bài tiểu luận với đề tài xác định hàm lượng axit benzoic trong sữa bằng phương pháp sấc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các nội dung: tổng quan về sản phẩm, tổng quan về axit benzoic, tổng quan về phương pháp HPLC, quy trình phân tích và kết quả đạt được.
GIỚI THIỆU TỔNG QUAN
Tổng quan về sữa
Sữa là chất lỏng màu trắng đục do động vật có vú sản xuất, bao gồm cả động vật đơn huyệt, và là đặc điểm phân định của loài này Nó cung cấp dinh dưỡng ban đầu cho con sơ sinh trước khi chúng có thể tiêu hóa thực phẩm khác Sữa non, được tiết ra đầu tiên, chứa kháng thể từ mẹ, giúp giảm nguy cơ nhiễm bệnh cho con non.
Sữa tự nhiên, hay còn gọi là sữa tươi, bao gồm sữa mẹ và sữa từ các loài động vật như bò, dê, trâu, cừu, lạc đà và tuần lộc, được sản xuất thông qua việc chăn nuôi gia súc.
Tất cả động vật có vú đều sản xuất sữa, nhưng thành phần sữa khác nhau tùy thuộc vào nhu cầu và môi trường sống của mỗi loài Sữa mẹ người có hàm lượng dinh dưỡng thấp, với 4% chất béo, 1,3% protein và 7,2% đường lactose, trong khi khoảng 90% còn lại là nước, tương tự như sữa ngựa vằn.
Sữa tươi từ động vật thường được xử lý bằng phương pháp Pasteur để tiêu diệt vi khuẩn và kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm cho đến khi tiêu thụ.
Sữa nhân tạo là sữa do con người chế biến lại từ sữa tươi Có nhiều dạng sữa nhân tạo:
- Sữa đặc không đường (evaporated) là loại sữa được sấy cho đến khi lượng nước trong sữa bay hơi tới 60%
- Carrageenan/Carrageenin (một dạng gôm thực vật) được thêm vào sữa trước khi nó được xử lý để ổn định các protein casein
Sữa đặc có đường là sản phẩm sữa được loại bỏ 50% nước và bổ sung 44% đường so với trọng lượng cuối cùng Hàm lượng đường cao trong sữa đặc giúp ức chế sự phát triển của vi khuẩn, đảm bảo an toàn cho sản phẩm.
- Sữa bột, sữa công thức là loại sữa tươi đã được tách nước hoàn toàn
Sữa thực vật là sản phẩm sữa hoàn toàn từ thực vật, được chế biến từ các loại hạt như hạt hạnh nhân và đậu Sữa đậu nành chứa nhiều protein và khi được bổ sung canxi, có thể cung cấp dinh dưỡng tương đương với sữa bò Tuy nhiên, các loại sữa thực vật khác như sữa hạnh nhân, sữa yến mạch, sữa dừa và sữa gạo thường không có hàm lượng dinh dưỡng cao như sữa đậu nành.
Sữa lên men bao gồm các sản phẩm như bơ, phô mai, kem chua và sữa chua, được tạo ra từ sữa tươi bằng cách thêm vi khuẩn và ủ men trong một khoảng thời gian nhất định.
Sữa tiệt trùng (UHT) được xử lý ở nhiệt độ cao hơn sữa thanh trùng, giúp tiêu diệt vi khuẩn và kéo dài hạn sử dụng Các sản phẩm UHT thường được đóng gói trong vật liệu như polyethylene, giấy và nhôm lá với lớp màng polyethylene Sau khi mở, sữa tiệt trùng có thể sử dụng trong ít nhất 10 ngày nếu được bảo quản trong tủ lạnh Vị của sữa tiệt trùng thường ngọt hơn và ít béo hơn.
1.1.3 Vai trò và lợi ích của sữa
Sữa cung cấp các dưỡng chất thiết yếu như canxi, magie, selen, vitamin B2, vitamin B12 và axit pantotenic, giúp đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của cơ thể Theo Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực (FAO), sữa là nguồn thực phẩm hàng đầu cung cấp canxi, vitamin D và kali cho cả người lớn và trẻ em tại Hoa Kỳ, trong khi phô mai đứng thứ hai trong việc cung cấp canxi.
