống virus PEDV có khả năng thích ứng kém trong điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm Người ta đã thử nghiệm nuôi cấy virus trên nhiều loại tế bào nhưng rất ít thành công Đến nay, tế bào Vero có thể cấy chuyển được PEDV, gây bệnh tích

tế bào; tuy nhiên, sự phát triển của virus phụ thuộc vào sự có mặt của trypsin trong môi trường nuôi cấy Hiệu giá virus đạt tối đa sau khi nuôi cấy 15 giờ Ngoài ra, một số loại tế bào có thể nuôi cấy virus như tế bào túi mật lợn và tế bào thận lợn

2.2.4 Sức đề kháng của virus gây bệnh PED

Về đặc tính lý hoá, virus mẫn cảm với ether, chroroform và không gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài Tỷ trọng của nó trong đường sucose là 1,18 mg/ml

PEDV bền ở khoảng pH 5,0 – 9,0 ở 4˚C và pH từ 6,5 – 7,5 ở 37˚C (Callebaut

et al., 1982) Virus PED đã thích ứng với môi trường nuôi cấy bị mất khả năng lây nhiễm khi đun chúng tới 60˚C trong 30 phút, nhưng chúng khá bền ở 50˚C

2.2.5 Truyền nhiễm học

+ Loài vật mắc bệnh

Bệnh xảy ra ở loài lợn Lợn có thể mắc ở mọi lứa tuổi Trong nhiều ổ dịch

tỷ lệ lợn ốm lên đến 100%, tỷ lệ chết trung bình ở lợn con là 50% nhưng cũng có thể rất cao đến 100%

- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 0 - 5 ngày tuổi: tỷ lệ chết 100%

- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 6 - 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 50%

- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi > 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 30% + Phương thức truyền lây của virus PED

Về phương thức truyền lây, đường phân có thể là phương thức chủ yếu để virus truyền sang vật chủ khác PED thể cấp tính thường xảy ra ở thời điểm 4-5 ngày sau khi lợn được bán hoặc mua về Virus có thể xâm nhập vào trại thông qua lợn nhiễm virus được chuyển về hoặc các dụng cụ có mang virus như xe tải, ủng PEDV không khác nhiều với TGEV về đường truyền lây, nhưng virus này

có vẻ tồn tại lâu hơn trong các trang trại sau khi dịch PED cấp tính đã qua đi Khi dịch xảy ra ở trại lợn sinh sản, virus có thể được bài thải từ đàn mắc bệnh hoặc trở thành dịch địa phương Một chu kỳ dịch địa phương có thể được hình thành nếu số lứa lợn được sinh ra và cai sữa trong trại đủ lớn để duy trì sự lưu hành của

virus thông qua việc lây nhiễm giữa các lứa kế tiếp nhau khi lợn con mất khả năng miễn dịch lúc cai sữa PEDV có thể gây ra tiêu chảy dai dẳng trên lợn con sau cai sữa ở những trại như vậy (Nguyễn Văn Điệp và Nguyễn Thị Lan, 2012) + Cơ chế gây bệnh

Cơ chế sinh bệnh của PED được nghiên cứu trên lợn con không được uống sữa đầu Cho lợn con 3 ngày tuổi uống virus PED chủng CV777 (Debouck

et al., 1981) sau khoảng 22 đến 36 giờ lợn bắt đầu nôn và tiêu chảy Vị trí và sự nhân lên của virus được xác định thông qua kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang và kính hiển vi điện tử PEDV nhân lên trong bào tương của các tế bào lông nhung, phá huỷ các tế bào biểu mô và làm ngắn lông nhung niêm mạc ruột, tỷ lệ chiều cao giữa lông nhung và tuyến ruột có thể giảm từ 7:1 xuống còn 3:1 (Pospischil

et al., 1981) Các tế bào biểu mô hấp thu ở lông nhung rất mẫn cảm với PEDV, những tế bào biểu mô nhiễm virus có thể được quan sát sau 12-18 giờ gây nhiễm, rõ nhất sau khoảng 24 đến 36 giờ, tuy nhiên không quan sát thấy có sự phá hủy tế bào biểu mô ở kết tràng Đặc điểm sinh bệnh của PEDV ở ruột non của lợn con rất giống với TGEV So với TGEV, sự nhân lên và lây lan trong ruột non của virus PED diễn ra chậm hơn và thời gian nung bệnh lâu hơn

