Kỹ thuật xét nghiệm nấm

1. Biết được trang thiết bị cần thiết phục vụ xét nghiệm vi nấm. 2. Liệt kê được một số hóa chất và môi trường nuôi cấy nấm. 3. Thực hiện quy trình lấy bệnh phẩm và xét nghiệm tìm vi nấm. 4. Tìm được một số vi nấm thường gặp trong tiêu bản mẫu. 1.5. Sinh phẩm Các huyết thanh đặc hiệu Các chủng nấm chuẩn Các kháng nguyên mẫu Bộ sinh phẩm để chẩn đoán một số chủng nấm như: Aspergillose, penicillium…

KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM CƠ BẢN TÌM

VI NẤM

1 TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT CẦN THIẾT

- Chai lọ thủy tinh 50ml; 100ml; 250ml; 500ml; 1000ml.

- Giá để ống nghiệm và giá để lam kính.

- Xoong, nồi và dụng cụ làm môi trường.

1.4 Hóa chất – thuốc nhuộm

- Chất sát khuẩn: Cloramin T, axít phenic, cồn

Iốt, cồn 70%…

- Sút, axít công nghiệp để ngâm dụng cụ thuỷ

- Cồn đốt.

- Thuốc nhuộm: Gram, xanh Methylen,

mực tàu

- Dung dịch KOH hoặc NaOH 10 – 30%.

- Hóa chất để sản xuất môi trường nuôi

cấy: Sabouraud, CHROMagarRcandida…

- Dung dịch cố định carnoy

da, dịch não tuỷ, giả mạc, phân, nước tiểu…

3 nguyên tắc khi lấy bệnh phẩm;

ở ngoài môi trường vào bệnh phẩm).

Bệnh phẩm cần được chuyển nhanh nhất tới phòng xét nghiệm, nếu không phải giữ trong môi trường hoặc dung dịch bảo quản ở nhiệt

độ thích hợp.

2.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm họng

 Bệnh phẩm được lấy bằng que tăm

bông cứng vô trùng Tay trái người lấy bệnh phẩm giữ đè lưỡi, tay phải cầm que tăm bông để ngoái họng ở 3

vị trí: 2 amydal (hạch hạnh nhân), lưỡi gà và thành sau họng hầu.

 Bệnh phẩm chỉ giữ được tối đa 3 giờ

sau đó phải cấy vào môi trường thích hợp.

2.2 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm đờm

 Người lớn: vào các buổi sáng, sau khi vệ

sinh răng miệng Cho bệnh nhân tự khạc đờm vào các cốc nhựa vô trùng Sau đó đậy nắp kín đem tới phòng xét nghiệm

 Trẻ em: do không biết khạc đờm, mà sau

khi ho thường nuốt đờm, do vậy bệnh phẩm cần lấy là chất hút từ dịch dạ dày bằng các ống nhựa mềm Bệnh phẩm cũng được bảo quản trong cốc nhựa có nắp đậy

2.3 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm đường sinh dục

Nên lấy vào buổi sáng sớm trước khi đi tiểu

* Nam giới: Lấy mủ ở quy đầu bằng tăm bông, kết

hợp với nặn niệu đạo qua một miếng gạc Nếu không có mủ, có thể lấy những giọt nước tiểu đầu tiên.

* Nữ giới

- Dùng mỏ vịt, lấy mủ ở lỗ tử cung bằng tăm bông

và hoặc mủ ở túi cùng âm đạo Mủ, dịch rỉ từ niệu đạo, tuyến Sken (quanh niệu đạo).

- Bệnh phẩm được gửi ngay tới phòng xét nghiệm, không bảo quản trong lạnh như các bệnh phẩm khác Nếu vận chuyển đi xa phải để trong môi trường bảo quản stuart hoặc transgrow.

2.4 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm phân

- Lấy bệnh phẩm khi bệnh nhân chưa uống kháng

sinh hoặc thuốc chống nấm Dùng tăm bông vô trùng (đã được tẩm ẩm bằng nước muối sinh lý) lấy phân từ trực tràng hoặc sau khi bệnh nhân đã

đi ngoài ra một chiếc bô sạch (bô khô và không chứa các chất sát trùng )

- Bệnh phẩm lấy xong phải chuyển ngay đến phòng

xét nghiệm hoặc bảo quản môi trường Cary-Blair

2.4 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm phân

- Không nhận bệnh phẩm:

+ Lấy quá 2 giờ mà không được bảo quản

+ Tăm bông đã bị khô

+ Đựng trong các vỏ lọ kháng sinh hoặc thuốc chống nấm không do phòng xét nghiệm chuẩn bị