Sữa được xem là “thực phẩm lành mạnh” với đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết như vitamin, khoáng chất, protein, carbohydrate và chất béo thiết yếu Điều này khiến sữa trở thành một thực phẩm hoàn hảo cho mọi người, đóng vai trò quan trọng trong chế độ ăn uống hàng ngày Những lợi ích sức khỏe của sữa rất đa dạng và đáng chú ý.
Sữa là nguồn cung cấp canxi dồi dào, rất cần thiết cho việc tăng cường mật độ xương và giúp răng chắc khỏe Đặc biệt, với trẻ em thường thích đồ ngọt, vấn đề sâu răng trở nên phổ biến Do đó, sữa chính là giải pháp đơn giản và hiệu quả để bảo vệ sức khỏe răng miệng cho trẻ.
➢ Giàu vitamin D: Sữa là một thực phẩm rất giàu vitamin D, nó có tác dụng làm giảm viêm nhiễm và tăng cường hệ miễn dịch
Sữa là nguồn cung cấp nước dồi dào, giúp cơ thể duy trì độ ẩm Sau khi tập thể dục, một ly sữa không chỉ phục hồi năng lượng mà còn hỗ trợ giữ nước cho cơ thể.
Protein trong sữa là yếu tố quan trọng cho sự phát triển cơ bắp, đặc biệt đối với những người tham gia hoạt động thể chất Việc bổ sung sữa vào chế độ ăn hàng ngày không chỉ giúp phục hồi nước cho cơ thể sau khi tập luyện mà còn giảm đau nhức cơ bắp hiệu quả.
➢ Tốt cho da: Sữa rất giàu các axit amin, giúp giữ ẩm da và khiến da trở nên mềm mại hơn
Sữa có tác dụng giảm căng thẳng và tăng cường năng lượng sau một ngày làm việc mệt mỏi Nó giúp thư giãn cơ bắp và hỗ trợ các hoạt động của hệ thần kinh Uống một ly sữa ấm vào ban đêm còn có thể mang lại giấc ngủ ngon.
1.1.4 Thành phần và chỉ tiêu chất lượng a/ Thành phần
Thành phần dinh dưỡng đa lượng bao gồm độ ẩm, tro, protein, lipid, carbohydrat, đường tổng, đường khử, và các thành phần đường như saccarose và lactose Ngoài ra, còn có xơ tổng, xơ tan, xơ không tan, độ acid và năng lượng.
Tổng quan về axit benzoic
Axit benzoic, có công thức hóa học C7H6O2 (hoặc C6H5COOH), là một chất rắn tinh thể trắng và là axit cacboxylic thơm đơn giản nhất Tên gọi của nó xuất phát từ gum benzoin, nguồn gốc để điều chế axit benzoic Axit yếu này cùng với các muối của nó được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm, có tác dụng chống khuẩn, chống nấm mốc và các vi sinh vật gây hại khác Ngoài ra, axit benzoic còn là nguyên liệu quan trọng trong tổng hợp nhiều chất hữu cơ khác, trong khi các muối và este của nó được gọi là benzoat.
Hình 1.1: Cấu tạo axit benzoic
1.2.2 Tính chất a/Tính chất vật lí
Axit benzoic là hợp chất hữu cơ không màu, tồn tại dưới dạng tinh thể rắn màu trắng, không mùi và có vị đắng nhẹ Hợp chất này tan trong nước nóng và metanol, nhưng không tan trong este Với tính axit yếu, axit benzoic có độ pH khoảng 2,8 Dưới điều kiện bình thường, nó có vẻ ngoài trắng mịn, bao gồm các tinh thể dạng kim.
• Khối lượng mol của C7H6O2 là 122,12 g/mol
• Khối lượng riêng của C7H6O2 là 1,32 g/cm3, rắn
• Điểm nóng chảy của C7H6O2 là 122,4°C (395 K)
• Độ hòa tan trong nước của C7H6O2 là 3.4 g/l (25°C) b/ Tính chất hóa học
Axit Benzoic có thể tác dụng được với bazơ và giải phóng nước cùng với Kali benzoat
Axit Benzoic có thể tác dụng được với oxít tạo ra kim loại cùng với nước và giải phóng khí CO2
Axit Benzoic có thể tác dụng được với kim loại và cho thoát ra khí Hidro
Axít benzoic được sản xuất thương mại từ toluen thông qua quá trình oxy hóa không gây ô nhiễm môi trường, sử dụng xúc tác coban hoặc mangan naphthenat.