Virus Nhiễm vào miệng

Nhân lên biểu mô ruột non, dạ dày

Phá hủy hệ thống lông nhung ruột

Giảm hoạt động của Enzyme

bề mặt biểu mô ruột

Hội chứng giảm hấp thu (mất nước nặng, chết)

Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn chưa được nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể quan sát thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự nhiên hoặc được gây nhiễm Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh nặng hơn hay không vẫn chưa được rõ Hiện vẫn chưa có cơ chế thích hợp nào được đưa ra để lý giải hiện tượng lợn chết đột ngột kèm theo việc hoại tử cơ lưng cấp tính quan sát thấy ở lợn vỗ béo và lợn trưởng thành (Nguyễn Văn Điệp và Nguyễn Thị Lan, 2012)

có biểu hiện tiêu chảy và lợn mới nhập về thường phát bệnh

Một báo cáo khác cho thấy, tại một trại nuôi lợn thịt mới nhập lợn về từ nhiều nguồn khác nhau hoặc trong giai đoạn nuôi vỗ béo, nếu PED bùng phát ở thể cấp tính, trong vòng một tuần, tất cả lợn sẽ có biểu hiện tiêu chảy Lợn có biểu hiện chán ăn, mệt mỏi, phân rất loãng, chứa nhiều nước Biểu hiện về mặt lâm sàng ở lợn mắc PED đang trong giai đoạn nuôi vỗ béo có thể nặng hơn so với mắc TGE Lợn thường có biểu hiện đau vùng bụng nhiều hơn Sau khoảng 7-

10 ngày, lợn sẽ hồi phục Tỷ lệ tử vong ở lợn trong giai đoạn vỗ béo thường từ 3%, lợn chết nhanh, thường ở giai đoạn mới bắt đầu tiêu chảy hoặc trước khi có biểu hiện tiêu chảy Bệnh tích đại thể thông thường ở những lợn này là hoại tử cấp tính ở cơ lưng Tỷ lệ chết cao nhất được thấy ở những trại có lợn giống mẫn cảm và chịu nhiều stress (Nguyễn Văn Điệp và Nguyễn Thị Lan, 2012)

1-2.2.6.2 Bệnh tích

Bệnh tích đại thể và vi thể của lợn mắc PED tương tự như ở bệnh TGE

Dạ dày trống rỗng do lợn nôn, và ống dưỡng chấp không chứa nhiều dịch dưỡng

do sự kém hấp thu ở ruột Các đoạn ruột non chứa đầy dịch, căng phồng, thành ruột mỏng tới mức có thể nhìn thấy do sự teo lại của tầng niêm mạc Chất chứa trong ruột non lợn cợn Ngoài các bệnh tích tương tự như TGE, sự hoại tử cấp ở

cơ lưng cũng được báo cáo

Lợn con đang theo mẹ chết do PED, xác gầy, khô do tiêu chảy nặng, phần mông dính nhiều phân vàng Ruột căng phồng, đầy dịch, màu vàng, chứa những cục sữa chưa tiêu Ngoài ra còn thấy thành ruột mỏng và trong suốt có thể do lông nhung bị bào mòn, xuất huyết, chứa nhiều chất lỏng thối, hạch ruột sưng thủy thũng, đặc biệt là ở không tràng và hồi tràng, dẫn theo Đào Trọng Đạt và cs., 1995) Hạch lâm ba màng treo ruột xuất huyết nhẹ Lát cắt ngang ruột non của lợn bị nhiễm virus PED Lông nhung ruột non của lợn bị ngắn lại

Về mặt vi thể, sự hình thành không bào to, rõ trong bào tương tế bào biểu

mô và sự bong tróc của các tế bào này làm cho lông nhung ngắn và dồn lại, hoà lẫn vào nhau rõ rệt, tuy rằng các biểu hiện này không trầm trọng bằng TGE Ở kết tràng, chưa có bệnh tích vi thể nào được báo cáo Điều thú vị là các nghiên cứu siêu vi thể đã cho thấy có sự hiện diện rõ rệt của các hạt virus bên trong bào tương tế bào và sự thay đổi tế bào ở các tế bào biểu mô ruột non và kết tràng (Ducatelle et al., 1982) Những sự thay đổi cấu trúc siêu vi thể được khởi đầu đặc trưng bằng sự mất đi của các bào quan, vi nhung, lưới tận và phần nhô ra của bào tương tế bào hấp thu vào trong xoang ruột Sau đó, các tế bào trở nên dẹt hơn, liên kết vòng bịt giữa các tế bào biểu mô mất đi và tế bào được giải phóng vào bên trong lòng ống ruột

