HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ YẾN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH PED TRÊN LỢN LANDRACE VÀ ÁP DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Bộ môn Bệnh lý Thú y - khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Lợn Landrace được chẩn đoán dương tính với virus PED tại phòng thí nghiệm, và những con này được gửi từ các trang trại hoặc cơ sở chăn nuôi về phòng thí nghiệm để xác định mức độ lây nhiễm và hỗ trợ các biện pháp kiểm soát dịch PED.
- Dụng cụ, trang thiết bị:
+ Dụng cụ: panh, kéo, kẹp, bông cồn, seringer, ống đựng máu, ống eppendorf, quần áo bảo hộ, khẩu trang, bông cồn, dao mổ,
Trang thiết bị của phòng thí nghiệm gồm máy đúc chuyển mẫu tự động, máy cắt tổ chức Microtom, máy làm khô tiêu bản, kính hiển vi quang học, tủ lạnh -20°C và -80°C, cân phân tích, máy ly tâm lạnh, máy spin, vortex, máy lắc ấm, máy gia nhiệt PCR, máy điện di và máy chụp ảnh gel, phục vụ hiệu quả quá trình chuẩn bị và phân tích mẫu trong các nghiên cứu và ứng dụng liên quan.
- Hóa chất dùng trong nghiên cứu:
+ Hoá chất sử dụng làm tiêu bản vi thể: formol 10%, cồn, xylen, paraffin, thuốc nhuộm haematoxylin, thuốc nhuộm eosin, baume canada …
Chemicals used include the total RNA extraction kit (QIAamp Viral RNA Minikit) and the RT-PCR reaction kit (Qiagen One-step RT-PCR); a pair of primers for the S gene with a 651 bp product, namely the forward PS1 primer 5’-TTCTGAGTCACGAACAGCCA-3’ and the reverse primer 5’-CATATGCAGCCTGCTCTGAA-3’; DW2; TBE; Ethidium bromide, agarose, DNA Marker (Bionexus – USA); the DNeasy Blood & Tissue kit and related chemicals supplied by Qiagen for total DNA extraction; and the PlatinumTaq DNA Polymerase kit (Invitrogen) used for PCR.
+ Hóa chất làm hóa mô miễn dịch: Kháng thể thứ cấp kháng virus PED, kháng thể sơ cấp, DAB
+ Hóa chất phân lập virus: Dòng tế bào Vero-NIH, DMEM, FBS, kháng sinh, kháng nấm
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn Landrace mắc bệnh PED:
Triệu chứng lâm sàng của lợn Landrace mắc PED điển hình với tiêu chảy cấp, mất nước nhanh, bỏ ăn và giảm tăng trọng, đặc biệt nặng ở lợn con; ở lợn trưởng thành thường nhẹ hơn nhưng vẫn có thể có tiêu chảy và suy kiệt Biến đổi bệnh lý đại thể quan sát được ở ruột teo ngắn, thành ruột mỏng, dãn nhẹ và ứ dịch; lớp niêm mạc phù nề và có tiết dịch, phân có màu nhạt hoặc trắng đục Biến đổi bệnh tích vi thể cho thấy thoái hóa nhung mao ở ruột non với rụng nhung mao và thu hẹp diện tích niêm mạc, kèm tăng sinh crypt và viêm nhẹ quanh niêm mạc, phản ánh sự phá hủy niêm mạc do PED virus.
- Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh PED.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
về những thay đổi về trạng thái, phản xạ, để xác định các triệu chứng lâm sàng
3.5.2 Phương pháp RT-PCR 3.5.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Các bước tách chiết RNA được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của nhà sản xuất gồm:
1 Lấy 560 àl dung dịch AVL cú chứa carrier RNA cho vào ống ly tõm 1.5 ml
2 Thờm 140 àl mẫu (huyết tương, huyết thanh, dịch nuụi cấy tế bào, dịch swab) vào ống ly tâm trên Trộn đều bằng máy voltex
4 Ly tâm để cho các phần dung dịch trên nắp rơi xuống hết ống nghiệm
5 Thờm 560 àl ethanol (96-100%) vào mẫu, trộn đều bằng mỏy voltex trong 15giây Sau đó, spindown toàn bộ dung dịch xuống
6 Cẩn thận lấy 630 àl dung dịch ở bước 5 cho vào ống Qiaamp Mini (dung tích 2ml) Đậy nắp, ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút/1 phút, loại bỏ phần dịch phía dưới
8 Cho 500àl buffer AW1 Đậy nắp, ly tõm tốc độ 8000 vũng/phỳt/1 phỳt
Loại bỏ dịch dưới ống
9 Bổ sung 500 àl dung dịch AW2
10 Ly tõm tốc độ 1400 vũng/phỳt/ 3 phỳt Thu được 60 àl dịch chiết ARN tổng số
11 Bảo quản mẫu RNA ở nhiệt độ -20 0 C 3.5.2.2 Phương pháp RT-PCR
Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA tổng số sau khi tách chiết sẽ được trộn với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 3.1:
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Thể tớch cần lấy (àl)
Cặp mồi được sử dụng cho phản ứng RT-PCR nhân đoạn gen S là PS1, PS2 với độ dài 651 bp (Park, 2007; Chen, 2008)
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.2 Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 1 phút
3.5.2.3 Phương pháp điện di sản phẩm RT-PCR
1 Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng TBE và agarose để tạo bản gel
Để chuẩn bị gel cho điện di DNA, hòa tan agarose vào dung dịch đệm TBE cho tới khi tan hoàn toàn và làm nóng để đảm bảo hỗn hợp đồng nhất, sau đó đổ vào khuôn có lược để tạo gel với các giếng cho mẫu điện di Khi gel đã đông lại, đặt khuôn gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE sao cho gel được ngập hoàn toàn, sẵn sàng cho quá trình điện di.