Ngoài ra, chúng ta còn có thêm một vài cách dùng để điều chế Axit benzoic dưới đây:
• 3H2SO4 + 2KMnO4 + C6H5CHCH2 ⟶ 4H2O + 2MnSO4 + K2SO4 + CO2 +
• 9H2SO4 + 6KMnO4 + 5C6H5CH3 ⟶ 14H2O + 6 MnSO4 + 3K2SO4 + 5C6H5COOHz
Axit benzoic có mặt tự nhiên trong nhiều loại trái cây như mận, xoài, quất, và vỏ cây anh đào, cũng như trong các loại thảo mộc như hồi và cây chè.
1.2.4 Vai trò và tác hại
Axit benzoic là một phụ gia thực phẩm phổ biến, được sử dụng trong nhiều sản phẩm như tương ớt, sữa lên men, quả ngâm giấm, hoa quả ngâm đường, nước trái cây, rau thanh trùng và bánh kẹo.
Axit benzoic là một chất bảo quản phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong nước ngọt, mứt và bánh kẹo để chống nấm mốc và ngăn chặn các sinh vật gây hư hại.
• Ngoài ra, Axit Benzoic đôi khi còn được ứng dụng vào các dòng mỹ phẩm chăm sóc sức khỏe với tác dụng dưỡng ẩm, …
• Liều lượng gây độc ở người là 6mg/kg thể trọng
• Ở mức 0,1% acid benzoic có trong thực phẩm là an toàn, nhưng chúng sẽ không còn an toàn nếu lượng ăn vào quá nhiều, vượt hàm lượng cho phép
Ăn nhiều axit benzoic có thể ảnh hưởng đến cơ thể, vì glucocol cần thiết cho quá trình tổng hợp protein sẽ bị tiêu hao do phản ứng với axit benzoic để giải độc.
• Axit benzoic và các chất cùng nhóm khi gặp vitamin C có trong thực phẩm và thức uống sẽ tạo phản ứng sinh ra benzene – chất gây ung thư (carcinogen)
• Ngoài ra, axit benzoic có thể tác động hệ hô hấp và hệ thần kinh trung ương, gây kích ứng mắt, …
1.2.5 Các phương pháp phân tích axit benzoic
Mẫu thử được đồng hóa, pha loãng và axit hóa Axit benzoic được chiết xuất bằng dietyl ete, sau đó tiếp tục chiết bằng kiềm và tinh chế qua quá trình oxi hóa với kali dicromat đã axit hóa Cuối cùng, axit benzoic tinh khiết hòa tan trong dietyl ete được xác định thông qua phương pháp đo quang phổ.
❖ Phương pháp sắc ký khí:
Axit benzoic và axit sorbic được chiết xuất từ mẫu thử bằng phương pháp chiết với ete, sau đó được phân tách trong dung dịch natri hydroxit và metylen clorua Các axit này chuyển hóa thành este trimetylsilyl (TMS) và được xác định thông qua sắc ký khí Axit phenylaxetic và axit caproic được sử dụng làm chất chuẩn nội cho axit benzoic.
❖ Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao:
Chiết axit benzoic và/hoặc axit sorbic từ phần mẫu thử bằng hỗn hợp dung dịch đệm amoni axetat và metanol, trong môi trường axit
Nồng độ của axit benzoic và/hoặc axit sorbic được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) dùng cột pha đảo và detector cực tím (UV).
Tổng quan về phương pháp HPLC
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)
Phương pháp HPLC, ra đời vào năm 1967-1968, được phát triển từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay, HPLC ngày càng hiện đại hóa nhờ sự tiến bộ nhanh chóng trong ngành chế tạo máy phân tích Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực kiểm nghiệm, đặc biệt là trong ngành kiểm nghiệm thuốc, và trở thành công cụ quan trọng trong phân tích các thuốc đa thành phần, cho phép thực hiện cả định tính và định lượng.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp chia tách sử dụng pha động là chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng phủ lên chất mang rắn Pha tĩnh có thể là tiểu phân hoặc chất mang đã được biến đổi hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên các cơ chế như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và phân loại theo kích cỡ (rây phân tử).