2.2.7 Chẩn đoán

Chẩn đoán PEDV ở lợn hoặc nhóm lợn con theo mẹ khi có đủ 3 tiêu chuẩn sau :

- Sự xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng như ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn, còi cọc, lợn con thích nằm trên nhau hoặc nằm lên trên bụng mẹ, xuất hiện triệu chứng tiêu chảy, phân lỏng màu vàng

- Có các tổn thương mô bệnh học bao gồm: sung huyết, lông nhung bị phá hủy, tăng sinh các nang lympho, thoái hóa tế bào ở ruột non, gan, thận, phổi

- Tìm thấy kháng nguyên PEDV trong các mô tổn thương

+ Chẩn đoán lâm sàng

Dựa vào triệu chứng : lợn con tiêu chảy với tỷ lệ chết cao, lợn con thích nằm

trên bụng mẹ, điều trị bằng các loại kháng sinh không có kết quả, tỷ lệ chết đối với lợn dưới 5 ngày tuổi lên đến 100%

Lợn trưởng thành có dấu hiệu nôn mửa, uống nước nhiều, tiêu chảy, phân lỏng màu xi măng

Bệnh tích khi mổ khám: Hạch bẹn nông và hạch màng treo ruột sưng, xuất huyết, ruột căng phồng, chứa nhiều dịch màu vàng, thành ruột mỏng dính, gan sưng túi mật căng

+ Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

- Để tìm virus trong phân, có thể sử dung phương pháp soi trực tiếp dưới kính hiển vi điện tử, tuy nhiên việc quan sát hạt virus sẽ rất khó khăn

- Chẩn đoán huyết thanh học:

Để chẩn đoán chính xác PED không thể chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng do rất dễ nhầm lẫn với TGE Sử dụng phương pháp chẩn đoán miễn dịch huỳnh quang hoặc hóa mô miễn dịch có thể cho kết quả tương đối nhanh, chính xác Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán là ruột non của lợn được giết khi mới bị tiêu chảy (tốt nhất trong 2 ngày đầu bị bệnh) Nếu bệnh phẩm của lợn bị chết tự nhiên thì kết quả lại không đáng tin cậy

- Chẩn đoán bằng phương pháp RT – PCR:

Phương pháp RT-PCR: bao gồm các bước tách chiết RNA của virus và các bước thực hiện kỹ thuật RT- PCR RNA của virus được tách chiết bằng kit QIAamp để tiến hành phản ứng RT- PCR Quy trình tách chiết RNA của virus theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit RNA được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm của lợn nghi mắc PEDV được trộn với hỗn hợp RT-PCR của bộ kit One step RT-PCR kit (invitrogen) Cặp mồi được sử dụng cho phản ứng RT-PCR gồm mồi

5’-CATATGCAGCCTGCTCTGAA- 3’ nhằm khuyếch đại đoạn gen ORF5 dài 651

bp Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR với 35 chu kỳ Điện di kiểm tra kết quả RT-PCR ở hiệu điện thế 100 V trong 30 phút Quan sát kết quả điện di sản phẩm RTPCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh

Hình 2.4 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR

Hiện nay, một số kit ELISA đã được phát triển để xác định kháng nguyên PEDV có trong phân của lợn cũng như xác định sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh

Ngoài ra có thể dùng test chẩn đoán nhanh bệnh PED Test chẩn đoán nhanh khá tiện dụng bởi chúng có thể được sử dụng ngay tại trang trại dùng phát hiện protein S của PEDV với tốc độ nhạy 92% và độ đặc hiệu 98% Kỹ thuật này tuy ít chính xác hơn RT- PCR nhưng lại cho phép có được kết quả chẩn đoán nhanh chi trong 10 phút Với nguyên lý là phản ứng miễn dịch sắc ký, bản chất là phản ứng bắt cặp giữa kháng nguyên và kháng thể bằng phương pháp sắc ký nhằm xác định có kháng nguyên PEDV trong mẫu thử nghiệm hay không Do đó,

nó đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần kết quả chẩn đoán nhanh, chính xác để kịp thời đưa ra những quyết định, chính sách liên quan đến công tác kiểm dịch bệnh và giết mổ động vật