Bước 2: Tra mẫu điện di Trong bước này, mẫu RT-PCR được chuẩn bị cho quá trình điện di trên gel agarose, kết hợp với dye tải mẫu và thang chuẩn DNA (DNA ladder) để so sánh kích thước và đánh giá chất lượng kết quả.
Bước 3: Chạy điện di Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm SYBR green trong khoảng 5-
Sau 7 phút, bản gel đã được nhuộm và đưa vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di DNA Vị trí của các đoạn DNA được xác định nhờ các vệt sáng phát ra bởi thuốc nhuộm, sau đó được chụp ảnh và lưu lại kết quả cho phân tích.
3.5.3 Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể Lợn mắc bệnh được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, được mổ khám theo quy trình như sau:
Mổ khám xoang ngực là thủ tục nhằm tiếp cận và đánh giá trực tiếp các cơ quan bên trong xoang ngực, đặc biệt là tim và phổi Quá trình này thường bắt đầu bằng việc mở lồng ngực và giải phóng các cấu trúc mềm để tạo đường tiếp cận, giúp quan sát mặt ngoài và vị trí của các cơ quan liên quan Sau khi tiếp cận, bác sĩ kiểm tra trạng thái tim, phổi và các yếu tố liên quan như màng tim và hạch phổi, nhằm đưa ra nhận định tổng quan về tình trạng sức khỏe của xoang ngực.
Khám các cơ quan vùng cổ được thực hiện bằng đường dọc từ miệng đến ngực, mở da hai bên để quan sát niêm mạc dưới da và tuyến giáp trạng, đánh giá vị trí và kích thước của tuyến nước bọt; kiểm tra hạch dưới hàm Bằng tay và dụng cụ y tế, bác sĩ tiến hành khám lưỡi, hạch amidan, hầu và thực quản để đánh giá chức năng và phát hiện bất thường.
Phẫu thuật mở ổ bụng được thực hiện bằng một đường rạch thẳng bên trái từ mỏm xương kiếm xuống sát hậu môn Sau đó, bác sĩ cắt bỏ từng lớp da bụng và các tổ chức liên kết để tiếp cận bên trong khu vực mổ.
Nếu bụng chướng to thì phải lấy ngón tay hoặc vật cùn làm thủng màng bụng, luồn ngửa hai ngón tay trỏ và ngón giữa của tay trái vào xoang bụng, tay phải cầm ngửa lưỡi dao luồn vào kẽ hai ngón tay trái đó rồi vạch vách màng bụng theo hướng từ trên xuống dưới như vậy tránh được làm rách dạ dày và ruột Kiểm tra các cơ quan ở xoang bụng: lách, gan, dạ dày, ruột, thận và tuyến thượng thận
+ Các cơ quan vùng xoang chậu: Cơ quan sinh dục đực: bao dịch hoàn, âm nang, qui đầu, niệu đạo…Khí quan sinh dục cái: tương mạc từ cung, màng cheo và tổ chức liên kết xung quanh niệu quản, lâm ba quản và hoạch lâm ba Mổ tử cung và âm đạo để quan sát màu sắc, độ rắn, lở loét, sẹo…Bàng quang (bóng đái): trạng thái tương mạc, số lượng và tính chất của chất chứa bên trong, trạng thái niêm mạc bàng quang Trực tràng: kiểm tra tương mạc, niêm mạc và trạng thái phân bên trong
Mổ kiểm tra hộp sọ và não ở động vật được thực hiện bằng cách cố định đầu, mở hộp sọ ở vùng trán và đỉnh đầu, sau đó mở một đường trên xương đỉnh và hai bên xương thái dương để tiếp cận não Dụng cụ phẫu thuật được dùng để tách các phần xương và bộc lộ não một cách an toàn Sau khi não được tiếp cận, thao tác nhẹ nhàng được thực hiện để nâng và khảo sát não nhằm đánh giá cấu trúc và tình trạng sức khỏe não của động vật.
Sau đó luồn kéo cắt đứt các dây thần kinh khác
3.5.4 Phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản
Những mẫu bệnh phẩm được đúc mẫu, sau đó cắt mỏng, nhuộm và quan sát bằng kính hiển vi để đọc kết quả bệnh tích vi thể Bệnh tích vi thể đáng chú ý nhất ở lợn được nghiên cứu là các biến đổi tại ruột, phổi, hạch lâm ba và thận.
Trong mỗi ca bệnh, chúng tôi đúc 4 mẫu tương ứng với các cơ quan được liệt kê trên Sau khi làm tiêu bản từ từng mẫu, chúng tôi chọn ra 5 tiêu bản đẹp nhất để kiểm tra bệnh tích vi thể và đánh giá mức độ tổn thương ở mức hiển vi.
Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng paraffin và nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) thường quy tại phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh lý thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhằm chuẩn hóa quá trình quan sát và chẩn đoán mô học Quy trình này bao gồm các bước cơ bản từ cố định mẫu, xử lý nhựa paraffin, tách lát và nhuộm HE để tăng độ tương phản giữa tế bào và mô, từ đó giúp nhận diện cấu trúc mô và đánh giá tình trạng bệnh lý một cách chính xác Việc áp dụng đúng quy trình đảm bảo tiêu bản vi thể có chất lượng cao, đáp ứng yêu cầu nghiên cứu và giảng dạy trong lĩnh vực Thú y tại Việt Nam.