Sắc ký lỏng là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp thông qua cột tách sắc ký ở trạng thái lỏng Để thực hiện quá trình này, các chất mẫu cần được hòa tan trong một chất lỏng, thường là pha động của sắc ký Phương pháp này phù hợp cho cả các chất có nhiệt độ sôi cao và thấp, ngoại trừ các chất khí ở điều kiện thường.
Pha tĩnh trong sắc ký lỏng có thể là chất rắn hoặc chất lỏng, với pha tĩnh rắn được nhồi vào cột tạo thành cột chất nhồi Pha tĩnh lỏng được giữ trong cột nhờ chất mang trơ, tạo thành một lớp mỏng quanh hạt chất mang Loại pha tĩnh này có dung tích nhỏ hơn pha tĩnh rắn xốp toàn phần, dẫn đến tên gọi sắc ký lỏng – lỏng (LLC) và sắc ký lỏng – rắn (LSC), trong đó LSC được sử dụng phổ biến hơn Pha tĩnh đóng vai trò quan trọng trong quá trình sắc ký, xác định loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ, ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo; nếu là chất trao đổi ion, ta có sắc ký trao đổi ion; và nếu là chất lỏng, ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết.
Thiết bị bao gồm hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (có thể có bộ phận điều khiển nhiệt độ), detector và hệ thống thu dữ liệu (máy tích phân hoặc máy ghi đồ thị) Pha động được cung cấp từ một hoặc nhiều bình chứa, chảy qua cột với tốc độ không đổi và sau đó đi qua detector.
Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần duy trì pha động với lưu lượng không đổi, giảm thiểu biến đổi áp suất bằng cách sử dụng thiết bị giảm xung Ống dẫn và hệ thống nối phải chịu được áp suất từ bơm, và có thể lắp thêm thiết bị loại bỏ bọt khí Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp pha động hằng định hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần theo chương trình xác định Trong rửa giải gradient, bơm lấy dung môi từ nhiều bình chứa và có thể trộn lẫn ở áp suất thấp hoặc cao.
Dung dịch mẫu thử được đưa vào dòng pha động hoặc gần đầu cột thông qua bộ phận tiêm mẫu hoạt động ở áp suất cao Có thể sử dụng vòng chứa mẫu thử với thể tích cố định hoặc thiết bị có thể tích thay đổi, có thể vận hành bằng tay hoặc tự động Việc tiêm mẫu bằng tay có thể dẫn đến sai số trong đo thể tích, do lượng mẫu tiêm vào vòng chứa không đủ.
1.3.2.3Cột sắc ký a Cột tách
Chất liệu: thép không gỉ, thuỷ tinh hoặc chất dẻo
Kích thước: dài 10-30cm, đuờng kính trong 4-10mm
Hạt nhồi có kích thước từ 5-10 µm và được sử dụng trong cột bảo vệ (tiền cột) để tách các tạp chất trong mẫu phân tích, giúp tăng tuổi thọ của cột Chất nhồi cột thường là Silicagen, được bao phủ bởi một lớp mỏng chất hữu cơ hoặc liên kết hóa học với chất hữu cơ Ngoài ra, còn có các loại hạt khác như nhôm oxit, polymer xốp và chất trao đổi ion.
Detector là bộ phận quan trọng trong việc thu nhận và phát hiện tín hiệu của chất phân tích khi chúng ra khỏi cột, cho phép ghi lại các tín hiệu trên sắc ký đồ để thực hiện định tính và định lượng Việc lựa chọn loại Detector phù hợp phụ thuộc vào tính chất của các chất cần phân tích và phải đáp ứng điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định Các tín hiệu có thể bao gồm độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn nhiệt, và độ dẫn điện.
1.3.2.5 Hệ thống thu dữ liệu
Gồm máy ghi, máy tính Phần mềm online chạy chương trình đo Phần mềm offline lưu giữ kết quả đo
Pha tĩnh (stationary phase – SP): Là chất nhồi cột, làm nhiệm vụ tách sắc kí chất
Là những chất rắn, xốp, kớch thước hạt rất nhỏ, đường kớnh cỡ hạt từ 3 - 7 àm, diện tích bề mặt riêng từ 80 – 500 m 2 /g
Trơ và bền trong điều kiện sắc ký, không phản ứng với dung môi rửa giải và chất phân tích, đảm bảo cơ chế tách đúng bản chất của pha tĩnh mà không làm mất chất cần tách.
- Tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan trong những điều kiện sắc ký nhất định
- Tính chất bề mặt và độ xốp ổn định, không bị thay đổi hay biến dạng trong quá trình sắc ký, không bị phân rã dưới áp suất cao
- Cân bằng động học của sự tách xảy ra nhanh, thuận nghịch và lặp tốt Kết quả tách tốt, pic sắc ký cân đối
- Cỡ hạt đồng nhất, đường kính hạt lớn nhất và hạt nhỏ nhất không chênh lệch nhau quá 10%, trên 85% số hạt nằm trong vùng kích thức trung bình
❖ Phân loại theo dạng tồn tại
- Pha tĩnh là chất lỏng: Lớp màng bao xung quanh hạt chất mang trơ
- Pha tĩnh là chất rắn
❖ Phân loại theo cấu trúc
- Pha tĩnh xốp toàn phần:
+ Toàn bộ hạt pha tĩnh là một khối xốp
+ Bề mặt riêng lớn, từ 100 – 500 m 2 /g
+ Thể tích xốp lớn (0,5 – 2 ml/g)
- Pha tĩnh xốp bề mặt:
+ Chỉ xốp lớp vỏ của hạt nhồi, bề dày từ 2 - 3 àm và lừi của hạt nhồi đặc và trơ
+ Thể tích xốp nhỏ (0,1 – 0,5 ml/g)
❖ Phân loại theo tổng hợp chất
Dựa trên nền của nguyên liệu chế tạo pha tĩnh:
- Pha tĩnh trên nền silica (SiO2)
+ Silica trung tính: (silica trần)
• Là chất nhồi cột của NP – HPLC
• Có bề mặt phân cực, trên bề mặt chứa các nhóm -OH phân cực và thuộc nhóm ái nước
Nếu chất phân tích có nhóm – COOH, - NH2, - OH, thì liên kết hydro sẽ mạnh
Nếu mẫu chứa nhóm tert-butyl hoặc các nhóm không phân cực lớn, liên kết hydro sẽ yếu do chướng ngại lập thể Đối tượng phân tích trong trường hợp này là các chất không phân cực và ít phân cực.
Pha động: Chất hữu cơ không phân cực hay ít phân cực và kị nước
VD: Benzen, Toluen, Cloroform, Etyl axetat, n-Hexan…
Nước ảnh hưởng nhiều đến bề mặt hoạt động sắc ký của pha tĩnh, ảnh hưởng đến độ lặp của quá trình tách sắc ký
+ Silica biến tính (alkyl hóa, sunfonic hóa, nitro hóa, amin hóa)
• Sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo (RP – HPLC)
• Bề mặt không phân cực hay rất ít phân cực
• Nước không ảnh hưởng đến bề mặt
Chất phân tích: Không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực và cặp ion
MP là chất hữu cơ phân cực tan trong nước như methanol và axetonnitril, thường được sử dụng trong các hỗn hợp với nhau và với nước theo tỷ lệ nhất định Đặc điểm nổi bật của MP là độ lặp tốt, mang lại nhiều ứng dụng hơn so với silica trung tính.
➢ Silica sunfonic hóa hay Nitro hóa
Sản phẩm được tạo ra từ quá trình sunfonic hóa hoặc nitro hóa các silica trung tính, nhằm thay thế nhóm –OH hoặc nguyên tử hydro trong gốc alkyl của pha đảo bằng các nhóm –SO3H hoặc –NO2H.