- Mục đích xác đinh sự có mặt của virus PEDV trên lợn nhiễm bệnh

- Mẫu kiểm tra : huyết thanh, huyết tương, phân

- Tăng cường kiểm soát người và các phương tiện ra vào trại đặc biệt là các xe và người vào bắt lợn, mua lợn, đây là nguyên nhân chính làm lây lan dịch bệnh

- Có hàng rào ngăn cách giữa trong và ngoài trại, xe vào bắt lợn không được vào trong trại mà phải đỗ ở ngoài trại đúng nơi quy định

- Xe vận chuyển trong trại sau khi vận chuyển lợn phải được rửa, sát trùng,

để khô mới được vận chuyển lợn tiếp

- Có chuồng bán lợn nằm sát vòng ngoài của trại

- Cấm đưa lợn từ khu vực bán trở về trại

- Không cho nước thải của chuồng bán chảy ngược về trại

- Người lao động không nên tiếp xúc với lợn khác ngoài khu vực làm việc của mình

- Hạn chế khách tham quan nếu không thật sự cần thiết

- Làm vệ sinh lối đi thường xuyên, có hố sát trùng ở cửa ra vào chuồng

Theo Shibata and Masaaki (2001), cho lợn sơ sinh uống lòng đỏ trứng gà hoặc sữa đầu của bò chứa globµlin miễn dịch chống lại PEDV sẽ giúp làm giảm

tỷ lệ chết

+ Phòng bệnh bằng vắc-xin

Tiêm vắc-xin được báo cáo là cải thiện tăng trọng bình quân trên ngày

và chuyển đổi thức ăn, giảm chi phí thuốc men và giảm lượng virus và tổn thương do PEDV gây ra Ở lợn nái tiêm vacxin làm tăng chất lượng đàn lợn con

sự xâm nhiễm PEDV giúp phòng chống lại sự bài thải virus khi lợn tiếp xúc với virus cường độc Khi cho lợn con uống PEDV nhược độc, miễn dịch tạo được chỉ phần nào bảo vệ được chúng trước các chủng cường độc, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy mức độ bảo hộ liên quan mật thiết tới liều virus được uống

Tuy nhiên thực trạng hiện nay là việc sử dụng các vắc-xin như trên tại nước

ta không được quan tâm nhiều Một số cơ sở chăn nuôi có biện pháp tự tạo miễn dịch cho lợn con bằng cách cho lợn mẹ ăn ruột của lợn con trước khi đẻ cũng là biện pháp phòng bệnh hiệu quả:

- Lấy ruột 2 – 3 lợn con có triệu chứng ỉa chảy do PED đang còn sống, chưa được điều trị bằng thuốc, có độ tuổi <5 ngày tuổi, cho vào máy xay sinh tố, xay nhỏ

- Trộn hỗn hợp xay với 1.000ml nước cất Lọc qua bằng vải gạc, lấy phần nước trong, cho vào 100g colistin để diệt tạp khuẩn Đem dung dịch trên trộn với thức ăn trong toàn trại cho lợn nái, lợn hậu bị ăn (mỗi con 10ml) Sau khi ăn nếu

lợn con có triệu chứng ỉa chảy, nôn mửa, bỏ ăn là đạt yêu cầu, nếu không có thì phải làm lại

+ Sau 2 tuần kháng thể mới xuất hiện, vì vậy đối với lợn nái mang thai tuần

15 – 16, lợn con sinh ra vẫn chết vì PED

+ Nếu phát hiện, xử lý nhanh thì sâu 3 tuần lợn trong toàn trại sẽ có miễn dịch (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2011)

2.3 SƠ LƯỢC VỀ HÓA MÔ MIỄN DỊCH

Ngày nay hoá mô miễn dịch đã trở thành một kĩ thuật chủ yếu và được sử dụng rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm, đặc biệt là trong y học (chẩn đoán lâm sàng) (IHC world, 2005) Đây là phương pháp được sử dụng kết hợp giữa nhiều lĩnh vực như giải phẩu, miễn dịch và hóa sinh Phương pháp hóa mô miễn dịch được sử dụng để chẩn đoán bệnh, phát triển thuốc và nghiên cứu sinh học

Sử dụng chỉ điểm khối u cụ thể, các bác sĩ sử dụng phương pháp hóa mô miễn dịch để chẩn đoán một ung thư lành tính hoặc ác tính, xác định giai đoạn và đoạn của ung thư, và xác định các loại tế bào và nguồn gốc của di căn để tìm hệ thống khối u nguyên phát Phương pháp hóa mô miễn dịch cũng được sử dụng trong việc phát triển thuốc để kiểm tra hiệu quả của thuốc bằng cách phát hiện hoạt động hoặc các mục tiêu của bệnh