+ Những mẫu phân khác nhau trong cùng một ngày của cùng một bệnh nhân

+ Những mẫu phân không ghi các thông tin cần thiết trên nhãn

Bệnh phẩm đã nhận ở phòng xét nghiệm, nếu

chưa xử lý ngay, phải bảo quản ở 4 - 60C

2.5 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm

nước tiểu

Trừ trường hợp đặc biệt bệnh phẩm được lấy khi tiến hành

các thủ thuật như đặt thông đái, soi bàng quang, chọc hút trên xương mu, trong đa số các trường hợp còn lại, bệnh phẩm được lấy theo phương pháp lấy “nước tiểu giữa dòng” cụ thể như sau:

- Đối với bệnh nhân nữ:

+ Rửa tay bằng xà phòng, lau khô bằng khăn sạch.

+ Ngồi dạng, rửa bộ phận sinh dục bằng xà phòng: thấm khô bằng gạc vô trùng, giữ cho các môi ở âm hộ tách biệt.

+ Đi tiểu bỏ phần đầu: lấy nước tiểu vào lọ vô trùng; nắp kín gửi ngay tới phòng xét nghiệm.

2.5 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm

nước tiểu

- Đối với bệnh nhân nam:

+ Rửa tay bằng xà phòng, lau khô bằng khăn sạch.

+ Kéo bao quy đầu lên (nếu đầu dương vật bị phù kín).

+ Đi tiểu bỏ phần đầu; lấy nước tiểu cho vào lọ vô trùng; đậy nắp kín gửi ngay tới phòng xét nghiệm.

Nên lấy bệnh phẩm vào buổi sáng và được xét nghiệm

trong vòng 2 giờ đầu Vì một lý do nào đó chưa thể xét nghiệm ngay, bệnh phẩm phải được giữ ở 4C, nhưng cũng không được để quá 18 giờ kể từ lúc lấy bệnh phẩm.

2.6 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm dịch não tuỷ

 Thường do lâm sàng khi làm thủ

thuật sẽ lấy

 Cách lấy: chọc tuỷ sống, lấy 1ml dịch

não tuỷ vào ống nghiệm vô trùng, gửi ngay tới phòng xét nghiệm.

2.7 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm mủ

Phải lấy thật vô khuẩn và gửi ngay tới phòng xét

nghiệm (chậm nhất 1 giờ sau khi lấy) Ở phòng xét nghiệm nếu chưa xử lý được ngay, phải bảo quản bệnh phẩm trong tủ lạnh

- Áp-xe kín:

+ Sát khuẩn da bằng cồn Iôt 2%

+ Chọc hút mủ bằng bơm tiêm vô khuẩn, bơm

mủ vào ống nghiệm vô khuẩn, nút kỹ, gửi đến phòng xét nghiệm

+ Nếu hút được ít mủ thì gửi cả bơm tiêm đến phòng xét nghiệm (đậy kín bằng một ống nghiệm vô khuẩn)

2.8 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm các chất dịch

 Hiện tượng tràn dịch trong các hốc thanh mạc

có thể do nhiều nguyên nhân cơ học hoặc viêm Người ta phân biệt ra:

- Các chất dịch rỉ (exsudat) do nguyên nhân cơ

học: Phù toàn thân do bệnh thận hoặc tim, cổ trướng do tăng áp lực tĩnh mạch cửa

- Các chất dịch thấm (transudat) do viêm thanh

mạc: Hiện tượng viêm này thường do nhiễm khuẩn nhưng cũng có thể do nguyên nhân khác không phải nhiễm khuẩn như ung thư, dị ứng, nấm…

2.8 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm các chất dịch

 Tiến hành lấy:

Sát khuẩn da bằng cồn Iốt, chọc hút bằng bơm tiêm 10ml đã hấp vô khuẩn Chất dịch hút ra được bơm vào một ống nghiệm vô khuẩn Có thể chất dịch hút

ra đông lại ngay, làm cho xét nghiệm khó khăn; vì vậy nên cho vào ống nghiệm 1ml natri xitrat 10%.

2.9 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm

máu

- Chọn tĩnh mạch rõ nhất (thông thường lấy ở

tĩnh mạch khuỷu tay, có thể lấy máu tĩnh mạch cổ tay hoạc cổ chân; ở trẻ em có thể lấy máu ở thái dương.

- Buộc dây garo, sát khuẩn rộng vùng da nơi

lấy máu bằng cồn Iôt (Nếu da bệnh nhân không sạch thì phải rửa trước bằng xà phòng rồi rửa lại bằng nước , để khô xong mới xát khuẩn bằng cồn và Iôt).