• Thuộc sắc ký trao đổi Cation:
• Thường ở dạng muối: - SO3Na, - NO2Na, - RCOONa Ứng dụng: tách chất có cấu tạo ion
MP: Dung dịch nước của các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức, dung dịch axit hay bazo, hoặc thêm các chất hữu cơ tan trong nước
• Là những silica trung tính được thay thế nhóm – OH bằng các nhóm – NH2,
- NH -, - NR2, NR3 Ứng dụng: Tách anion (trong hợp chất có cấu trúc ion, hay tann trong MP phân li thành ion, như các bazo, các axit hữu cơ)
MP: Dung dịch nước của các muối, chất đệm, dung dịch axit hay bazo)
- Pha tĩnh trên nền oxit nhôm
+ Chủ yếu sử dụng trong NP – HPLC
+ Bề mặt phân cực có hai trung tâm phân cực khác nhau: trung tâm axit (H+) và trung tâm bazo (O-)
+ Tính chất: ái nước và ảnh hưởng giống silica trung tính
+ MP: kỵ nước, các chất hữu cơ không phân cực hay ít phân cực, hoặc hỗn hợp của chúng
Không dùng nhiều: Vì tách kết quả không tốt như nền silica
- Pha tĩnh trên nền các chất cao phân tử hữu cơ
+ Là phân tử polime có gắn nhóm chức trao đối ion: - SO3H, - NO2H, - RCOOH, -NH2, …
+ Là chất nhồi của sắc ký trao đổi ion
Dung dịch nước của muối bao gồm chất đệm pH, chất tạo phức, dung môi hữu cơ tan trong nước, cùng với các dung dịch axit và bazo loãng.
Hiện nay còn hạn chế vì:
• Độ trương nở lớn khi thay đổi thành phần dung môi rửa giải, pH pha động
• Khả năng chịu áp suất kém, độ trơ với dung môi kiềm, axit không cao
• Các nhóm amin dễ bị phân hủy
- Pha tĩnh trên mạch cacbon:
+ Pha tĩnh trên nền mạch cacbon (than) tinh khiết đã được tổng hợp và nghiên cứu song các kết quả tách không ưu việt hơn các loại silica
Hiện nay đang trong nghiên cứu lý thuyết là chủ yếu
- Pha tĩnh lỏng của HPLC
+ Pha tĩnh lỏng: là chất nhồi cột của hệ sắc ký phân bố hay còn gọi là sắc ký chiết
+ SP gồm hai phần: phần lỏng và phần rắn
Phần lỏng có tính chất sắc ký bao gồm các hợp chất hữu cơ có độ nhớt cao, như dầu silicon và các hợp chất hữu cơ silicon-phospho, cũng như một số loại polymer.
• Phần rắn là lõi trơ: chất mang (hạt silica, hạt oxit nhôm)
Cách 1: Nhồi chất mang trơ vào cột tách, cho pha tĩnh chảy qua bão hòa bề mặt chất mang trơ
Cách 2: Tẩm pha tĩnh lỏng lên bề mặt chất mang trơ trước, sau đó nhồi vào cột sắc ký
Một số loại pha tĩnh lỏng: Cyano – ethyl – silicon [- (NC – SiO2 – C2H5)n-], các glycol (diethylen – glycol), … a) Ảnh hưởng:
Các đặc trưng của SP ảnh hưởng đến sự tách sắc ký:
+ Cấu trúc xốp, diện tích xốp, bề mặt riêng
- Pha động (MP – Mobile Phase)
- Là chất dùng để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký
- MP: Một dung môi hữu cơ, hỗn hợp dung môi, hoặc nước có chứa chất đệm pH, chất tạo phức… với nồng độ nhất định
- Độ chọn lọc của hệ pha
- Thời gian lưu giữ của các chất tan
- Hiệu lực của cột tách
- Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh
- Độ rộng của pic sắc ký…
- Trơ với SP, không làm hỏng SP, không có thương tác phụ với SP để sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp cho quá trình tách
- Hòa tan và vận chuyển mẫu tốt từ đầu đến cuối cột tách
- Bền theo thời gian, không thay đổi, thành phần khống chế được trong quá trình sắc ký
- Độ tinh khiết cao, đảm bảo không nhiễm bẩn mẫu, gây sai số cho kết quả tách Thường dùng hóa chất, độ sạch, mức độ,
- Nhanh đạt cân bằng sắc ký
- Phù hợp với loại detecter, không làm hại flowcell
VD: Detector huỳnh quang thì MP không có tính huỳnh quang
- Có tính kinh tế, không hiếm, không quá đắt
1.3.4.4 Tối ưu hóa pha dộng