2.3.2 Nguyên lý

Theo IHC world (2005) hoá mô miễn dịch là phương pháp định vị kháng nguyên hay protein trên mặt cắt của mô bằng cách sử dụng kháng thể đã được đánh dấu như là thuốc thử đặc hiệu Phương pháp này dựa trên cơ sở tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể có thể nhìn thấy bằng cách sử dụng các chất đánh dấu như thuốc nhuộm màu huỳnh quang, enzyme hoặc chất keo vàng

2.3.3 Kháng nguyên (antigen)

Theo Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương (2009), kháng nguyên (antigen) là những chất khi có mặt trong cơ thể động vật có khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch và sau đó kết hợp đặc hiệu với sản phẩm của đáp ứng này (kháng thể dịch thể hoặc kháng thể tế bào)

Bản chất hóa học của kháng nguyên thường là những đại phân tử protein Polysaccharide, các polypeptide tổng hợp và những polypeptide khác cũng là kháng nguyên trong những điều kiện thích hợp (Stites et al., 1987)

Trong một phân tử kháng nguyên có một phần cấu trúc đặc biệt mà chính

nó được nhận biết bởi hệ thống miễn dịch, được gọi là nhóm quyết định kháng nguyên hay epitope Epitope không những quyết định tính sinh kháng thể đặc hiệu tương ứng mà còn là vị trí để kháng thể đó kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên Như vậy, tính đặc hiệu của kháng nguyên không phải do cấu trúc của toàn bộ phân tử kháng nguyên quyết định mà chỉ do những epitope

2.3.4 Kháng thể (antibody)

Theo Boenisch (2002) kháng thể thuộc nhóm protein gọi là globµlin miễn dịch (Immunoglobµlin - Ig) Globµlin miễn dịch gồm 5 nhóm chính, được xếp theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE Trong đó, IgG và IgM thường được dùng trong hóa mô miễn dịch

Hình 2.6 Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng

+ Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies): là một hỗn hợp không đồng nhất của các kháng thể trực tiếp chống lại các epitope khác nhau của cùng một kháng nguyên Các kháng thể này được tạo ra bằng cách nhân dòng vô tính tế bào B khác nhau ở động vật và kết quả là hóa miễn dịch khác nhau Kháng thể đa dòng dễ sản xuất hơn kháng thể đơn dòng nhưng có khuyết điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dòng vẫn có thể chứa những kháng thể phản ứng không đặc hiệu với kháng nguyên

+ Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): là một số lượng lớn đồng nhất các globµlin miễn dịch trực tiếp chống lại một epitope duy nhất Các kháng thể được tạo ra bằng cách nhân dòng vô tính một dòng tế bào B từ một động vật nên tương đồng về hóa miễn dịch Ưu điểm của kháng thể đơn dòng là độ đồng nhất cao, rất tinh khiết và đặc hiệu

2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến kháng thể

Độ pha loãng kháng thể: tùy thuộc vào phương pháp, thời gian ủ và nhiệt

độ Kháng thể được pha loãng ở nồng độ thích hợp và không đổi sẽ nâng cao chất lượng nhuộm Người ta thường xác định nồng độ thích hợp bằng cách đầu tiên chọn một thời gian ủ cố định, sau đó thử nghiệm với một lượng nhỏ kháng thể ứng với một chuỗi các nồng độ pha loãng thử nghiệm Độ pha loãng cao nhất và

pH duy trì phản ứng miễn dịch mạnh nhất được gọi là độ pha loãng tối ưu (Boenisch, 2002)

Thời gian ủ: thường trái ngược với độ chuẩn của kháng thể, độ chuẩn càng cao thì thời gian ủ để có kết quả tối ưu càng ngắn Tuy nhiên trên thực tế thường thì người ta đưa ra một thời gian ủ thích hợp trước khi xác định độ pha loãng tối ưu Nồng độ kháng thể đặc hiệu càng cao thì thời gian ủ càng ngắn (Boenisch, 2002) Nhiệt độ ủ: Trạng thái cân bằng trong phản ứng kháng nguyên - kháng thể đạt được nhanh ở 370C Với nhiệt độ ủ khá cao ta có thể rút ngắn thời gian ủ và tăng độ pha loãng kháng thể Tuy nhiên không thể biết được là nhiệt độ chỉ thúc đẩy phản ứng đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể hay kích ứng tất cả những phản ứng nền