- Nơi lấy máu đã xát khuẩn không sờ tay vào.

2.9 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm

máu

- Tay trái đè phía dưới tĩnh mạch, nơi

định chích kim: tay phải đâm nhanh mũi kim vào lòng tĩnh mạch Lấy đủ

số lượng máu cần thiết.

- Tháo dây garo, lấy bông cồn sát khuẩn

trên mũi kim, rút nhanh kim ra.

Lưu ý: Tổng thời gian từ lúc garo cho

đến khi lấy máu xong không được quá 2 phút.

2.10 Kỹ thật lấy một số bệnh

phẩm khác

- Nấm da: Dùng cạo hoặc nhíp cạo lấy vẩy

da hoặc lấy tổn thương ở da, ở nhiều vị trí (trong, ngoài, giữa) của tổn thương điển hình.

- Nấm tóc: Cạo lấy vẩy da đầu và nhổ

chân tóc gẫy, tóc có bọc mủ hoặc cắt phần tóc có nấm trứng.

- Nấm móng: Cạo lấy vẩy da quanh rãnh

móng và lớp sừng mủ dưới móng.

Cấu trúc da

3 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM NẤM

Với mỗi loại bệnh phẩm và yêu cầu xét nhiệm khác nhau thì ta tiến hành các bước xét nghiệm khác nhau

1 Với bệnh phẩm là các chất dịch lỏng thì ly tâm lấy cặn

2 Với bệnh phẩm lấy bằng que tăm bông thì lấy trực tiếp que tăm bông làm xét nghiệm

3 Nếu bệnh phẩm là tổn thương da thì lấy nhíp, dao, kéo để lấy bệnh phẩm

4 Với các bệnh phẩm khác tuỳ từng bệnh phẩm mà xử lý khác nhau

Quy trình kỹ thuật chung

Bước 1: Cấy BP vào môi trường, làm tiêu bản nhuộm soi

trực tiếp để xác định tế bào nấm hoặc sợi nấm (nếu có)

Bước 2: Để đĩa thạch vào tủ ấm 25 - 37 0 C.

Bước 3: Xem nhóm nấm xuất hiện, trên đĩa thạch sau 24

- 48 giờ.

Bước 4: Nếu mọc khuẩn lạc, quan sát hình thể khuẩn lạc,

mầu sắc khuẩn lạc.

Bước 5: Làm tiêu bản nhuộm Gram và soi trực tiếp bằng

nước muối sinh lý.

Bước 6: sơ bộ đánh giá đó là nấm men, nấm sợi hay nấm

lưỡng hình Làm test sinh vật hoá học và lên men

3.1 Xét nghiệm nấm trực tiếp

3.1.1 Chuẩn bị phương tiện - dụng cụ

- Nấm da: Dùng dao, nĩa, giấy bóng kính,

3.1.2 Hoá chất – thuốc nhuộm

3.1.2.1 Potassium hydroxide (KOH):

3.1.2.3 Nước muối sinh lý 0,85% hoặc 0,9%

3.1.2.6 Thuốc nhuộm Giemsa

- Giemsa gốc:

+ Glycerin nguyên chất 125mlDùng chày nghiền cho bột giemsa tan hoàn toàn trong cồn Thêm glycerin và lắc đều dung dịch Lắc 3 lần một ngày, trong 4 ngày Lọc bằng băng gạc Bảo quản dung dịch trong lọ tối màu, trong bóng tối

- Giemsa nhuộm:

+ Tỷ lệ 5%: 0,5ml giemsa gốc + 9,5ml nước cất trung tính

+ Tỷ lệ 10%: 1ml giemsa gốc + 9ml nước cất trung tính

3.1.3 Quy trình kỹ thuật

3.1.3.1 Kỹ thuật xét nghiệm nấm trực tiếp

- Chuẩn bị dụng cụ, bệnh nhân, đánh dấu tiêu bản

- Lấy bệnh phẩm đặt lên lam kính

3.1.3.2 Kỹ thuật nhuộm soi nấm

a) Kỹ thuật làm tiêu bản

Dù nhuộm đơn hay nhuộm kép, chuẩn bị một tiêu

bản để nhuộm vi khuẩn và nấm đều giống nhau, gồm 3 bước:

- Dàn đồ phiến

+ Chọn phiến kính sạch, không mốc, không xước Dùng que cấy lấy canh khuẩn (hoặc bệnh phẩm) đặt lên giữa phiến kính sao cho vòng que cấy nằm sát phiến kính

+ Dàn theo đường xoắn ốc từ trong ra ngoài, tạo nên một vùng liên tục chứa canh khuẩn có đường kính khoảng 1cm Phải dàn đều, đủ mỏng và không sát mép phiến kính để việc quan sát trên kính hiển vi được dễ dàng

- Để khô: để tiêu bản khô tự nhiên, không hơ

nóng để tế bào vi khuẩn và nấm không bị biến dạng

- Cố định: Cố định có 3 tác dụng

+ Gắn chặt vi khuẩn và tế bào nấm vào phiến

kính

+ Giết chết vi khuẩn và tế bào nấm

+ Chuẩn bị cho vi khuẩn và tế bào nấm bắt mầu

tốt hơn (do vi khuẩn và tế bào nấm đã chết không còn khả năng thấm chọn lọc các chất).