- Với hệ hấp thụ pha thường (NP – HPLC)
+ SP: Silica trần, bề mặt phân cực
+ MP: dung môi hữu cơ không phân cực kỵ nước hay ít phân cực
GIỚI THIỆU MỘT SỐ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
Phân tích axit benzoic trong sữa bằng HPLC theo bài báo Thổ Nhĩ Kỳ của tác giả Yerlikaya
Xác định hàm lượng của axit benzoic trong một loạt các loại sữa chua, đồ uống, sữa chua, sữa chua dẻo, các loại pho mát và bơ, …
Sử dụng thiết bị HPLC dòng Agilent 1100 được trang bị Bộ điều nhiệt cột G1316A, máy dò Diode Array G1315B, bộ khử khí G1379A, G1311A Quatpump
- Cột sắc ký: C18 (300mm x3,9mm x 10àm)
- Tốc độ dòng: 1,4ml/min
- Nhiệt độ chạy cột: 25ºC
- Thực hiện ở nhiệt độ phòng (25 ° C)
- Mẫu không hư hỏng, không bị biến đổi chất lượng Được bảo quản sao cho tránh hư hỏng hoặc biến đổi thành phần
- Chất chuẩn axit benzoic (1àg / mL) được mua từ Alfa Aesar (Cas No: 65- 85-0, 99%) Các tiêu chuẩn đã được pha loãng trong nước tinh khiết
- Tất cả nước được sử dụng đã được lọc sạch bởi hệ thống milipore milli-Q a10 Axetonitril cấp HPLC là được mua từ Carlo Erba (Cas No: 75-05-8, 99,9%)
- Các thuốc thử khác cũng là loại HPLC và thu được từ Panreac (Cas No: 231- 633-2), Sigma-Aldrich (Cas No: 778-77-00 98-100%)
Khối lượng tiềm là 10 àL, với đỉnh của axit benzoic được đo ở bước sóng 230 nm Đỉnh này được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu giữ và quang phổ với dung dịch nước của tiêu chuẩn Phương pháp biểu đồ tiêu chuẩn bên ngoài được sử dụng để xây dựng đường cong chuẩn hồi quy tuyến tính cho nồng độ axit benzoic từ 0,5 đến 10 àg/l Tất cả các phân tích được thực hiện trong ba lần lặp lại, và kết quả được trình bày sau khi thực hiện thống kê mô tả đơn giản Để đánh giá thống kê kết quả, phân tích phương sai được áp dụng, cùng với thử nghiệm Duncan để xác định các nhóm mẫu, sử dụng phần mềm SPSS phiên bản 19.0.
Chất lỏng hiệu suất cao
Kết quả sắc ký (HPLC)
Hình 2.1: Sắc ký đồ của axit benzoic trong sữa
Giới hạn phát hiện (LOD) là đỉnh nhỏ nhất có thể phát hiện với độ cao tín hiệu gấp ba lần đường cơ sở, trong khi giới hạn định lượng (LOQ) là mức thấp nhất của chất phân tích có thể xác định với độ tin cậy chấp nhận được.
Phân tích axit benzoic trong sữa bằng HPLC theo bài báo Việt Nam của tác giả Ths Phạm Thị Hồng
Nghiên cứu phương pháp phân tích hàm lượng acid benzoic trong thực phẩm bao gồm các loại bánh kẹo, nước giải khát, gia vị, và các sản phẩm từ thịt, cá, sữa.
Mẫu được acid hóa bằng acid tartaric và sau đó chưng cất lôi cuốn theo hơi nước để tách acid benzoic Dịch cất thu được sẽ được lọc và định lượng bằng phương pháp HPLC.
2.2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
- Thiết bị, dụng cụ: Máy HPLC (UENO - Nhật Bản), thiết bị chưng cuốn hơi nước, màng lọc
- Hóa chất: acid tartaric, đệm phosphate, MeOH
- Pha động: Đệm phosphat 90%, MeOH 10%
- Detector: UV-VIS hoặc DAD; 𝝀 = 230nm
- Thể tớch bơm mẫu: 20 àl
- Cột tỏch: RP18 - C18 (250mm x 4,6mm x 5àm)
- Tốc độ dòng: 1ml/min
Để tiến hành chưng cất mẫu, cần khoảng 1 - 5 gam mẫu rắn hoặc 10 - 20 ml mẫu lỏng vào bình chứa của thiết bị lôi cuốn hơi nước Thêm 20 gam NaCl khan và 10 ml dung dịch acid tartaric 15% Quá trình chưng cất diễn ra trong 45 phút, với lưu lượng dịch cất thu được đạt 10 ml/phút Dịch cất sau đó được định mức, lọc qua màng lọc Whatman 0,45 nm và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD hoặc UV ở bước sóng 230 nm Việc định tính và định lượng dựa vào thời gian lưu và điện tích peaks.