Để phát triển kĩ thuật hóa mô miễn dịch chẩn đoán PED, chúng tôi quan tâm tới độ pha loãng kháng thể và nồng độ dung dịch DAB

2.3.6 Các phương pháp nhuộm

Có nhiều phương pháp hoá mô miễn dịch dùng để định vị kháng nguyên nên việc lựa chọn phương pháp thích hợp dựa trên các thông số như loại mẫu vật

và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005)

a Phương pháp trực tiếp (Direct method): là phương pháp nhuộm có một bước và gồm kháng thể được đánh dấu phản ứng trực tiếp với kháng nguyên trên lát cắt mô Kỹ thuật này chỉ sử dụng một kháng thể và quy trình đơn giản và tiến hành nhanh tuy nhiên phản ứng chỉ gồm một kháng thể đánh dấu nên tín hiệu thu được rất ít và không đủ nhạy để đáp ứng nhu cầu ngày nay

b Phương pháp gián tiếp (Indirect method): gồm kháng thể sơ cấp không

gắn nhãn (lớp đầu tiên) phản ứng với kháng nguyên ở trên mô, và kháng thể thứ cấp có gắn nhãn (lớp thứ hai) phản ứng với kháng thể sơ cấp (Lưu ý: kháng thể thứ cấp phải chống lại IgG của loài động vật mà tạo ra kháng thể sơ cấp) Phương pháp này có độ nhạy cao hơn do tín hiệu khuếch đại thông qua các phản ứng của kháng thể thứ cấp với các vị trí kháng nguyên khác nhau trên kháng thể sơ cấp Ngoài ra, nó còn tiết kiệm cho nền kinh tế khi kháng thể thứ cấp có thể sử dụng được với nhiều loại kháng thể sơ cấp (khi được chế cùng một loài) với nhiều kháng nguyên khác nhau Kháng thể thứ cấp có thể được đánh dấu với một loại enzyme như peroxidase, phosphatase kiềm hay glucose oxidase, và được gọi là phương pháp miễn dịch enzyme gián tiếp

c Phương pháp PAP (peroxidase anti-peroxidase): Là phương pháp phát triển của kỹ thuật gián tiếp và nó gồm lớp thứ 3 là kháng thể thỏ với peroxidase, cùng với peroxidase tạo nên phức hợp peroxidase anti-peroxidase rất ổn định Phức hợp này gồm GABA-globµlin thỏ và peroxidase, hoạt động như một kháng nguyên thứ ba và bị ràng buộc nên không tiếp hợp với kháng GABA-globµlin thỏ trên dê của lớp thứ 2

d Phương pháp Avidin-Biotin Complex (ABC): là phương pháp IHC tiêu chuẩn và là một kỹ thuật hay được sử dụng rộng rãi để nhuộm hóa mô miễn dịch Avidin, một glycoprotein lớn, có thể gắn với peroxidase hay fluorescein và nó có

ái lực cao với biotin Biotin là vitamin có trọng lượng phân tử thấp, có thể được kết hợp với nhiều phân tử sinh học như kháng thể Kỹ thuật này gồm 3 lớp Lớp đầu tiên là kháng thể sơ cấp không gắn nhãn Lớp thứ cấp là kháng thể thứ cấp biotinylated Lớp thứ 3 là một phức hợp của avidin - biotin peroxidase Peroxidase sau đó được giải phóng bởi DAB hay các chất nền khác để tạo ra sản phẩm là màu khác nhau

e Phương pháp đánh dấu StreptAvidin Biotin (LSAB): Streptavidin, xuất phát từ Streptococcus avidini, là một sự đổi mới gần đây thay thế cho avidin LASB là một kỹ thuật tương tự như phương pháp ABC chỉ khác là đã thay phức hợp avidin-biotin peroxidase ở ABC thành men liên kết streptavidin (HRP-Streptavidin hay AP-Streptavidin) Phương pháp LASB cho độ nhạy hơn từ 5 –

10 lần so với phương pháp ABC

f Ngoài ra còn có các phương pháp khác như là phương pháp trùng hợp (Polymeric methods) gồm có: EnVision Systems và ImmPRESS polymerized reporter enzyme staining system; phương pháp CSA từ Dako gồm có: CSA Systems và CSA II - Biotin-free Tyramide Signal Amplification System