Thông thường cố định bằng nhiệt: phiến kính

được đưa qua đưa lại cắt ngang ngọn đèn cồn

b) Kỹ thuật nhuộm

- Nhuộm đơn

+ Thuốc nhuộm: có thể dùng nhiều loại

thuốc nhuộm kiềm để nhuộm đơn, như xanh methylene, đỏ fuchsin Trong thực hành thường dùng xanh Methylene vì nó có

ít cặn hơn so với các thuốc nhuộm khác.

+ Kỹ thuật nhuộm: sau khi tiêu bản đã

được cố định, nhỏ xanh methylene phủ kín

đồ phiến Sau 1 phút, đổ thuốc nhuộm, rửa phiến kính dưới vòi nước chảy nhẹ, để khô

và soi kính hiển vi.

+ Kết quả: các vi khuẩn và tế bào nấm

đều bắt màu xanh của thuốc nhuộm.

* Nhỏ dung dịch lugol, để 30 giây.

* Đổ dung dịch lugol, rửa nước

* Tẩy màu: nhỏ vài giọt cồn lên tiêu bản Khi thấy màu tím trên đồ phiến vừa phai hết thì rửa nước ngay

* Nhỏ dung dịch fuchsin, để 1 phút

* Rửa nước kỹ, để khô, soi kính hiển vi

- Kỹ thuật nhuộm giemsa

+ Dàn tiêu bản.

+ Làm khô tiêu bản ở nhiệt độ 370C.

+ Cố định tiêu bản bằng dung dịch carnoy

trong 5 phút.

+ Pha loãng dung dịch giemsa theo tỷ lệ một

giọt giemsa đậm đặc trong 1ml nước trung tính.

+ Phủ dung dịch giemsa pha loãng 5 phút.

+ Rửa tiêu bản bằng nước sạch.

+ Để khô.

+ Soi kính hiển vi vật kính dầu.

- Kỹ thuật nhuộm xanh Lactophenol

Coton Blue

* Dàn tiêu bản.

* Làm khô tiêu bản ở nhiệt độ 370C

* Cố định tiêu bản bằng cồn 900 hoặc dung

dịch carnoy trong 5 phút.

* Phủ dung dịch xanh LPCB trong 5 phút.

* Rửa tiêu bản bằng nước thường.

* Khử nước bằng cồn tuyệt đối và xylen.

* Để khô.

* Soi kính hiển vi.

Với kỹ thuật này sợi nấm và bào tử nấm có

3.2 Kỹ thuật nuôi cấy nấm

3.2.1 Muc đích

Nuôi cấy nấm là những kỹ thuật nhằm mục đích

phân lập và định loại nấm Trong phần này chỉ giới thiệu những kỹ thuật đơn giản về nuôi cấy nấm

3.2.2 Các loại môi trường nuôi cấy

3.2.2.1 Môi trường sabouraud

3.2.2.2 Môi trường CHROMAgarRcandida

B1: Chromogenic mix 47,7 g + 1lít nước cất.

B2: hòa tan bột trong nước bằng cách quay nhẹ

cho đến khi tan thạch.

B3: Đun sôi, lắc đều.

B4: để nguộn tới 450C, đổ ra đĩa hoặc túp Để

nguội

B5: Ghi nhãn và ủ 48 giờ ở 30 C - 37 C, để kiểm

Đun nóng để hòa tan môi trường trong

nước, cho thêm Chloramphenicol,

Cycloheximide, hấp khử trùng 1180C trong

10 phút.

3.2.2.4 Thạch bột bắp (Corn Meal Agar)

Dùng để phân biệt Trichophyton rubrum và

Trichophyton mentagrophytes dựa vào sự

thành lập sắc tố (Trichophyton rubrum sinh sắc

tố đỏ), người ta dùng môi trường này nhưng

thay thế 1% Tween 80 bằng 1% Glucose

3.2.2.5 Thạch tim óc hầm (Brain Heart

3.2.3 Kỹ thuật nuôi cấy

3.2.3.1 Nuôi cấy nấm trên môi trường thạch

nghiêng

- Chuẩn bị ống chủng và ống thạch nghiêng để cấy.