Kết quả phân tích cho thấy phương pháp đạt độ thu hồi trên 90%, đáp ứng tiêu chuẩn của AOAC, đảm bảo độ chính xác theo quy định Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phương pháp này không phát hiện acid benzoic.
Thảo luận kết quả
2.3.1 Thiết bị và điều kiện phân tích
Cả 2 bài báo đều tiến hành nghiên cứu dựa trên nguyên tắc của phương pháp HPLC Tuy nhiên thì với phương pháp cũng như điều kiện tiến hành, quy trình thực hiên sử dụng thiết bị, hóa chất không giống nhau hoàn toàn nên ở mỗi bài nghiên cứu có phạm vi áp dụng không hoàn toàn giống nhau Ở bài nghiên cứu thứ hai có phạm vi áp dụng rộng cho nhiều loại thực phẩm (cá, thịt, đồ uống, sữa,
…) còn ở bài nghiên cứu thứ nhất thì có phạm vi áp dụng chủ yếu là sữa và các sản phẩm chế biến từ sữa
Về thiết bị: Cả hai bài nghiên cứu đều sử dụng thiết bị HPLC của hãng
Về điều kiện sắc ký:
Trong nghiên cứu nước ngoài, pha động được thực hiện với hai dung môi là nước và metanol, trong khi nghiên cứu trong nước sử dụng dung môi là đệm phosphat và metanol Điều này cho thấy hai nghiên cứu này có điều kiện pha động khác nhau, nhưng đều sử dụng metanol làm một trong các dung môi.
- Cột sắc ký của hai bài nghiên cứu đều dùng loại C18 và chỉ khác nhau về kích thước
Tốc độ dòng chạy trong bài nghiên cứu thứ nhất là 1,4 ml/min, nhanh hơn so với 1 ml/min của bài nghiên cứu thứ hai Tuy nhiên, thể tích bơm mẫu của bài nghiên cứu thứ hai (20 µl) lại lớn gấp đôi thể tích bơm mẫu của bài nghiên cứu thứ nhất (10 µl).
- Nhiệt độ chạy cột ở bài nghiên cứu thứ nhất (25°C) thấp hơn nhiệt độ chạy cột ở bài nghiên cứu thứ hai (30ºC)
- Cả hai bài đều sử dụng detector là UV-VIS với bước sóng 𝝀 = 230nm.
Cả hai nghiên cứu đều sử dụng thiết bị HPLC cùng hãng để xác định hàm lượng axit benzoic, nhưng có sự khác biệt về kích thước và các thông số kỹ thuật như tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu và điều kiện chạy pha động.
Nhóm tác giả Yerlikaya đã sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV-VIS để xác định hàm lượng axit benzoic trong các mẫu sữa tại Thổ Nhĩ Kỳ Kết quả phân tích cho thấy sự hiện diện của axit benzoic, mặc dù ở mức độ thấp, nhưng có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng trong thời gian dài.
Tác giả Phạm Thị Hồng đã xác định hàm lượng axit benzoic trong mẫu sữa tại Hải Dương thông qua phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện (LOD) là 1,07 ppm và giới hạn định lượng (LOQ) là 3,57 ppm Theo quy định của Bộ Y tế, hàm lượng tối đa cho phép của axit benzoic là 1 mg/kg Phân tích mẫu sữa cho thấy không phát hiện hàm lượng axit benzoic, chứng tỏ mẫu sữa đạt tiêu chuẩn và an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu sữa tại Việt Nam hầu như không có hoặc chỉ có rất ít axit benzoic, trong khi mẫu sữa từ Thổ Nhĩ Kỳ lại có sự xuất hiện của chất này Cả hai tác giả đều sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với hiệu quả tách tốt, nhưng độ nhạy của phương pháp của Yerlikaya cao hơn so với Phạm Thị Hồng Do đó, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV-VIS có thể được áp dụng để xác định hàm lượng axit benzoic trong mẫu sữa, đồng thời tham khảo chương trình chạy sắc ký của Yerlikaya để nâng cao hiệu quả.