- Tay trái cầm ống chủng.

- Tay phải đốt que cấy.

- Tay phải mở ống chủng, hơ nóng miệng ống trên

ngọn lửa đèn cồn.

- Ấn đầu que cấy còn nóng vào mặt thạch cho

nguội, lấy một ít bệnh phẩm.

- Ria cấy nhẹ nhàng trên mặt thạch.

- Đốt que cấy, đậy nút ống nghiệm.

3.2.3.2 Nuôi cấy nấm trên môi trường

lỏng

Các bước làm như nuôi cấy nấm trên môi

trường thạch nghiêng.

3.2.3.3 Nuôi cấy nấm trên phiến kính

Kỹ thuật này tốn ít môi trường, giúp cho dễ

theo dõi hình thái của nấm nhất là đối với nấm mảnh, dễ gẫy.

- Nhỏ môi trường lên lam kính.

- Lấy một ít bệnh phẩm cấy lên môi trường.

- Đặt khung thuỷ tinh để ngăn chặn môi

trường và khuẩn lạc với lá kính.

- Đậy lá kính.

- Để tủ ấm.

3.2.3.4 Nuôi cấy nấm trên môi trường

thạch đĩa

Ưu điểm của kỹ thuật này quan sát được

thuận lợi cả ở phần rìa cũng như phần đáy khuẩn lạc.

4 Kỹ thuật khác

- Kỹ thuật miễn dịch: huyết thanh chẩn

đoán – Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA).

- Kỹ thuật sinh học phân tử: Polymerase

chain reaction (PCR)

MỘT SỐ VI NẤM THƯỜNG GẶP

Vi nấm Epidermophyton sp

- Chỉ gây bệnh trên da và móng

- Loại gây bệnh thường gặp là E.floccosum.

- Thuộc loại nấm sợi, có vách ngăn

- Xét nghiệm trực tiếp bằng dd KOH 10-20%

- Trên môi trường nuôi cấy mọc thành khuẩn

lạc khô, mỏng, màu hoa lý Nhuộm soi thấy bào tử đính lớn hình chùy, không có bào tử đính nhỏ

Vi nấm E.floccosum

Vi nấm E.floccosum

Vi nấm Trichophyton sp

- Là những nấm sợi, có vách ngăn.

- Gây bênh trên da, lông, tóc và móng.

- Xét nghiệm trực tiếp bằng dd KOH 10 –

20%.

- Trong môi trường nuôi cấy sinh cả bào tử

đính nhỏ và bảo tử đính lớn Bào tử đính nhỏ hình tròn hoặc giọt nước, bào tử đính

Vi nấm Trichophyton sp

Vi nấm Trichophyton sp

Vi nấm Candida sp

- Có trên 10 loại Candida có khả năng gây bệnh,

loài thường gặp là C.albicans.

- Gây bệnh đa dạng: tưa lưỡi, viêm âm đạo,

thực quản, đường tiêu hóa, da, giả mạc…

- Là những tế bào men, có kích thước: 3-5µm,

có thể gặp sợi tơ nấm giả

- Chẩn đoán xét nghiệm: Nhuộm Gram, nuôi cấy

trên Sabouraud và CHROMagarRcandida

Vi nấm C.albicans

Vi nấm Candida

Vi nấm Cryptococcus sp

- Loài duy nhất gây bệnh là C.neoformans.

- Gây bệnh: viêm màng não, da, phổi …

Biểu hiện lâm sàng:

- Các triệu chứng thường kéo dài trong khoảng 1-2

tuần.

- Biểu hiện của viêm màng não

+ Giai đoạn sớm: sốt, khó chịu và nhức đầu.

+ Giai đoạn muộn: nôn, buồn nôn, phản ứng màng

não và rối loạn tâm thần.

+ Bệnh cũng có thể biểu hiện nhẹ thoáng qua, nên

- Các triệu chứng khác tương tự như Bn

AIDS ở giai đoạn cuối

- Khi bệnh nhân bị nhiễm nấm thì:

+ Dịch não tuỷ trong

+ Protein có thể bình thường hoặc tăng

nhẹ

+ Bạch cầu trong DNT thường thấp (<50

tế bào/ml) và chủ yếu là tế bào Lympho.

- Nhuộm mực tàu: Tế bào nấm hình tròn, xung

quanh có một màng nhày rất chiết quang.

- Nuôi cấy trên môi trường Sabouraud khuẩn lạc

Vi nấm Cryptococcus sp